單純皰疹病毒1型糖蛋白真核表達(dá)載體構(gòu)建及

獨(dú)創(chuàng)的研究成果，不包含本人或他人已申請或其他用途使用過的成果。與作者簽名 日期保護(hù)知識校攻讀期間工作的知識單位屬第四。本人保證畢業(yè)作者簽名 導(dǎo)師簽名 日期學(xué)科專業(yè)：病原生物 師：吳興安教輔導(dǎo)教師：講Sp2/0第四二O一一年四月縮略語 中 前 文獻(xiàn)回 正 材料方 方 結(jié) 討 參考文 個人簡歷和研究成 致 縮略語縮略 英文全 中文全

Acquiredimmunedeficiency Base Bovineserum Chinesehamsterovary Cytomegalo巨細(xì) centralnervous 細(xì)胞毒性T deoxyribonucleicacid Deoxyribonucleosidetriphosphate

humanimmunodeficiency人類免疫缺陷 herpessimplexkeratitis 皰疹毒角膜炎 herpessimplex單純皰疹 Interferon Internalribosomalentry Kilobase messenger 信使 Molecularweight Roundsper Sodiumdodecylsulfateamidegel

a Thelp Tris/（hydroxymethyl）aminom-

Unique Unique ：黨引利 師：吳興安教第四基礎(chǔ)部微生物學(xué)教研室，西安中單純皰疹（herpessimplex,HSV）是一種流行于全世界的皰疹引起失明，后者則常伴有較重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥且可能引起；HSV-2則主要通過性引起常見的皰疹。近年的研究還顯示HSV可增強(qiáng)引起（acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）的人類免疫缺（humanimmunodeficiency,HIV）及的幾率，因此，有效治療HSV對于預(yù)防HIV的也具有重要的意義[2]。目前對于HSV尚無有效的治療，臨床主要應(yīng)用抑制DNA類藥物進(jìn)行治療，不用g-1和gD1聯(lián)合免疫對小鼠的保護(hù)作用要優(yōu)于g-1單獨(dú)免疫，提示gC1有可能用于增強(qiáng)的免疫效果]。本研究期工作的基礎(chǔ)上，利用分子S11/構(gòu)建了表達(dá)HSV- gC蛋白的真核表達(dá)載體PCI-neo-MARs-mCMV-IRES-DHFR-名為PCI-neo-MARs-mCMV；其次構(gòu)建DHFR-L22R（即編碼第22位亮氨酸L的CTT用編碼精氨酸R的CGG替換）。將HSV-1gC、IRES和定獲得陽性重組質(zhì)粒PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R，大量制穩(wěn)定表達(dá)HSV-1gC蛋白的CHO-K1細(xì)胞系與Sp2/0細(xì)胞系的建立與篩選將大量的重組質(zhì)粒PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R甲喋呤（MTX）雙篩選壓力下篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，Slotblot方法檢測表明細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白HSV-1gC。HSV-1gC蛋白的表達(dá)與鑒定糖填料進(jìn)行目的蛋白純化，純化后SDS和Westernblot分析表明，成功ConstructionandexpressionofHSV-1gCglycoproteineukaryoticexpressionCandidateformaster:DangYin-liSupervisor:WuXing-Departmentofmicrobiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaTheprevalenceofHSVinfectionisconsiderablyworldwide.HSV-1isacommoncauseofmucosalherpes,herpetickeratitisandencephalitis.Herpetickeratitisistheleadinginfectiouscauseofblindness.Encephalitisisoftenpaniedbysevereneurologicsequelae.HerpesgenitalisisasexuallytransmittedinfectioncausedprimarilybyHSV-2.HSVinfectionincreasestherateofhumanimmunodeficiency(HIV)infectionandtransmission,whichcancauseacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS).Untilnow,notreatmenthasshowobviousefficacytoHSVinfection.DrugswhichcanrestraintheviralDNAreplicationusedintheclinical,cannoteradicateHSVinfectionandeasytoproducedrug.Vaccinationhasremainedthebestmethodforpreventingspread,butHSVvaccineisstillunderpreclinicalphase.Onereasonisthecanprovideasurvivaladvantageinvivobyimmuneevasion.HSVgCisaC3bbindingcomplementregulatoryproteinwhilegE/gIformacomplexthatbindstheFc ofIgG,inhibitingactivationofcomplementandADCC.RecentstudiesshowthatcombinedimmunizationwithgC-1andgD-1conferredhigherprotectioninmicethangD-1alone,suggestinggC-1mayb use t enhanc th immun effec o th vaccineConstructionofeukaryoticexpressionvectorPCI-neo-MARs-mCMV--IRES-DHFR-WeconstitutedplasmidPCI-neo-MARs-mCMVusingMARs-mCMVtoreplacethepriorpromoterhCMV.TheDHFR-L22Rgenewasconstructed(thecodeCTTwassubstitutedforthecodeCGGwhichencodedaminoacidfromLeutoArg).HSV-1gCgene,IRESgene,DHFR-L22RgenewereclonedintoeukaryoticexpressionvectorPCI-neo-MARs-mCMV.The binantplasmidPCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22Rwasgotanddigestedwithrestrictionendonucleases.Alargeamountofthe binantplasmidwaspreparedandpurified.Stableandhighlevelexpressionoftheherpessimplextype1(HSV-1)glycoproteinC(gC)geneinCHO-K1andSp2/0cells. binantplasmidwastransfectedintoCHO-K1andSP2/0cellsbytheinstructionofLipofectamineTM2000forstableexpression.ThestableexpressioncellstrainswereselectedbyG418andmethotrexate(MTX).CHO-K1andSP2/0cellsstablyexpressingHSV-1gCproteinwereestablishedanddetectedbySlotblot.Stablytransfectedcellswerecultivatedabundantly,andtheculturedsupernatantswascollectedandconcentrated.TheexpressedgC-1proteinwaspurifiedwithHis-NiSepharosecolumn.Afterpurification,gC-1proteinexhibitedamajorCoomassieblue-stainedbandonSDS-polyacrylamidegelsandwasdetectedbyWesternysiswithanti-HismAb.TheresultsshowedthatthegC-1proteinwasexpressedandithasaspecificbinding：HSV;gC;expression;CHO-K1; 單純皰疹（herpessimplex,HSV）是一種流行于全世界的皰疹性疾病病原體[1]，其有兩種型，即HSV-1和HSV-2，兩型的DNA有50%的同源性。HSV-1主要人的口腔、皮膚黏膜、眼黏膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起齦口炎、唇皰疹、咽炎、角膜炎和皰疹性腦炎；HSV-2通常為體一旦HSV，很難被有效清除[2]。在發(fā)展中國家，HSV-2流行率高達(dá)41%-83%，且HSV-2和HIV呈明顯相關(guān)[6]。而在，大約有58%的人HSV-1，17%的人HSV-2[3]，且其每年新發(fā)數(shù)達(dá)到70萬，復(fù)發(fā)的約有1000萬。近年來我國的HSV迅速上升，其中HSV-1的顯著增多[7]。