茶樹育種學(xué)第八章-分子育種課件

第八章：分子育種第一節(jié)：基因工程與育種一、基因工程的概念應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（通常是DNA）分離出來，在體外進行切割、拼接和重組，然后將重組的DNA導(dǎo)入某種宿主細胞或個體，從而改變他們的遺傳特性；有時還使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物，這種創(chuàng)造新生物并給予新生物以特殊功能的過程就是基因工程，也稱DNA重組技術(shù)。第八章：分子育種第一節(jié)：基因工程與育種1二、植物基因工程的方法和步驟（一）目的基因的分離和克隆1、基因芯片技術(shù)基因芯片是把生物活性大分子（如核酸和蛋白質(zhì)）或細胞等密集排列固定在固相載體（如硅片、玻片、聚丙烯或尼龍膜）上，所形成的微型檢測器?；蛐酒夹g(shù)就是利用特異性的分子間相互作用，如核酸雜交、抗原-抗體特異結(jié)合、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間特異結(jié)合等，將待測樣本標記后與生物芯片反應(yīng)，通過激光共聚瑩光掃描儀等檢測手段獲得信號，經(jīng)電腦系統(tǒng)處理、分析得到信號值，以次來檢測樣本的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。因此，可利用基因芯片技術(shù)從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的基因。二、植物基因工程的方法和步驟22、基因文庫技術(shù)基因文庫是指匯集和克隆了某一基因組所有DNA序列的DNA群體2、基因文庫技術(shù)3（二）目的基因的轉(zhuǎn)化1、基因的轉(zhuǎn)化的作用⑴創(chuàng)造新品種。⑵研究基因表達或用于基因作圖和基因克隆。2、基因的轉(zhuǎn)化的條件⑴有適宜的目的基因。⑵有適當?shù)慕M織培養(yǎng)系統(tǒng)。能脫分化和再分化．⑶有適當?shù)霓D(zhuǎn)化途徑和方法。要求損失小，頻率高，且外源基因能穩(wěn)定地整合到基因組，并且具有正常的時空表達能力．（二）目的基因的轉(zhuǎn)化43、目前植物基因轉(zhuǎn)化的方法⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法。①原理。在自然條件下，農(nóng)桿菌通過傷口侵染植物，并廣泛寄生于雙子葉植物中。農(nóng)桿菌中存在一種與腫瘤誘導(dǎo)有關(guān)的質(zhì)粒，即Ti質(zhì)粒。該質(zhì)粒能夠把本身的一段DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞，整合進植物基因組得以表達，并能夠通過減數(shù)分裂傳遞給后代?？赊D(zhuǎn)移的DNA片段稱為T-DNA。T-DNA的轉(zhuǎn)移與邊界序列有關(guān)，而與T-DNA區(qū)段的其他基因或序列無關(guān)，因而，可將T-DNA區(qū)段上的無關(guān)序列去掉，插入外源目的基因，當農(nóng)桿菌3、目前植物基因轉(zhuǎn)化的方法5侵染植物時，將目的基因轉(zhuǎn)移到植物中去。②轉(zhuǎn)化過程：受體系統(tǒng)的建立→Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建→目的基因的轉(zhuǎn)化。③轉(zhuǎn)化方法：整體植株接種共感染法；葉盤轉(zhuǎn)化法；原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法。⑵化學(xué)和物理誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化①聚乙二醇（PEG）法。（原生質(zhì)融合）②脂質(zhì)體法。用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。侵染植物時，將目的基因轉(zhuǎn)移到植物中去。6③電擊法。④超聲波法。⑤顯微注射法。⑥激光微束法。⑦基因槍法。⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化也稱生物媒體轉(zhuǎn)化，即通過植物的生殖系統(tǒng)的細胞以及細胞結(jié)構(gòu)將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主植物中去。③電擊法。7①花粉管通道法。②生殖細胞浸泡法。③胚囊、子房注射法。4、基因轉(zhuǎn)化方法的評價⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化頻率高，周期短，可以轉(zhuǎn)移大片段DNA而被廣泛使用。但其受體植物只是雙子葉植物。⑵化學(xué)和物理誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化法不受宿主植物的限制，應(yīng)用廣泛，但成本較高，轉(zhuǎn)化頻率也不如農(nóng)桿菌高。①花粉管通道法。8⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法簡單易行，但成功率低。（三）轉(zhuǎn)基因植株的鑒定１、轉(zhuǎn)化植株的再生．目的基因的直接受體一般是細胞或組織，在鑒定目的基因被導(dǎo)入與否，先要誘導(dǎo)這些細胞或組織再分化，形成轉(zhuǎn)化植株．２、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定⑴分子生物學(xué)鑒定．主要是通過分子雜交來鑒定，包括southern雜交、northern雜交、western雜交．⑵性狀鑒定．即外源基因在宿主植物表達的鑒定⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法簡單易行，但成功率低。9，如果是無性繁殖，外源基因表達要在下一代穩(wěn)定表現(xiàn)，如果是有性繁殖，外源基因表達則要在后代穩(wěn)定表現(xiàn)．三、基因工程的安全性評價（一）安全性評價的意義生物安全性評價就是要對生物技術(shù)（主要是基因工程）活動本身及其產(chǎn)品，可能對人類和環(huán)境的不利影響及其不確定性和風(fēng)險性進行科學(xué)評估，并采取必要措施加以管理和控制，以保障人類健康和環(huán)境安全．，如果是無性繁殖，外源基因表達要在下一代穩(wěn)定表現(xiàn)，如果是有性10（二）轉(zhuǎn)基因植物安全性評價２００２年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》，將農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工活動對轉(zhuǎn)基因生物安全等級的影響分為三種類型（即：增加轉(zhuǎn)基因生物的安全性；不影響轉(zhuǎn)基因生物的安全性；降低轉(zhuǎn)基因生物的安全性。），并根據(jù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和產(chǎn)品生產(chǎn)、加工活動對其安全等級的影響類型和影響程度，將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分為四個安全等級．（二）轉(zhuǎn)基因植物安全性評價11（三）轉(zhuǎn)基因植物各階段安全性評價申報要求轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)分為五個階段，即：立項→中間試驗→環(huán)境釋放→生產(chǎn)試驗→安全證書申報．在各個階段都要進行安全性評價申報，通過安全性評價后才能進行下一階段的試驗或生產(chǎn)．每次申報都要提交相關(guān)材料，如在立項階段必須提交：實驗研究報告書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全等級的依據(jù)；相應(yīng)的實驗室安全設(shè)施、安全管理和防范措施。在申報安全證書之前，必（三）轉(zhuǎn)基因植物各階段安全性評價申報要求12須提交：安全評價申報書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全等級的依據(jù)；農(nóng)業(yè)部委托的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)檢測機構(gòu)出具的檢測報告；中間試驗、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗階段的試驗總結(jié)報告；其他有關(guān)材料。須提交：安全評價申報書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全13第二節(jié)：分子標記與育種一、常用分子標記的原理和方法（一）分子標記的概念１、遺傳標記。是指基因型特殊的易識別的表現(xiàn)形式。包括形態(tài)標記；細胞標記；生化標記和分子標記。形態(tài)標記簡單直觀，但數(shù)量少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影響；細胞標記和生化標記經(jīng)濟方便，但標記數(shù)有限。2、分子標記。是指基于DNA水平多態(tài)性的遺傳標記，它通過檢測基因組的一批識別位點來估測基因組變異性和多樣性。