多處于臨床前研究階段，格蘭素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）發(fā)了2型HSV（HSV-2）糖蛋白D（gD-2）的亞單位，該只對HSV-1和HSV-2的女性有效，而對于和HSV-1陽性女性群體，預(yù)防HSV-2的效果均不理想，該結(jié)果如獲得進(jìn)一步證實(shí)后有可能上市。而以逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，gC與gE/gI復(fù)合物與HSV的免疫逃避機(jī)毒的致病力將大大降低[5-8]。鑒于此作用，我們構(gòu)建了HSV-1gC真核表達(dá)載gC細(xì)胞株并鑒定，為皰疹的研究和奠定基礎(chǔ)。文獻(xiàn)回一、單純皰疹研究進(jìn)單純皰疹概（herpessimplexkeratitis，HSK）是最常見的性眼病之一，其是一種嚴(yán)態(tài)[12]，在機(jī)體免疫力低下時,潛伏的HSV-1可重新活化,引起HSK的復(fù)增強(qiáng)引起（acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）的人類免疫缺陷（humanimmunodeficiency ,HIV）及的幾率[19-20]。單純皰 研究現(xiàn)從開始發(fā)現(xiàn)HSV到現(xiàn)在，其發(fā)展經(jīng)歷了相當(dāng)長的過程，隨著滅活及其亞單位對于HSV的研究始于70年前，最早的滅活HSV是將在細(xì)胞中培養(yǎng)的用化學(xué)方法滅活制成的，KernandSchiff,Skinner,Dundarov,Kavaklova等研究者都過此種是有效的[21-23]，但是這種早期的白的污染、清除大量的和清除殘余的DNA來達(dá)到[24-25]。此[27]和Skinner，而Skinner是部分純化的HSV-1包膜糖蛋白，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對HSV-2也有交叉保護(hù)作用。另一類滅活亞單位是圍繞以上大部分試驗(yàn)性亞單位的臨床前評估都證明其對于動物（鼠，豚鼠，兔子）的致死性HSV有保護(hù)作用；作為預(yù)防性，其只能減少攜帶神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目，不能完全建立潛伏狀態(tài)；而作為治療性，其可以限制潛伏狀態(tài)的建立，所以重新活化的頻率和才起作用，這樣在重新活化之前，對于免疫時間和免疫劑量就有比較嚴(yán)格的要求。另外發(fā)現(xiàn)，在接種時所用的佐劑對于發(fā)揮作用也至關(guān)重要，據(jù)Bourne，HSVgD2亞單位與鋁佐劑和3ˊ-脫酰單磷酸脂質(zhì)A（3-dMPL）聯(lián)合使用HSV-1HSV-2的，都可以起到有效的保護(hù)作用，而且可以減少豚鼠的HSV再發(fā)，這種佐劑對于人類同樣重組HSVDNA的方法來獲得大量純化的HSV糖蛋白成為可能。人們在大腸桿菌和/或哺乳動物細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)HSV12HSV包膜糖蛋白中絕大多數(shù)重組HSV的研究都集中于HSVgB和gD糖蛋白的研究，這主要取決于HSVgB和gD在吸附和穿入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著HSVgDHSVgD中和抗體可以抑制穿入宿主細(xì)胞[31]；后來發(fā)現(xiàn)，HSVgD還可以與細(xì)gD1和gD2TNF受體相互作用[32-33]。HSVgB與易感細(xì)胞表面的氨基葡聚糖結(jié)合，介導(dǎo)吸附；同時HSVgB至少有五個連續(xù)抗原表位和非連續(xù)抗原表位，其中兩個與中和抗體反應(yīng)；另外，HSVgB498-505抗原表位與特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[34]。和皮下局部，而且對HSV-2引起的也起到交叉保護(hù)作不同的是，gC單獨(dú)免疫沒有保護(hù)作用[35]，而gE對眼部的HSV有一定的保護(hù)作用。HSVgB、gD和gE三種糖蛋白混合制成的多價亞單位對于角膜皰疹非常有效，而且成功的降低了豚鼠HSV-2的復(fù)發(fā)頻率。需要注意的是，所有以上的亞單位的作用都是佐劑和抗原劑量依賴的。對給小鼠起到保護(hù)作用[36]，HSZP免疫時也可以得出相似的結(jié)果。而對于人類，約100μg亞單位與鋁佐劑聯(lián)合使用能引起適中的免疫反應(yīng)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)接種后，其中40-60%的人中和抗體ELISA檢測呈此類重組亞單位的研究較多，目前代表性為已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的HSVgD2gB2-MF59和HSVgD2-鋁劑-MPL。