3、分子標記的特點第二節(jié)：分子標記與育種一、常用分子標記的原理和方法14⑴是在DNA水平上對遺傳變異的直接反映，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，也不受基因表達與否的限制。⑵多態(tài)性高。⑶大多數(shù)分子標記是共顯性的，使對隱性性狀的選擇成為可能，鑒別出純合基因型與雜合基因型。目前用于輔助育種的分子標記主要有限制性片段長度多態(tài)性（RＦLP）；隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD)；擴增片段多態(tài)性（AFLP)和簡單重復(fù)序列（SSR).⑴是在DNA水平上對遺傳變異的直接反映，不受季節(jié)和環(huán)境的影響15(二）ＲFLP標記限制性片段長度多態(tài)性（RＦLP）是用各種限制性酶將DNA分子剪切成不同大小的片段。由于突變、重組等原因，不同種屬、甚至同一品種的不同個體，對同一內(nèi)切酶來說，切位點和切位點之間的DNA序列都有可能不同，當用限制性內(nèi)切酶處理不同生物體的DNA時，就會產(chǎn)生不同長度DNA片段，這就是RFLP。RFLP標記先用限制性內(nèi)切酶酶解目標DNA，用電泳的方法將DNA片段分開，再通過southern印跡分析各片段的核苷酸序列及其差別．進而為生物進化、親緣關(guān)系以及遺傳育種提供依據(jù)．(二）ＲFLP標記16（二）RAPD標記隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD）是建立在DNA序列體外酶促擴增的多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）的基礎(chǔ)上的RAPD標記，其基本原理是采用人工合成的較短的隨機排列堿基順序核酸單鏈為引物，在一種熱穩(wěn)定DNA多聚酶作用下，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，獲得一組不連續(xù)的DNA片段。其中每個擴增所產(chǎn)生的片段代表了基因組上的一個位點，所檢測出來的擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。（二）RAPD標記17RAPD標記具有操作簡單、引物無物種限制、多態(tài)性豐富、可采取自動化操作，提高工作效率等特點而被廣泛運用。RAPD標記在育種中用于重要性狀的分子標記；圖譜繪制、雜種純度鑒定等。在茶樹育種方面，有人運用RAPD標記進行親子關(guān)系鑒定；茶樹遺傳多樣性分析；無性系突變體鑒定等。RAPD標記具有操作簡單、引物無物種限制、多態(tài)性豐富、可采取18（三）AFLP標記AFLP標記是用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，然后對限制性片段進行選擇性擴增，從而揭示DNA多態(tài)性。該技術(shù)的特點是信息量大，一次反應(yīng)可檢測到上百個位點，而且得到的譜帶的大多數(shù)片段與基因組的單一位置相對應(yīng)，故可用于遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建，此外，還可用于增加染色體特定區(qū)域的飽和性分析；回交群體遺傳背景分析；種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等等。（三）AFLP標記19（四）SSR標記(simplesequencerepeats)SSR標記是利用真核生物的基因組中普遍存在1~6個bp簡單串聯(lián)重復(fù)特性作為分子標記，生物個體不同，簡單串聯(lián)重復(fù)的核酸序列也不同，從而構(gòu)成生物多樣性．由于每個簡單重復(fù)序列兩端的堿基組成基本是相同的，因而可根據(jù)兩端的序列設(shè)計一對特異引物，擴增每個位點的簡單重復(fù)（微衛(wèi)星）序列，進而分析生物多樣性．SSR標記廣泛用于連鎖圖譜的構(gòu)建和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究．（四）SSR標記(simplesequencerepea20二、分子標記在育種中的應(yīng)用（一）構(gòu)建遺傳圖譜。建立高密度分子遺傳圖譜，定位與目標性狀緊密連鎖的分子標記，有助于在茶樹生育早期對群體中含有目標基因植株進行選擇，從而大大提高育種效率，縮短育種周期．（二）分析親緣關(guān)系．借助分子遺傳圖譜可為品種資源和鑒定和保存，研究植物的起源與進化，遠緣雜交親本的選配，預(yù)測雜種優(yōu)勢等提供理論依據(jù)．二、分子標記在育種中的應(yīng)用21（三）分子標記輔助選擇．１．在親本選擇上，傳統(tǒng)的選擇是基于田間表現(xiàn)型的選擇，而不是對基因型的選擇，但表型是基因型與環(huán)境互相作用的結(jié)果，許多性狀與基因間并非一對一的線性關(guān)系．因此，依表型來推測基因型并不總是可靠的或是比較困難的，不僅需要豐富的實踐經(jīng)驗，而且還受到許多外在條件的限制，而分子標記輔助選擇則可以避免這些限制．２．可以在細胞水平和植株早期發(fā)育階段進行鑒定，找到含有目標基因或不良性狀基因的植株，早期鑒定，早期分離，早期培育，縮短育種周期．（三）分子標記輔助選擇．１．在親本選擇上，傳統(tǒng)的選擇是基于田22思考題：１、將外源基因轉(zhuǎn)化到植物中去的必要條件是什么？２、進行基因轉(zhuǎn)化的途徑有哪些？它們各有何特點？３、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些？４、什么是遺傳標記？遺傳標記包括哪些不同層次的標記方法？它們各有何特點？５、如果你已獲得能抗某一主要害蟲的基因，如何將該基因轉(zhuǎn)化到茶樹體內(nèi)？試述主要步驟和方法？思考題：23６、分子標記在茶樹育種中的應(yīng)用有哪些？７、分子標記輔助選擇在茶樹早期鑒定中有何重要意義？８、常用的分子標記技術(shù)有哪些？各有哪些特點？６、分子標記在茶樹育種中的應(yīng)用有哪些？24單倍體育種的優(yōu)越性1.控制雜種分離,縮短育種周期常規(guī)雜交育種,自花授粉植物從選擇親本開始,經(jīng)雜交、分離、選擇、穩(wěn)定品質(zhì)4~6代,加之品比、生產(chǎn)試驗、區(qū)域試驗需8~10年時間;異花授粉植物的育種周期更長,僅穩(wěn)定品系就要6~7代自交.而對一些異花授粉的樹木而言,這個過程更長,例如茶樹至少要20年以上,正因為如此,很少有人用常規(guī)雜交育種的辦法要選育有性茶樹品種.如果采用單倍體育種,則能夠在較短時間(3~5年)獲得純系,而選育有性茶樹品種打下基礎(chǔ).從而縮短育種周期,雜交有性品種的可能性.單倍體育種的優(yōu)越性1.控制雜種分離,縮短育種周期25茶樹育種學(xué)第八章--分子育種課件262.排出顯、隱性基因干擾,提高選擇效率常規(guī)育種單倍體育種親本基因型AAbb×aaBBAAbb×aaBBF1配子基因型AaBbAaBbF2配子基因型2.排出顯、隱性基因干擾,提高選擇效率272.單倍體是研究遺傳變異的好材料,這點對茶樹育種至關(guān)重要.由于茶樹是多年生異花授粉植物,要搞清楚其遺傳變異難度很大,這也制約了茶樹育種技術(shù)和手段的發(fā)展.如雜交育種,轉(zhuǎn)基因,抗性育種,品質(zhì)育種等等.3.單倍體是誘變育種的好材料,因基因相對純合.單倍體植株經(jīng)誘變后,所以突變范圍的高化發(fā)送都能在當代表現(xiàn)出來,而其它倍數(shù)體植株在誘變處理后,某些突變隱性基因所控制的性狀變化則不能在當代表現(xiàn)出來,增加選擇難度.2.單倍體是研究遺傳變異的好材料,這點對茶樹育種至關(guān)重要.由284.克服遠緣雜交不孕或不結(jié)實.主要原因是遺傳差異大,染色體難以配對,利用單倍體對栽培品種進行提純復(fù)狀,對基因型混雜的品種,經(jīng)單倍體加倍成純合二倍體,再選擇具有原品種優(yōu)良特性特征的植物大量繁殖推廣,達到提純復(fù)狀的目的.對茶樹育種而言:一是縮短育種周期,二是便于資源現(xiàn)場研究,為育種打下基礎(chǔ).4.克服遠緣雜交不孕或不結(jié)實.主要原因是遺傳差異大,染色體難29第二節(jié)單倍體育種一、植物單倍體的概念植物在減數(shù)分裂時形成雄、雌配了,其染色體數(shù)目為體細胞的一半,將這種具有單套染色體的細胞稱為單倍體細胞.單倍體細胞在人工離體條件下培養(yǎng),使其單性發(fā)育成植物體,這種具有單套染色體的植物稱為單倍體植物.第二節(jié)單倍體育種一、植物單倍體的概念30二、單倍體育種的概念:將具有單套染色體的單倍體植物,經(jīng)人工染色體加倍,使其成為純合二倍體.從中選育出符合人們需要的個體,直接繁育成新品種,或選出具有單一優(yōu)良性狀的個體,作為雜交育種的原始材料,稱為單倍體育種.二、單倍體育種的概念:31花藥培養(yǎng)的概念花藥培養(yǎng)就是以植物花藥為材料,通過組織培養(yǎng)形成愈傷組織,再經(jīng)過誘異分體形成完整植株的過程.由于花藥培養(yǎng)的主要目的是獲得單倍體植株.因此,人們也把花藥培養(yǎng)稱為單倍體植株培養(yǎng).花藥培養(yǎng)的概念32單倍體育種的優(yōu)越性(見第一節(jié)內(nèi)容)單倍體育種的優(yōu)越性(見第一節(jié)內(nèi)容)33非均等分裂五、花粉單性發(fā)育的生物學(xué)原理及離體培養(yǎng)條件下小孢子發(fā)育成植物體的途徑單核小孢子營養(yǎng)核生殖核營養(yǎng)細胞生殖細胞愈傷組織多細胞花粉粒單倍體植株胚狀體非均等分裂五、花粉單性發(fā)育的生物學(xué)原理及離體培養(yǎng)條件下小孢子34六、單倍體植物的培養(yǎng)程序及關(guān)鍵技術(shù)①順利通過消毒滅菌關(guān)②花粉發(fā)育時期的鑒定和選擇用于研究遺傳的可選用一些具有典型發(fā)送的品種,用于培養(yǎng)新品種則選擇結(jié)合性較好的品種的花藥.選擇花藥發(fā)育的單核花粉后期.③確定是否低溫處理和糖處理材料準備六、單倍體植物的培養(yǎng)程序及關(guān)鍵技術(shù)35①基本培養(yǎng)篩選選用SJ—1和N6培養(yǎng)基(見P163)②植物激素種類和濃度篩選③糖濃度(滲透壓)篩選接種→脫分化→愈傷組織→再分化→化苗誘導(dǎo)花粉脫分化分裂①基本培養(yǎng)篩選選用S36①花粉愈傷組織分化,植株再生(激素種類及濃度調(diào)節(jié))取形成愈傷組織60天以上,直徑在2~3mm左右且為第一代愈傷組織作再分化材料②胚狀體壯苗培養(yǎng):a.調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基b.降低激素和滲透壓用N6培養(yǎng)基(見P165)分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)①花粉愈傷組織分化,植株再37①調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基,無機鹽濃度下降②調(diào)節(jié)激素濃度和種類③調(diào)節(jié)糖濃度(滲透壓)關(guān)鍵是生長素與細胞激素之比,適中則脫分化,比值高則有利于長根,比值低則有利于長芽完成植物體形成①調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基,無機38①試管菌馴化,滲透壓變化和光照強度變化②移植營養(yǎng)土配制③保持高空氣濕度(80~90%,1~2周)和低土地濕度.④用5%可濕性多菌消毒馴化與移載①試管菌馴化,39①形態(tài)鑒定②細胞學(xué)鑒定③交配鑒定④分子標記鑒定花粉植株鑒定①形態(tài)鑒401.形態(tài)鑒定:①外形:植株瘦小,葉片窄小,花小柱頭長.②結(jié)實性:開花,不結(jié)實.③花粉粒著色和大小,花粉粒敗育,不著色2.細胞學(xué)鑒定.取根尖細胞鏡檢染色體數(shù)目1.形態(tài)鑒定:414.分子標記鑒定:①同功酶,分析比較處理前后再生后植株的同功酶.②限制性片段長度多肽性(RFLT技術(shù)),時間長,費用高.③隨機擴增多肽性(RAPD).運用單個或多個隨機引物(長度為10個或多重百個核苷酸)經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng),酶促擴增特異性DNA片段.從而得到多態(tài)性圖譜.RAPD與PFLT比較,具操作簡便,速度快,成本低,檢出率高的優(yōu)點.4.分子標記鑒定:42七、單倍體植物的染色體加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:①小菌浸泡法.將再生小植株從試管移出,在無菌條件下用秋水仙素溶液浸泡,再轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基去培養(yǎng).②處理生長錐,醮滿秋水仙素溶液的棉球置于頂芽或腋芽③培養(yǎng)基加倍,在培養(yǎng)基加入一定濃度的秋水仙素.七、單倍體植物的染色體加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:43八、茶樹花藥培養(yǎng)及展望存在的問題1.誘導(dǎo)效率低2.體細胞(花藥、藥壁、藥隔)干擾問題3.目前培養(yǎng)基成分帶有一定睛的育成性八、茶樹花藥培養(yǎng)及展望存在的問題1.誘導(dǎo)效率低44第三節(jié)體細胞雜交一、體細胞雜交的原理及定義體細胞雜交也稱細胞融合.實質(zhì)是兩團來自不同親本的原生質(zhì)體的融合.原生質(zhì)體是除去細胞壁的裸露細胞-------原生質(zhì)體的概念.原理:已知植物細胞壁上,具有粘性很強的核酸酶.核酸酶可阻止外源DNA進入植物細胞,除去細胞壁后,可避免核酸酶對異體DNA的破壞.從而使胞質(zhì)融合和轉(zhuǎn)基因成為可能.第三節(jié)體細胞雜交一、體細胞雜交的原理及定義45長期以來的有性雜交方法所進行的遺傳物質(zhì)交換(基因重組)有如下局限性:1.同源性(自交不親合)和異源性(雜交不親合)限制了有性結(jié)合范圍.2.由于配子形成是減數(shù)分裂的先導(dǎo).而在減數(shù)分裂時,由于染色體的易位,例位、重復(fù)、缺失行為而引起染色體數(shù)目減少或增加.因為雜交后代不可能具有完整的遺傳信息.而原生質(zhì)體是研究遺傳理論的好材料.如核質(zhì)關(guān)子,雜交或自交不親合性的機理以及激素作用機理等.長期以來的有性雜交方法所進行的遺傳物質(zhì)交換(基因重組)有如下463.大多數(shù)高等植物,重組只限于染色體基因(核基因),而雄配子體細胞胞質(zhì)基因不可能遺傳給下一代.而體細胞雜交能克服上述局限.如擴大“雜交”范圍,創(chuàng)造植物新物種和新品種,如固N作用,高光數(shù),抗病蟲等.有利于遺傳研究.1.克服不親合性,擴大“雜交”范圍,創(chuàng)造新品種2.有利于研究細胞質(zhì)遺傳3.大多數(shù)高等植物,重組只限于染色體基因(核基因),而雄配子47二、體細胞交雜的程序①雙親原生質(zhì)體制備②酶法分離原生質(zhì)體.纖維素酶,果膠酶③影響原生質(zhì)體活力的各種植物原生質(zhì)體分離二、體細胞交雜的程序48①采用界面法純化原生質(zhì)體②篩網(wǎng)過濾③質(zhì)膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑雙親原生質(zhì)體混合液制備:雙親原生質(zhì)體以等體積,等密度(104~105個細胞/ml)混合,制備成混合親本原生質(zhì)體.原生質(zhì)體純化①采用界面法純49①融合法②高鈣和高PH值法③聚乙二醇法④聚乙二醇和高鈣,高PH值結(jié)合法.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體50

①互補選擇法:白化互補,遺傳互補,營養(yǎng)互補.局限性大②可見標志選擇法:凹穴培養(yǎng)皿法,微吸管法.直觀而多使用.細胞雜種的選擇細胞雜種51①基本培養(yǎng)基篩選②激素種類和濃度調(diào)節(jié)③滲透壓調(diào)節(jié)愈傷組織形成,器官分化,植株再生愈傷組織形成,52①與親代形態(tài)特征比較②雜種植物核型分析③同工酶譜分析雜種植株鑒定雜種植株53影響原生質(zhì)體活力的因素:①細胞壁降解酶的種類及組合②滲透壓穩(wěn)定劑,即在分離前使用的高滲糖液(如甘露醇)使質(zhì)壁微離且胞質(zhì)成團③質(zhì)膜穩(wěn)定劑如0.2~0.3%,葡聚糖硫酸鉀能降低酶液中的核酸酶活力,保護原生質(zhì)膜;0.1mmol/LCaCl2(氯化鈣)中的鈣離子能穩(wěn)定原生質(zhì)膜并有利于細胞分裂.④PH值影響原生質(zhì)體活力的因素:54⑤溫度因子⑥植物材料的生理狀態(tài),如株齡、發(fā)育狀態(tài)、栽培條件(營養(yǎng)、光照、溫度25~26℃等)對取材影響很大,需累積實踐經(jīng)驗⑤溫度因子55原生質(zhì)體融合法:①鹽類融合法:硝酸鹽類:NaNO3,Ca(NO3)2等.氯化物類:NaClCaCl2BaCl2,葡聚糖硫酸鹽類.優(yōu)點為:對原生質(zhì)體活力影響較小,但融合成功率低②高鈣和高PH值融合:Ca2+濃度在0.05mol/L左右.PH值在9.5~10.5之間.③聚乙二醇融合法(PEG法),PEG處理40~50min,再用培養(yǎng)液稀釋并逐步洗去PEG④聚乙二醇與高Ca2+,高PH值結(jié)合法原生質(zhì)體融合法:①鹽類融合法:硝酸鹽類:NaNO3,Ca(N56步驟:先用PEG處理30min,再用高鈣和高PH值液稀釋PEG,最后用培養(yǎng)液洗去高Ca2+和高PH值.PEG是相鄰原生質(zhì)體表面間的分子橋,當PEG分子被高Ca2+,高PH值洗掉是,可能引起原生質(zhì)體表面電荷的紊亂和再分布,從而促進融合.步驟:先用PEG處理30min,再用高鈣和高PH值液稀釋PE57它是指在某一光強度時,光合作用中所吸收的CO2與呼吸作用所釋放的CO2達到動態(tài)平衡,這時光照強度稱為光補償點.現(xiàn)在空間中CO2濃度約為330mm.作物群體內(nèi)部及附近則更低,遠不能滿足作物光合作用的需要.故CO2補償點低的作物一般光合效率較強.而光飽和點和光補償點則反映植物化的一些特征和環(huán)境的適應(yīng)能力.一般而言,光飽和點較高的植物,其光合效率較高.它是指在某一光強度時,光合作用中所吸收的CO2與呼吸作用所釋58茶樹是C3植物,其CO2補償點較C4植物要高,但個體之間有差別,茶樹是耐蔭植物,光飽和點較低(42000~55000米燭光),光補償點較低(300~500米燭光).茶樹是偏蔭性植物,光補償點和飽和點前比較低.因此,在生產(chǎn)實踐中,可通過選擇哪些葉色深,葉肉厚,葉綠素含量高,分枝角度小,葉片較直立.CO2補償點較低,光飽和點較高,光呼吸較弱的個體,來提高其光合能力和受光,協(xié)調(diào)葉面積和受光時間,降低呼吸消耗,提高生物產(chǎn)量.茶樹是C3植物,其CO2補償點較C4植物要高,但個體之間有差59三、茶樹高光效育種的方法1.株型選擇法①依據(jù),不同的植株的株型結(jié)構(gòu),具有不同的最佳葉面指數(shù)及受光能率,從而能提高受光面積和受光時間,達到提高光合效率.②內(nèi)容指標.A.分枝結(jié)構(gòu)的選擇,選擇那些分枝角度較小(一般小于45度),層次分明且分枝均勻的樹型.