Chiron公司終止了HSVgD2gB2-MF59的研發(fā)，gD2gB2-MF59是將重組HSVgD2HSVgB2糖蛋白與佐劑MF59配伍制成，臨床研究顯示，該可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價的中和性抗體，但不能有效抑制HSV-2的[37]；格蘭素史克的亞單位，其含兩種佐劑，分別為鋁佐劑和3ˊ-脫酰單磷酸脂質(zhì)A陽性的女性群體和所有則無明顯保護(hù)作用，之后GSK公司正在與減毒活減毒活是通過敲除等方法將HSV的毒力、潛伏期或等相關(guān)刪除，使其無致病性或致病力低，但仍然能夠保持的增殖能力和免疫原性。HSV的編碼約有80個，編碼各類型的蛋白，包膜糖白gB和gD對于在體內(nèi)增殖是必不可少的，而那些與增殖無關(guān)緊要的糖蛋白（比如gE），也可能與在體內(nèi)神經(jīng)中樞中擴(kuò)散相關(guān)，所以篩選（ICP27）和/US1（US/UL接頭處，編碼立即早期調(diào)控蛋白ICP22），通過這些敲除來達(dá)到減毒目的，這些缺陷雖然可以誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞反應(yīng)，但不能產(chǎn)生子代[39]；Forrester等研制出一種新的減毒活HSVgHdel突變體，接種小鼠耳部研究發(fā)現(xiàn)，這體，其免疫原性在動物模型豚鼠中已經(jīng)驗(yàn)證，而且這種缺陷可以減小致株的潛伏范圍，同時對于急性角膜炎有保護(hù)效應(yīng)[43]；Keadle等發(fā)現(xiàn)敲除HSVUL41（編碼宿主關(guān)閉蛋白vhs，可以通過關(guān)閉宿主細(xì)胞發(fā)[44]；WachsmanHSV-2毒株中敲ICP10/RR（核糖核苷酸還原酶大亞基）的突變體免疫小鼠后，再用致病性HSV-2毒株經(jīng)皮內(nèi)或進(jìn)[]Whitle株了R7017（TK–）重組體，其是敲除了TK以及UL/US交接處，目的是去除部分編碼立即早期蛋白的和神經(jīng)毒性相關(guān)是在R7017的基礎(chǔ)上，重新將TK到UL/US交接處，不幸的是，DNADNA分成兩類：第一類為（或細(xì)菌）DNA，是將目的基因重組到其他不致?。ɑ蚣?xì)菌）組中；第二類是DNA，是一般接種于肌肉和/或皮下，肌肉細(xì)胞或表皮細(xì)胞表達(dá)的抗原隨后由質(zhì)粒免疫后，對于致病性HSV-1都有很明顯的預(yù)防效果；對于內(nèi)HSV-，表達(dá)HSV-2gD和gB的質(zhì)粒聯(lián)合免疫起到的保護(hù)效果優(yōu)于gD2DNA疫苗單獨(dú)免疫[49]。先前有研究，桿狀表達(dá)HSV糖蛋白gB，gC，gD，一些編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒與DNA共同免疫后可起到佐劑作用HSVgDDNA與IL-8cDNA和/或化學(xué)誘導(dǎo)物RANTES共注射，可以增TH1型免疫反應(yīng)；IL-12，與HSVgD2DNA共同免疫小鼠，可以增IL-18和IFN-γ質(zhì)粒與HSV-1gB質(zhì)粒共同免疫，同樣起到佐劑作用：其中CpG序列與HSVgBDNA聯(lián)合免疫可以保護(hù)小鼠免受HSV-2毒株的[53]二、單純皰 包膜糖蛋白C研究現(xiàn)單純皰疹糖蛋白C的結(jié)構(gòu)和功分C3b，其是補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的一個重要蛋白。HSVgC糖蛋白與哺乳動物補(bǔ)體HSV-1UL44編碼，其有四個不同的區(qū)域介導(dǎo)C3b結(jié)合，有八個半胱氨酸殘基形成四個鏈內(nèi)二硫鍵；HSVgC-2是一個480個氨基酸的蛋白，通過HSV-2UL44編碼，有三個介導(dǎo)C3b結(jié)合的區(qū)域，其半胱氨酸的位置與注：SIG表示信號序列；TM表示穿膜區(qū)域；黑色圓球表示可能的N-糖基化位點(diǎn)；C表示半胱氨酸；黑色橢圓球表示C3b結(jié)合區(qū)域；兩個半胱氨酸之間連線表示鏈內(nèi)二硫鍵。圖1單純皰疹gC-1和gC-2線性結(jié)構(gòu)圖Fig.1SchematicfiguresofHSVgC-1andgC-（JohnLubinski,etal.CellDevelopmentalBiology,1998,0242:329-HSV-2的其它蛋白干擾C3b的結(jié)合；在轉(zhuǎn)染和細(xì)胞，HSVgC-1保護(hù)細(xì)胞和gC突變株比野生型毒株大約有效50倍[54]HSVgC-1是一個多功能的蛋白，除了抑制補(bǔ)體激活外，還能介導(dǎo)33-123150周圍的不僅如此，最近有研究顯示，HSVgC與gE通過中和抗體對gB-gD間、gD-gH/gL間或gB-gH/gL間相互作用的干擾，而其彼此之間的相互作用2HSVgCgEFig.2FiguresoftheinteractionofHSVgCand（HookLM,etal.JVirol,2008,82(14):6935-單純皰疹gC在研究中的應(yīng)HSVgE/gIIgGFc段的復(fù)合物，阻HSVIgG的激活補(bǔ)體和ADCC作用通過Fc區(qū)結(jié)合；而HSVgC是C3b結(jié)合補(bǔ)體調(diào)控蛋白，同時還能介導(dǎo)結(jié)合細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素。