三、茶樹高光效育種的方法1.株型選擇法60B.葉的選擇.選擇那些顏色深綠,葉較直立(夾角不于45度,最好在30度以內(nèi)),葉肉厚,比葉重大.比葉重(SLW)=總?cè)~重mg/cm2總?cè)~面積中國茶科所等人測試了7個品種的比葉重差異在12.63~19.84毫克CO2/分米2/n有效光合強度與比葉重呈強正相關(guān).相關(guān)系數(shù)為0.88.B.葉的選擇.選擇那些顏色深綠,葉較直立(夾角不于45度,最61則可緩解這種制約關(guān)系.此外,較直立的葉片受強度直射時間短,而受弱光直射時間較長,而式中葉的光合能力受到葉片構(gòu)造及其生化成分的影響.比如葉色深綠,葉肉厚,葉綠素a/b值高,葉片維管束鞘細胞發(fā)達,這樣葉片結(jié)構(gòu)的植物光合能力強,而通過PEP(磷酸烯醇丙酮酸)羥化酶來固定CO2的植物比通過RUDP(二磷酸核酮糖)羧化酶來固定CO2的植物的光合能力要強(前者叫做C4植物,后者叫做C3植物)則可緩解這種制約關(guān)系.此外,較直立的葉片受強度直射時間短,而62而植物的呼吸消耗又包括暗呼吸和光呼吸兩種方式.前者是無光條件下植物的呼吸作用,而后者則是在有光條件下的植物呼吸作用.一般而言,呼吸作用是植物生命活動一部分,它不僅給植物生長發(fā)育提供能量(ATP),而且還給植物的生物合成提供能量,是植物生成代謝中必不可必的過程.但是暗呼吸和光呼吸是不同的前者是碳水化合物(糖類及淀粉)作為氫化底物,在呼吸過程中形成ATP(三磷酸腺苷).而植物的呼吸消耗又包括暗呼吸和光呼吸兩種方式.前者是無光條件63而后者呼吸氫化底物是光合作用中的中間產(chǎn)物乙醇酸.且氯化過程不形成或很少形成ATP.所以它是一個消耗能量的過程,但光呼吸是在環(huán)境中低CO2和高O2以及強光情況下,對葉綠體的光合作用中心有保護作用.所以,從一定意義上來說,暗呼吸是必需的,而光呼吸則植物為適應(yīng)環(huán)境條件的自我調(diào)節(jié).而且人們還發(fā)現(xiàn),一些C4植物的光呼吸非常弱.幾乎只進行暗呼吸,而C3植物的光呼吸則比較強,所以C4植物的光合效率比C3植物強.而后者呼吸氫化底物是光合作用中的中間產(chǎn)物乙醇酸.且氯化過程不64除了光呼吸強度以外,還有兩個指標也反映了植物的光合能力.一個是CO2補償點,另一個是光飽和點.前者是在光下,植物光合作用中所吸收的CO2量與呼吸作用中所釋放的CO2量達到動態(tài)平衡時,環(huán)境中CO2的濃度.光飽和點是指植物的光合強度隨光照強度的增加而增加.當光照增加到某個數(shù)值(點位)時,光合強度不再隨光照強度的增加而增加.這個光照強度數(shù)值(點位)就稱為該種植物的光飽和點.對應(yīng)地,也有光補償點.除了光呼吸強度以外,還有兩個指標也反映了植物的光合能力.一個65第四節(jié)茶樹高光效育種一、茶樹高光效育種的基本概念茶樹高光效育種就是根據(jù)茶樹某此生理生化及形態(tài)指標,來選擇光合作用效率高,特別是凈光合率高的茶樹個體,進而培育成茶樹新品種的過程.第四節(jié)茶樹高光效育種一、茶樹高光效育種的基本概念66二、茶樹高光效育種的意義和基本原理1.意義:茶葉最高單產(chǎn)可能達到多少?若以茶樹對光能的利用率來推算.印度學(xué)者推算當?shù)氐牟枞~生物產(chǎn)量可達到12,000~16,000斤/畝.經(jīng)濟產(chǎn)量2666斤/畝~3333斤/畝(經(jīng)濟子數(shù)21%左右).東非茶葉研究所(肯尼亞)的研究人員則推算,當?shù)赝耆采w的茶園,生物產(chǎn)量可達到32000斤/畝.經(jīng)濟產(chǎn)量達到3200斤/畝.(經(jīng)濟子數(shù)10%).二、茶樹高光效育種的意義和基本原理1.意義:67我國學(xué)者以長沙地區(qū)為例.推算我國茶葉生物產(chǎn)量可達6930.23公斤/畝.經(jīng)濟產(chǎn)量可達1455.35公斤/畝≈2900斤/畝.實際上,地處炎陵縣的湖南?江茶場.最高產(chǎn)量為1072斤/畝.只有理論產(chǎn)量的37.08%.即使我國有最高單產(chǎn)記錄廣東英德紅星茶場9.25畝平均601公斤/畝.其中一畝達705公斤/畝.也只有理論產(chǎn)量的48.44%.所以說,茶葉增產(chǎn)的潛力還很大.那么如何進一步提高茶葉產(chǎn)量呢?我國學(xué)者以長沙地區(qū)為例.推算我國茶葉生物產(chǎn)量可達6930.268一些學(xué)者認為.最好有效的方法是通過茶樹高光效育種來提高整體茶樹的光合效率,進而提高生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量.因為目前作用的光能同化率很低.光能同化率指單位面積的太陽輻射能被轉(zhuǎn)化為化學(xué)能之比.多數(shù)在1%~2%之間.有些尚不到1%,而研究表明,作物的光能利用率,最大的理論值可10%~20%.實際上,我國平均茶葉產(chǎn)量在50公斤/畝左右.其光能利用率僅為0.25%.而畝產(chǎn)1000斤的茶園,其光有利用率也只有2.5%.如果將光能利用率提高到5%,并按20%的經(jīng)濟系數(shù)推算,茶園產(chǎn)量可達947kg/畝.可見,通過提高茶樹光能利用率來提高茶葉產(chǎn)量的潛力還是很大的.一些學(xué)者認為.最好有效的方法是通過茶樹高光效育種來提高整體茶692.基本原理要了解高光效育種的基本原理.首先必靦了解植物的光合作用.光合作用就是綠色植物在陽光照耀下,由細胞內(nèi)的葉綠體吸收太陽光能,經(jīng)過一整套物理,化學(xué)反應(yīng)“工序”.把從環(huán)境中吸收來二氧化碳與水合成有機物質(zhì),貯藏能量并放出氧氣的全過程.可用下列化學(xué)方程式來概說地表示:CO2+H2O→(CH2O)+O22.基本原理要了解高光效育種的基本原理.首先必靦了解植物的光70因此,光合作用不僅受到CO2,H2O,光等環(huán)境影響,而且還受到綠色植物本身的影響,不同的結(jié)構(gòu),其光能利用效率不同.植物的光能利用效率可用植物的生物產(chǎn)量來表示,而植物的生物產(chǎn)量又由光合產(chǎn)物總量和呼吸消耗總量兩個變量構(gòu)成.即生物產(chǎn)量=光合產(chǎn)物總量-呼吸消耗總量而光合產(chǎn)物量=葉面積×葉的光合能力×葉的受光效率×光合時間式中,葉面積與葉的受光效率之間有相互制約的關(guān)系.因此,光合作用不僅受到CO2,H2O,光等環(huán)境影響,而且還受71一般而言,葉面積少,葉的受光效率高,反之亦然.但如果葉片比較直立,樹冠分枝比較小.2.光呼吸篩選法①依據(jù).CO2補償點低的植株,其光呼吸也比較低,呼吸消耗較少,同時光合效能比較高.②方法.將不同選擇材料的植株,與一些C4植物的植株一同栽在一個照光的密閉系統(tǒng)內(nèi)(如塑料膜棚或玻璃房)內(nèi),使系統(tǒng)內(nèi)的CO2濃度降低到一濃度,觀察各植株反應(yīng),從而篩選出那些CO2補償點較低的植株,進而培育成高光效新品種.一般而言,葉面積少,葉的受光效率高,反之亦然.但如果葉片比較723.基因改造在光合作用中，低光效的植物中二磷酸核酮糖羧化酶（ＲＵＢＩＳＣＯ）固定（ＰＥＰ）羧化酶固定ＣＯ2，在現(xiàn)代遺傳工程中，有人試圖將控制磷酸烯醇丙酮酸的基因?qū)胍恍?植物．從而形成高光效品種．也有人將不同來源的ＲＯＤＰ（二磷代？酮糖羧化酶）的基因?qū)胪恢参?，形成異源亞基的ＲＵＤＰ基因（基因雜交）．或采用定點突變基因技術(shù)來誘導(dǎo)ＲＵＤＰ基因變異等辦法來提高植物對ＣＯ2的固定效率，從而提高植物的光合效能．3.基因改造73第五節(jié)植物的遺傳轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)基因植物的形成）一.植物基因轉(zhuǎn)化的受體作為轉(zhuǎn)基因的受體植物，必須滿足2個條件：①能夠接外源基因，并通過基因重組或其它途徑使外源基因穩(wěn)定地插入植物染色體中．②必須有脫分化和再生能力，能夠形成新的植物體．第五節(jié)植物的遺傳轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)基因植物的形成）一.植物基因轉(zhuǎn)化的74而植物轉(zhuǎn)基因的受體通常是原生質(zhì)體，懸浮細胞，胚性愈傷組織，胚狀本，葉園片（葉盤）．即新鮮無菌幼嫩葉片，打片3～５ｍｍ的葉圓片．此外，還有其它受體．如子葉，胚軸，莖段，根，體細胞胚，花粉等．而植物轉(zhuǎn)基因的受體通常是原生質(zhì)體，懸浮細胞，胚性愈傷組織，胚75二.植物基因轉(zhuǎn)化常用酶1.核酸酶．是一類似核酸為底物的水解酶，特別是一類能夠識別和切割雙鏈ＤＮＡ分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶－－限制性核酸內(nèi)切酶2.連接酶用于兩段核酸拼接起來的酶3.聚合酶催化核酸體外合成反應(yīng)的酶，包括ＤＮＡ聚合酶和ＲＮＡ聚合酶．二.植物基因轉(zhuǎn)化常用酶1.核酸酶．是一類似核酸為底物的水解酶76三.植物基因轉(zhuǎn)化的基本過程①從生物基因組群體中分享的基因－－從現(xiàn)有生物（特別是原核生物）分離出的基因②人工合成的基因ＤＮＡ片段－－將現(xiàn)有的ＤＮＡ片段通過化學(xué)或連接酶關(guān)系合成新的ＤＮＡ段．③ＰＣＲ反應(yīng)合成ＤＮＡ④ｍＲＮＡ差異顯示法獲得目的基因目的基因的分離或制備三.植物基因轉(zhuǎn)化的基本過程①從生物基因組群體中分77①質(zhì)粒－－是一種能在細菌，放射菌和酵母細胞內(nèi)寄生并獨立于染色體外進行自我復(fù)制共價閉合環(huán)狀ＤＮＡ（CCCDNA）,可用人工改造或天然質(zhì)粒作為載體．②噬菌體－－常用的噬菌體有Ｍu噬菌體載體③粘粒－－是由質(zhì)粒和Ｍu噬菌體的Ｃ05

位點u成膜等Ｍu構(gòu)建而成的一種大容量克隆載體④病毒基因轉(zhuǎn)化的載體及其選擇①質(zhì)粒－－是一種能在細菌，放射菌和酵基因轉(zhuǎn)化78①粘性末端的連接－－用同一種限制性內(nèi)切酶或者用能夠產(chǎn)生相同粘性末端的兩種限制性內(nèi)切酶分別消化外源ＤＮＡ分子和載體，所形成的ＤＮＡ末端彼此互補，用ＤＮＡ連接酶共價連接起來，形成重組分子②平末端的連接，對于平末端ＤＮＡ片段，可用末端脫氧核芽酸轉(zhuǎn)化酶催化，以相應(yīng)的脫氧核苷酸三磷酸為底物，在帶平頭末端的ＤＮＡ片段的3’-末端加上多聚核苷酸的尾巴．若載體加上多聚Ａ的尾巴，則可以和改造后的平末端ＤＮＡ連接起來．ＤＮＡ片段和載體的連接①粘性末端的連接－－用同一種限制性內(nèi)切ＤＮＡ79①基因槍導(dǎo)入法，利用超聲波使包裹ＤＮＡ溶液的重金屬彈（鎢，金彈）射入受體．②農(nóng)桿菌導(dǎo)入法，利用農(nóng)桿菌中存在一種致癌質(zhì)粒（簡稱Ｔ質(zhì)粒），該質(zhì)粒上有一段ＤＮＡ序列可以轉(zhuǎn)移到植物基因組中去．③聚乙二醇－－介導(dǎo)法（類似原生質(zhì)融合）④電激法－－電激穿孔，再通過細胞內(nèi)外的滲透壓差將外源基因直接導(dǎo)入帶壁的植物細胞內(nèi)⑤顯微注射法⑥花粉管通道法⑦脂質(zhì)體導(dǎo)入法，脂質(zhì)生物膜形成節(jié)狀結(jié)構(gòu)，即可包裝重組基因，又能轉(zhuǎn)入植物細胞⑧激光微系轉(zhuǎn)化法－－與電激法類似目的基因的導(dǎo)入

①基因槍導(dǎo)入法，利用超聲波使包裹ＤＮＡ目的基因80①Southern雜交法，利用兩條單鏈ＤＮＡ的堿基互補性，來檢測外源ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化結(jié)果②Nothern雜交法，快速，但設(shè)備要求高③Western雜交法④聚合酶鏈式反應(yīng)（ＰＣＲ）⑤生物系鑒定，如抗病毒基因植株接種該病毒，抗除芽劑基因植株施除草劑轉(zhuǎn)基因植再生及其檢測①Southern雜交法，利用兩條單鏈轉(zhuǎn)基因81基因轉(zhuǎn)化中的載體必須具有如下特點：①在宿主細胞中能獨立自主地自我復(fù)制②容易從宿主細胞中分離純化③載體ＤＮＡ分子中有一段不影響它們擴增的非必需區(qū)域，插入其中的外源ＤＮＡ片斷能夠被動地跟著載體一起復(fù)制和擴增．基因轉(zhuǎn)化中的載體必須具有如下特點：82第六節(jié)激光育種一.激光育種的意義激光（laser）是指利用受激輻射對光進行放大所發(fā)射出來的光。激光育種是以激光作為誘變因素在育種上加以應(yīng)用，是誘變育種的一種。激光育種的意義在于增加育種誘變的因素（方法），提高茶樹遺傳變異率和豐富育種材料，增加茶樹育種的可選擇度，甚至有可能創(chuàng)造全新的品種。第六節(jié)激光育種一.激光育種的意義83二.激光誘變的機理與效果激光不同于電離輻射，它是基于物質(zhì)受激輻射原理產(chǎn)生的一種新穎光源－－激光。激光最大的特點是光能是在空間和時間上高度集中（因此，它相干性好，導(dǎo)色性好）因此，它誘變的點更集中，可直接作用于染色體上，所須材料更少。激光誘變機理比較復(fù)雜，它是通過熱效應(yīng)，光效應(yīng)，電磁場效應(yīng)以及多光子吸收效應(yīng)對育種材料起作用，最終使育種材料的有機體（主要使染色體上的核糖核酸）分子化，離子化并產(chǎn)生自由基，這些自由基又作用于核糖核酸分子，從而引起DNA分子中氫鍵的斷裂核堿基的替換，使基因發(fā)生改變。當然也可能造成材料死亡。二.激光誘變的機理與效果84熱效應(yīng)：激光能使材料在很短時間和很小范圍溫度可達幾百度至一千度，這么高的能量可改變分子結(jié)構(gòu)，光，電磁效應(yīng)和度光子效應(yīng)都會產(chǎn)生電離，生成自由基。熱效應(yīng)：激光能使材料在很短時間和很小范圍溫度可達幾百度至一千85三.茶樹激光誘變育種的研究1.激光處理的有效波長，研究表明，波長在33710納米的氮分子激光器對植物誘變作用較明顯。2.激光誘變的材料及劑量（1）材料，輻照種子是最簡便易行的，當然也可以輻照芽，花粉粒及愈傷組織。（2）劑量：劑量與波長有關(guān)，如波長為44800納米的氬離子激光器的能量比波長為33710納米的氮分子激光器大。劑量還與輻照時間有關(guān)，時間愈長，劑量愈大，在茶樹育種中應(yīng)采取多大劑量仍在探討中。三.茶樹激光誘變育種的研究863.激光誘變的選擇茶樹激光誘變育種應(yīng)注重當代選擇，若發(fā)現(xiàn)有利用價值的變異，可采用無性繁殖方式進行繁育，進而培育成新品種。當然還應(yīng)當對F1和F2代進行，因為輻照育種誘發(fā)突變大多數(shù)隱性的，所以有些變異要在F1或F2代末表現(xiàn)出來。3.激光誘變的選擇87第八章：分子育種第一節(jié)：基因工程與育種一、基因工程的概念應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)（通常是DNA）分離出來，在體外進行切割、拼接和重組，然后將重組的DNA導(dǎo)入某種宿主細胞或個體，從而改變他們的遺傳特性；有時還使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物，這種創(chuàng)造新生物并給予新生物以特殊功能的過程就是基因工程，也稱DNA重組技術(shù)。第八章：分子育種第一節(jié)：基因工程與育種88二、植物基因工程的方法和步驟（一）目的基因的分離和克隆1、基因芯片技術(shù)基因芯片是把生物活性大分子（如核酸和蛋白質(zhì)）或細胞等密集排列固定在固相載體（如硅片、玻片、聚丙烯或尼龍膜）上，所形成的微型檢測器?；蛐酒夹g(shù)就是利用特異性的分子間相互作用，如核酸雜交、抗原-抗體特異結(jié)合、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間特異結(jié)合等，將待測樣本標記后與生物芯片反應(yīng)，通過激光共聚瑩光掃描儀等檢測手段獲得信號，經(jīng)電腦系統(tǒng)處理、分析得到信號值，以次來檢測樣本的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。