補(bǔ)體和抗體是抗的兩條重要的抵御主線，而HSV可以過gE/gI和gC干擾機(jī)體的免疫反應(yīng)，這些協(xié)同的免疫逃逸行為能使逃避宿主的，對體內(nèi)和體外的提供生存優(yōu)勢。有研究者發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)經(jīng)過所產(chǎn)生的抗HSVgC的抗體并不能HSVgC在介導(dǎo)、參與的免疫逃逸以及誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)研發(fā)新型，有效的預(yù)防和治療皰疹具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 單純皰疹1型糖蛋白C真核材菌種與載體E.coliJM109：型recA1supE44endA1hsdR17(rk－，mk＋)gyrA96relA1thiA△(Lac-proAB)F′[traD36proAB+LacIqLacZ△M15]，由本保存。用Inoue法感受態(tài)細(xì)胞，以200l/管分裝后-70℃凍存?zhèn)溆?。pCI-3與核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（InternalRibosomalEntrySite,IRES）由本室前期克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pCI載體中保存，命名Fig.3pCI-neoandpCIvectorcircle細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液濾膜過濾除菌。完全培養(yǎng)液含2%或10%熱滅活的新生牛（購自杭州四，1%0.1M7.2左右，4℃保存?zhèn)溆谩２缓臑椴煌耆囵B(yǎng)液細(xì)胞小液L-G溶液（0.2M：稱取2.9克L-谷氨酰胺（分子量146.15，用純水溶解至100ml，0.22m濾器過濾除菌，分裝青霉素小瓶，-20℃凍存。雙抗溶液（青、鏈霉素（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸N′-2-ethanesulfonicacid,N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙基磺酸，分子量238.3)，用純水溶解至100ml，過濾除菌，分裝青霉素小瓶，4℃凍存。中，0.22m濾器過濾除菌，分裝青霉素小瓶，-20℃凍存。細(xì)胞凍存液的配制：5ml新生牛+4ml不完全RPMI-1640+1ml工具酶及試劑工具T4DNA連接酶、TaqDNADNA主要試劑試劑名 來抗HSV單克隆抗體（mAb）4C9 本前期小鼠抗His Invitrogen公I(xiàn)RDye800CW-抗小鼠IgG LI-COR公司 HisNiSepharose純化填 GE公 細(xì)菌培養(yǎng)基peextract、5NaCl，攪拌溶5NNaOHPH7.0，定1L。高瓊脂氨芐平板：稱量1.2克瓊脂粉，加入100ml2×YT培養(yǎng)基中，提前滅菌的直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，凝固后倒置，4℃保存?zhèn)溆谩３Ｓ镁彌_液體系SDS緩沖液系統(tǒng)（Lowerbuffer1.5mol/LTris·HCl(pH8.8)Tris溶解800ml純水中0.1mol/LHClpH8.8，定容至1000ml。 buffer1.0(pH6.8)Tris800ml0.1mol/LHClpH6.8，定容1000ml。0.150ml1MDTT50mMDTT。10×電泳緩沖液：Tris15.1g94g，SDS5g，溶解加水定容至1000ml，室溫保存，用時稀釋10倍。染色液：考藍(lán)R-2500.1%，25%異丙醇，10%冰醋酸脫色液：100ml醋酸，50ml1L，混勻后使用，可以反復(fù)使用3-5次。Western-Blot緩沖液系統(tǒng)Tris1L。TBS緩沖液：Tris2.42克，NaCl8.761L，室溫TBST緩沖液：TBS0.05Tween-200.01MPBS（pH7.4：140mMNaCl，27mMKCl，8mMNa2HPO4，1.5mMKH2PO4。封閉液：5%脫脂奶溶1×TBS主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng) Heraeus公 Boney公司 Costar公司 BIO-RAD公司Mini-PROTEAN?產(chǎn) LI-COR公30K超濾 ThermoForma公司方Inoue法 JM109感受態(tài)細(xì)胞3716-20h2-3mm。挑取一個單菌落接5ml2×YT培養(yǎng)基中，37℃搖床（250rpm）8-10h。將上述初始培100ml2×YT5μl25μl，第30minOD600=0.55時，將培養(yǎng)物迅速置于冰10min100ml4ml1.5ml預(yù)冷離心的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，用槍頭輕輕混勻重懸沉淀，然后再分成兩支（200μl/支），15μlDMSO3～4次，混勻后冰上放置5-10min。預(yù)先在塑料袋中裝些液氮，放入的感受態(tài)，再用鑷子袋口，將剩余液氮倒出，好的感受態(tài)細(xì)胞迅速于-80℃冰箱中保存抗HSV單克隆抗體（mAb）4C9腹水的HSV單克隆抗體（mAb）4C937℃水浴迅速融化，將細(xì)胞懸液移入37℃預(yù)熱的5mlRPMI-1640無培養(yǎng)液中，1000rpm離心5min，棄上清。沉淀加入含10%新生牛的RPMI-1640培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)，次日換液。BALB/c小鼠預(yù)將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來，1000rpm10min，棄去上清，用無1～2×106/ml0.5ml腹（注意使小鼠頭部抬高只小鼠一次可抽腹水1-3ml2～31～3次。將抽取的腹水經(jīng)改造PCI-neo載BglⅡ和NheⅠ雙酶切pCI-MARs-mCMV-IRES與PCI-neo載體，將切下HSV-1gC的合根據(jù)GenBank中HSV-1組序（序列號NC_001806選取gC-1胞外區(qū)1-457a.a編碼，并對編碼堿基進(jìn)行優(yōu)化，為利于表達(dá)的重組蛋序列為MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG，在5’端加入NheI酶切位點(diǎn)和6×His尾用于純化，3’端加上終止碼TAA和克隆用的MluI酶切位點(diǎn)，片段大小共1390bp(序列見結(jié)果部分)，交由TaKaRa公司進(jìn)行全合成，合成后克隆至pMD19-TSimple載體中，命名為pMD19-T-gC1。L22R突變型DHFR的構(gòu)L22RDHFR(1-96bp)合根據(jù)GenBank國倉鼠DHFR序列，合成5′端起始碼和EcoRI之間1－96bp的序列，并把編碼22位亮氨酸（L）的CTT用編碼精氨酸（R）的CGG替換，兩端分別加入克隆所需的XbaI和EcoRI酶切位點(diǎn)，基DHFR(1-96bp)。DHFR（97-468bp）的線性化，突變后未改變氨基酸編碼。根據(jù)GenBank國倉鼠上游引物u5′-CCGGAATTCAATTCCAAAGAATGACCACCAC-3（以上引物由金斯瑞生物科技合成PCR擴(kuò)增DHFR（97-468bp）片DHFR質(zhì)粒模 10×PCR緩沖 25mM 25nM 上游引物 下游引物 Taq 總體 50PCR反應(yīng)條件：953min；9430sec，5030sec，721min，共30個循環(huán)；循環(huán)完后72℃延伸10min；4℃保存。5μlPCR1PCR產(chǎn)物采用小量DN段快速膠回收試劑盒回收純化，具體操作見試劑盒說明書?；厥蘸笕?μl電泳鑒定，其余置于-20℃保存?zhèn)溆?。pMD19-T-DHFR-L22R的構(gòu)EcoRINotIpMD19-T-DHFR(1-96bp)PCR純化后的DHFR（97-468bp），膠回收試劑盒回收。16℃連接過夜，取連接產(chǎn)8μlInoueE.coliJM109100μl細(xì)菌中，涂布于氨芐抗并經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切鑒定，篩選陽性克隆后證實(shí)，命名為PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R真核表達(dá)載體的構(gòu)建NheI和MluIpMD19-T-gC1質(zhì)粒，MluIXbaI雙酶切分別膠回收獲取gC1、IRES和DHFR-L22R全長，先后克隆入PCI-neo-MARs-mCMV載體，酶切鑒定篩選陽性克隆，命名為真核細(xì)胞CHO-K1Sp2/0G418MTX的敏感度確700g/ml、800g/ml、900g/ml、1000g/mlCHO-K1的生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞系與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞系的建立與篩選夜，觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%~95%時做轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000reagent脂轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