因此，可利用基因芯片技術(shù)從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的基因。二、植物基因工程的方法和步驟892、基因文庫技術(shù)基因文庫是指匯集和克隆了某一基因組所有DNA序列的DNA群體2、基因文庫技術(shù)90（二）目的基因的轉(zhuǎn)化1、基因的轉(zhuǎn)化的作用⑴創(chuàng)造新品種。⑵研究基因表達或用于基因作圖和基因克隆。2、基因的轉(zhuǎn)化的條件⑴有適宜的目的基因。⑵有適當?shù)慕M織培養(yǎng)系統(tǒng)。能脫分化和再分化．⑶有適當?shù)霓D(zhuǎn)化途徑和方法。要求損失小，頻率高，且外源基因能穩(wěn)定地整合到基因組，并且具有正常的時空表達能力．（二）目的基因的轉(zhuǎn)化913、目前植物基因轉(zhuǎn)化的方法⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法。①原理。在自然條件下，農(nóng)桿菌通過傷口侵染植物，并廣泛寄生于雙子葉植物中。農(nóng)桿菌中存在一種與腫瘤誘導(dǎo)有關(guān)的質(zhì)粒，即Ti質(zhì)粒。該質(zhì)粒能夠把本身的一段DNA轉(zhuǎn)移至植物細胞，整合進植物基因組得以表達，并能夠通過減數(shù)分裂傳遞給后代。可轉(zhuǎn)移的DNA片段稱為T-DNA。T-DNA的轉(zhuǎn)移與邊界序列有關(guān)，而與T-DNA區(qū)段的其他基因或序列無關(guān)，因而，可將T-DNA區(qū)段上的無關(guān)序列去掉，插入外源目的基因，當農(nóng)桿菌3、目前植物基因轉(zhuǎn)化的方法92侵染植物時，將目的基因轉(zhuǎn)移到植物中去。②轉(zhuǎn)化過程：受體系統(tǒng)的建立→Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建→目的基因的轉(zhuǎn)化。③轉(zhuǎn)化方法：整體植株接種共感染法；葉盤轉(zhuǎn)化法；原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法。⑵化學(xué)和物理誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化①聚乙二醇（PEG）法。（原生質(zhì)融合）②脂質(zhì)體法。用脂類化學(xué)物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。侵染植物時，將目的基因轉(zhuǎn)移到植物中去。93③電擊法。④超聲波法。⑤顯微注射法。⑥激光微束法。⑦基因槍法。⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化也稱生物媒體轉(zhuǎn)化，即通過植物的生殖系統(tǒng)的細胞以及細胞結(jié)構(gòu)將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主植物中去。③電擊法。94①花粉管通道法。②生殖細胞浸泡法。③胚囊、子房注射法。4、基因轉(zhuǎn)化方法的評價⑴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化頻率高，周期短，可以轉(zhuǎn)移大片段DNA而被廣泛使用。但其受體植物只是雙子葉植物。⑵化學(xué)和物理誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化法不受宿主植物的限制，應(yīng)用廣泛，但成本較高，轉(zhuǎn)化頻率也不如農(nóng)桿菌高。①花粉管通道法。95⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法簡單易行，但成功率低。（三）轉(zhuǎn)基因植株的鑒定１、轉(zhuǎn)化植株的再生．目的基因的直接受體一般是細胞或組織，在鑒定目的基因被導(dǎo)入與否，先要誘導(dǎo)這些細胞或組織再分化，形成轉(zhuǎn)化植株．２、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定⑴分子生物學(xué)鑒定．主要是通過分子雜交來鑒定，包括southern雜交、northern雜交、western雜交．⑵性狀鑒定．即外源基因在宿主植物表達的鑒定⑶種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法簡單易行，但成功率低。96，如果是無性繁殖，外源基因表達要在下一代穩(wěn)定表現(xiàn)，如果是有性繁殖，外源基因表達則要在后代穩(wěn)定表現(xiàn)．三、基因工程的安全性評價（一）安全性評價的意義生物安全性評價就是要對生物技術(shù)（主要是基因工程）活動本身及其產(chǎn)品，可能對人類和環(huán)境的不利影響及其不確定性和風(fēng)險性進行科學(xué)評估，并采取必要措施加以管理和控制，以保障人類健康和環(huán)境安全．，如果是無性繁殖，外源基因表達要在下一代穩(wěn)定表現(xiàn)，如果是有性97（二）轉(zhuǎn)基因植物安全性評價２００２年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》，將農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工活動對轉(zhuǎn)基因生物安全等級的影響分為三種類型（即：增加轉(zhuǎn)基因生物的安全性；不影響轉(zhuǎn)基因生物的安全性；降低轉(zhuǎn)基因生物的安全性。），并根據(jù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和產(chǎn)品生產(chǎn)、加工活動對其安全等級的影響類型和影響程度，將轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分為四個安全等級．（二）轉(zhuǎn)基因植物安全性評價98（三）轉(zhuǎn)基因植物各階段安全性評價申報要求轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)分為五個階段，即：立項→中間試驗→環(huán)境釋放→生產(chǎn)試驗→安全證書申報．在各個階段都要進行安全性評價申報，通過安全性評價后才能進行下一階段的試驗或生產(chǎn)．每次申報都要提交相關(guān)材料，如在立項階段必須提交：實驗研究報告書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全等級的依據(jù)；相應(yīng)的實驗室安全設(shè)施、安全管理和防范措施。在申報安全證書之前，必（三）轉(zhuǎn)基因植物各階段安全性評價申報要求99須提交：安全評價申報書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全等級的依據(jù)；農(nóng)業(yè)部委托的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)檢測機構(gòu)出具的檢測報告；中間試驗、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗階段的試驗總結(jié)報告；其他有關(guān)材料。須提交：安全評價申報書；農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全等級和確定安全100第二節(jié)：分子標記與育種一、常用分子標記的原理和方法（一）分子標記的概念１、遺傳標記。是指基因型特殊的易識別的表現(xiàn)形式。包括形態(tài)標記；細胞標記；生化標記和分子標記。形態(tài)標記簡單直觀，但數(shù)量少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影響；細胞標記和生化標記經(jīng)濟方便，但標記數(shù)有限。2、分子標記。是指基于DNA水平多態(tài)性的遺傳標記，它通過檢測基因組的一批識別位點來估測基因組變異性和多樣性。3、分子標記的特點第二節(jié)：分子標記與育種一、常用分子標記的原理和方法101⑴是在DNA水平上對遺傳變異的直接反映，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，也不受基因表達與否的限制。⑵多態(tài)性高。⑶大多數(shù)分子標記是共顯性的，使對隱性性狀的選擇成為可能，鑒別出純合基因型與雜合基因型。目前用于輔助育種的分子標記主要有限制性片段長度多態(tài)性（RＦLP）；隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD)；擴增片段多態(tài)性（AFLP)和簡單重復(fù)序列（SSR).⑴是在DNA水平上對遺傳變異的直接反映，不受季節(jié)和環(huán)境的影響102(二）ＲFLP標記限制性片段長度多態(tài)性（RＦLP）是用各種限制性酶將DNA分子剪切成不同大小的片段。由于突變、重組等原因，不同種屬、甚至同一品種的不同個體，對同一內(nèi)切酶來說，切位點和切位點之間的DNA序列都有可能不同，當用限制性內(nèi)切酶處理不同生物體的DNA時，就會產(chǎn)生不同長度DNA片段，這就是RFLP。RFLP標記先用限制性內(nèi)切酶酶解目標DNA，用電泳的方法將DNA片段分開，再通過southern印跡分析各片段的核苷酸序列及其差別．進而為生物進化、親緣關(guān)系以及遺傳育種提供依據(jù)．(二）ＲFLP標記103（二）RAPD標記隨機擴增片段多態(tài)性（RAPD）是建立在DNA序列體外酶促擴增的多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）的基礎(chǔ)上的RAPD標記，其基本原理是采用人工合成的較短的隨機排列堿基順序核酸單鏈為引物，在一種熱穩(wěn)定DNA多聚酶作用下，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，獲得一組不連續(xù)的DNA片段。其中每個擴增所產(chǎn)生的片段代表了基因組上的一個位點，所檢測出來的擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。（二）RAPD標記104RAPD標記具有操作簡單、引物無物種限制、多態(tài)性豐富、可采取自動化操作，提高工作效率等特點而被廣泛運用。RAPD標記在育種中用于重要性狀的分子標記；圖譜繪制、雜種純度鑒定等。在茶樹育種方面，有人運用RAPD標記進行親子關(guān)系鑒定；茶樹遺傳多樣性分析；無性系突變體鑒定等。RAPD標記具有操作簡單、引物無物種限制、多態(tài)性豐富、可采取105（三）AFLP標記AFLP標記是用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，然后對限制性片段進行選擇性擴增，從而揭示DNA多態(tài)性。該技術(shù)的特點是信息量大，一次反應(yīng)可檢測到上百個位點，而且得到的譜帶的大多數(shù)片段與基因組的單一位置相對應(yīng)，故可用于遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建，此外，還可用于增加染色體特定區(qū)域的飽和性分析；回交群體遺傳背景分析；種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等等。（三）AFLP標記106（四）SSR標記(simplesequencerepeats)SSR標記是利用真核生物的基因組中普遍存在1~6個bp簡單串聯(lián)重復(fù)特性作為分子標記，生物個體不同，簡單串聯(lián)重復(fù)的核酸序列也不同，從而構(gòu)成生物多樣性．由于每個簡單重復(fù)序列兩端的堿基組成基本是相同的，因而可根據(jù)兩端的序列設(shè)計一對特異引物，擴增每個位點的簡單重復(fù)（微衛(wèi)星）序列，進而分析生物多樣性．SSR標記廣泛用于連鎖圖譜的構(gòu)建和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究．（四）SSR標記(simplesequencerepea107二、分子標記在育種中的應(yīng)用（一）構(gòu)建遺傳圖譜。建立高密度分子遺傳圖譜，定位與目標性狀緊密連鎖的分子標記，有助于在茶樹生育早期對群體中含有目標基因植株進行選擇，從而大大提高育種效率，縮短育種周期．（二）分析親緣關(guān)系．借助分子遺傳圖譜可為品種資源和鑒定和保存，研究植物的起源與進化，遠緣雜交親本的選配，預(yù)測雜種優(yōu)勢等提供理論依據(jù)．二、分子標記在育種中的應(yīng)用108（三）分子標記輔助選擇．１．在親本選擇上，傳統(tǒng)的選擇是基于田間表現(xiàn)型的選擇，而不是對基因型的選擇，但表型是基因型與環(huán)境互相作用的結(jié)果，許多性狀與基因間并非一對一的線性關(guān)系．因此，依表型來推測基因型并不總是可靠的或是比較困難的，不僅需要豐富的實踐經(jīng)驗，而且還受到許多外在條件的限制，而分子標記輔助選擇則可以避免這些限制．２．可以在細胞水平和植株早期發(fā)育階段進行鑒定，找到含有目標基因或不良性狀基因的植株，早期鑒定，早期分離，早期培育，縮短育種周期．（三）分子標記輔助選擇．１．在親本選擇上，傳統(tǒng)的選擇是基于田109思考題：１、將外源基因轉(zhuǎn)化到植物中去的必要條件是什么？２、進行基因轉(zhuǎn)化的途徑有哪些？它們各有何特點？３、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有哪些？４、什么是遺傳標記？遺傳標記包括哪些不同層次的標記方法？它們各有何特點？５、如果你已獲得能抗某一主要害蟲的基因，如何將該基因轉(zhuǎn)化到茶樹體內(nèi)？試述主要步驟和方法？思考題：110６、分子標記在茶樹育種中的應(yīng)用有哪些？７、分子標記輔助選擇在茶樹早期鑒定中有何重要意義？８、常用的分子標記技術(shù)有哪些？各有哪些特點？６、分子標記在茶樹育種中的應(yīng)用有哪些？111單倍體育種的優(yōu)越性1.控制雜種分離,縮短育種周期常規(guī)雜交育種,自花授粉植物從選擇親本開始,經(jīng)雜交、分離、選擇、穩(wěn)定品質(zhì)4~6代,加之品比、生產(chǎn)試驗、區(qū)域試驗需8~10年時間;異花授粉植物的育種周期更長,僅穩(wěn)定品系就要6~7代自交.而對一些異花授粉的樹木而言,這個過程更長,例如茶樹至少要20年以上,正因為如此,很少有人用常規(guī)雜交育種的辦法要選育有性茶樹品種.如果采用單倍體育種,則能夠在較短時間(3~5年)獲得純系,而選育有性茶樹品種打下基礎(chǔ).從而縮短育種周期,雜交有性品種的可能性.單倍體育種的優(yōu)越性1.控制雜種分離,縮短育種周期112茶樹育種學(xué)第八章--分子育種課件1132.排出顯、隱性基因干擾,提高選擇效率常規(guī)育種單倍體育種親本基因型AAbb×aaBBAAbb×aaBBF1配子基因型AaBbAaBbF2配子基因型2.排出顯、隱性基因干擾,提高選擇效率1142.單倍體是研究遺傳變異的好材料,這點對茶樹育種至關(guān)重要.由于茶樹是多年生異花授粉植物,要搞清楚其遺傳變異難度很大,這也制約了茶樹育種技術(shù)和手段的發(fā)展.如雜交育種,轉(zhuǎn)基因,抗性育種,品質(zhì)育種等等.3.單倍體是誘變育種的好材料,因基因相對純合.單倍體植株經(jīng)誘變后,所以突變范圍的高化發(fā)送都能在當代表現(xiàn)出來,而其它倍數(shù)體植株在誘變處理后,某些突變隱性基因所控制的性狀變化則不能在當代表現(xiàn)出來,增加選擇難度.2.單倍體是研究遺傳變異的好材料,這點對茶樹育種至關(guān)重要.由1154.克服遠緣雜交不孕或不結(jié)實.主要原因是遺傳差異大,染色體難以配對,利用單倍體對栽培品種進行提純復(fù)狀,對基因型混雜的品種,經(jīng)單倍體加倍成純合二倍體,再選擇具有原品種優(yōu)良特性特征的植物大量繁殖推廣,達到提純復(fù)狀的目的.對茶樹育種而言:一是縮短育種周期,二是便于資源現(xiàn)場研究,為育種打下基礎(chǔ).4.克服遠緣雜交不孕或不結(jié)實.主要原因是遺傳差異大,染色體難116第二節(jié)單倍體育種一、植物單倍體的概念植物在減數(shù)分裂時形成雄、雌配了,其染色體數(shù)目為體細胞的一半,將這種具有單套染色體的細胞稱為單倍體細胞.單倍體細胞在人工離體條件下培養(yǎng),使其單性發(fā)育成植物體,這種具有單套染色體的植物稱為單倍體植物.第二節(jié)單倍體育種一、植物單倍體的概念117二、單倍體育種的概念:將具有單套染色體的單倍體植物,經(jīng)人工染色體加倍,使其成為純合二倍體.從中選育出符合人們需要的個體,直接繁育成新品種,或選出具有單一優(yōu)良性狀的個體,作為雜交育種的原始材料,稱為單倍體育種.二、單倍體育種的概念:118花藥培養(yǎng)的概念花藥培養(yǎng)就是以植物花藥為材料,通過組織培養(yǎng)形成愈傷組織,再經(jīng)過誘異分體形成完整植株的過程.由于花藥培養(yǎng)的主要目的是獲得單倍體植株.因此,人們也把花藥培養(yǎng)稱為單倍體植株培養(yǎng).花藥培養(yǎng)的概念119單倍體育種的優(yōu)越性(見第一節(jié)內(nèi)容)單倍體育種的優(yōu)越性(見第一節(jié)內(nèi)容)120非均等分裂五、花粉單性發(fā)育的生物學(xué)原理及離體培養(yǎng)條件下小孢子發(fā)育成植物體的途徑單核小孢子營養(yǎng)核生殖核營養(yǎng)細胞生殖細胞愈傷組織多細胞花粉粒單倍體植株胚狀體非均等分裂五、花粉單性發(fā)育的生物學(xué)原理及離體培養(yǎng)條件下小孢子121六、單倍體植物的培養(yǎng)程序及關(guān)鍵技術(shù)①順利通過消毒滅菌關(guān)②花粉發(fā)育時期的鑒定和選擇用于研究遺傳的可選用一些具有典型發(fā)送的品種,用于培養(yǎng)新品種則選擇結(jié)合性較好的品種的花藥.選擇花藥發(fā)育的單核花粉后期.③確定是否低溫處理和糖處理材料準備六、單倍體植物的培養(yǎng)程序及關(guān)鍵技術(shù)122①基本培養(yǎng)篩選選用SJ—1和N6培養(yǎng)基(見P163)②植物激素種類和濃度篩選③糖濃度(滲透壓)篩選接種→脫分化→愈傷組織→再分化→化苗誘導(dǎo)花粉脫分化分裂①基本培養(yǎng)篩選選用S123①花粉愈傷組織分化,植株再生(激素種類及濃度調(diào)節(jié))取形成愈傷組織60天以上,直徑在2~3mm左右且為第一代愈傷組織作再分化材料②胚狀體壯苗培養(yǎng):a.調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基b.降低激素和滲透壓用N6培養(yǎng)基(見P165)分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)①花粉愈傷組織分化,植株再124①調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基,無機鹽濃度下降②調(diào)節(jié)激素濃度和種類③調(diào)節(jié)糖濃度(滲透壓)關(guān)鍵是生長素與細胞激素之比,適中則脫分化,比值高則有利于長根,比值低則有利于長芽完成植物體形成①調(diào)節(jié)基本培養(yǎng)基,無機125①試管菌馴化,滲透壓變化和光照強度變化②移植營養(yǎng)土配制③保持高空氣濕度(80~90%,1~2周)和低土地濕度.④用5%可濕性多菌消毒馴化與移載①試管菌馴化,126①形態(tài)鑒定②細胞學(xué)鑒定③交配鑒定④分子標記鑒定花粉植株鑒定①形態(tài)鑒1271.形態(tài)鑒定:①外形:植株瘦小,葉片窄小,花小柱頭長.②結(jié)實性:開花,不結(jié)實.③花粉粒著色和大小,花粉粒敗育,不著色2.細胞學(xué)鑒定.取根尖細胞鏡檢染色體數(shù)目1.形態(tài)鑒定:1284.分子標記鑒定:①同功酶,分析比較處理前后再生后植株的同功酶.②限制性片段長度多肽性(RFLT技術(shù)),時間長,費用高.③隨機擴增多肽性(RAPD).運用單個或多個隨機引物(長度為10個或多重百個核苷酸)經(jīng)多聚酶鏈式反應(yīng),酶促擴增特異性DNA片段.從而得到多態(tài)性圖譜.RAPD與PFLT比較,具操作簡便,速度快,成本低,檢出率高的優(yōu)點.4.分子標記鑒定:129七、單倍體植物的染色體加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:①小菌浸泡法.將再生小植株從試管移出,在無菌條件下用秋水仙素溶液浸泡,再轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基去培養(yǎng).②處理生長錐,醮滿秋水仙素溶液的棉球置于頂芽或腋芽③培養(yǎng)基加倍,在培養(yǎng)基加入一定濃度的秋水仙素.七、單倍體植物的染色體加倍一般用秋水仙素加倍,方法有:130八、茶樹花藥培養(yǎng)及展望存在的問題1.誘導(dǎo)效率低2.體細胞(花藥、藥壁、藥隔)干擾問題3.目前培養(yǎng)基成分帶有一定睛的育成性八、茶樹花藥培養(yǎng)及展望存在的問題1.誘導(dǎo)效率低131第三節(jié)體細胞雜交一、體細胞雜交的原理及定義體細胞雜交也稱細胞融合.實質(zhì)是兩團來自不同親本的原生質(zhì)體的融合.原生質(zhì)體是除去細胞壁的裸露細胞-------原生質(zhì)體的概念.原理:已知植物細胞壁上,具有粘性很強的核酸酶.核酸酶可阻止外源DNA進入植物細胞,除去細胞壁后,可避免核酸酶對異體DNA的破壞.從而使胞質(zhì)融合和轉(zhuǎn)基因成為可能.第三節(jié)體細胞雜交一、體細胞雜交的原理及定義132長期以來的有性雜交方法所進行的遺傳物質(zhì)交換(基因重組)有如下局限性:1.同源性(自交不親合)和異源性(雜交不親合)限制了有性結(jié)合范圍.2.由于配子形成是減數(shù)分裂的先導(dǎo).而在減數(shù)分裂時,由于染色體的易位,例位、重復(fù)、缺失行為而引起染色體數(shù)目減少或增加.因為雜交后代不可能具有完整的遺傳信息.而原生質(zhì)體是研究遺傳理論的好材料.如核質(zhì)關(guān)子,雜交或自交不親合性的機理以及激素作用機理等.長期以來的有性雜交方法所進行的遺傳物質(zhì)交換(基因重組)有如下1333.大多數(shù)高等植物,重組只限于染色體基因(核基因),而雄配子體細胞胞質(zhì)基因不可能遺傳給下一代.而體細胞雜交能克服上述局限.如擴大“雜交”范圍,創(chuàng)造植物新物種和新品種,如固N作用,高光數(shù),抗病蟲等.有利于遺傳研究.1.克服不親合性,擴大“雜交”范圍,創(chuàng)造新品種2.有利于研究細胞質(zhì)遺傳3.大多數(shù)高等植物,重組只限于染色體基因(核基因),而雄配子134二、體細胞交雜的程序①雙親原生質(zhì)體制備②酶法分離原生質(zhì)體.纖維素酶,果膠酶③影響原生質(zhì)體活力的各種植物原生質(zhì)體分離二、體細胞交雜的程序135①采用界面法純化原生質(zhì)體②篩網(wǎng)過濾③質(zhì)膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑雙親原生質(zhì)體混合液制備:雙親原生質(zhì)體以等體積,等密度(104~105個細胞/ml)混合,制備成混合親本原生質(zhì)體.原生質(zhì)體純化①采用界面法純136①融合法②高鈣和高PH值法③聚乙二醇法④聚乙二醇和高鈣,高PH值結(jié)合法.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體137

①互補選擇法:白化互補,遺傳