R和空載體質(zhì)粒各10g分別與10L的Lipofectamine2000reagent混合后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后換成含10％新生牛（無抗生素）的RPMI1640培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后換含終濃度為800mg/L的G418完全培養(yǎng)基篩選15-25天，待有新的抗性細(xì)胞克為800mg/L的G418、300nmol/L的MTX完全培養(yǎng)基篩選3周左右，按照BIO-RAD公司提供的蛋白Slotblot檢測說明書進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清中蛋白檢隆化，適時進(jìn)行換液及蛋白Slotblot檢測，取高表達(dá)陽性單克隆孔繼續(xù)進(jìn)行再次克隆化，檢測取高表達(dá)陽性單克隆孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入25cm23×105~5×105Sp2/0細(xì)胞690%~95%時做轉(zhuǎn)染，方法同上。轉(zhuǎn)染48h后換含終濃度為250mg/L的G418完全培養(yǎng)基篩選15-25天，待有新的抗性細(xì)胞克隆生長起來，將新的抗性細(xì)胞鋪于96250mg/LG418、20nmol/LMTX完全培養(yǎng)基3BIO-RADSlotblot檢測說明書進(jìn)行細(xì)CHO-K1Sp2/025cm2培養(yǎng)瓶中長滿后，其中2/3凍存，剩余1/3繼續(xù)培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的無培養(yǎng)：將CHO-K1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系與Sp2/0穩(wěn)20mL30K1mLHisNiSepharose純化填料進(jìn)行純化，收集的洗脫液用8%的分離膠做SDS。每孔上樣量約為15μl，電泳完后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST漂洗膜3.0SDS檢測目的蛋白gC-收集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清80ml，用30K超濾管超濾2mL，并用HisNiSepharose純化填料進(jìn)行純化，收集的洗脫液用8%的分離膠跑SDS，然后用考藍(lán)R-250染色液染色20min，之后換脫色液脫結(jié)HSV-1gC優(yōu)化結(jié)我們對gC-1進(jìn)行了全序列優(yōu)化，將真核細(xì)胞編碼使用率較低的密κ輕鏈前導(dǎo)肽序列替換了原的前導(dǎo)肽序列，促進(jìn)表達(dá)蛋白的分泌，改變的編碼數(shù)約占總數(shù)的20％。原序列與優(yōu)化序列比對如下：第一行是GenBank中HSV-1組序列（序列號NC_001806第重組質(zhì)粒PCI-neo-MARs-mCMV酶切鑒定BglNhe4700bp大小的條帶，MARs-mCMVPCI-neo載體的啟動子hCMV（見圖4）。M:DNAwiderangeL1:PCI-neo-MARs-mCMVdigestedbyBglⅡandNheⅠ圖4PCI-neo-MARs-mCMV重組質(zhì)粒酶切鑒定圖Fig.4Restrictiveenzymedigestionysis binantDHFR（97-468bp）的PCR結(jié)為450bp，與預(yù)期大小一致（見圖5M:100bpmarker 圖5DHFR（97-468bp）PCR結(jié)果Fig.5PCRproductofDHFR(97-PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR- 真核表達(dá)載體的構(gòu)建MARs-mCMV片段、HSVgC1、IRES和DHFR-L22RPCI-neoIRES的兩端（6 Nhe Mlu Xba Sal圖6PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R重組質(zhì)粒Fig.6SchematicfiguresofPCI-neo-MARs-mCMV-真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定7L1NheIMluI1400bp大小的條帶，L2XbaISalI雙酶切出600bp大小的條帶，與預(yù)期573bp條帶相符，即目的片段DHFR-L22R大小并經(jīng)證實(shí)；L3是MluI和XbaI雙酶切出約700bp大小的條帶，即IRES大??；HindIII和EcoRI單切

M1:DNAwiderangemarker；M2:200bpLadderL1:NheIMluI雙酶切重組質(zhì)粒；L2:XbaISalIL3:MluIXbaI雙酶切重組質(zhì)粒；L4:HindIIIL5:EcoRI單切重組質(zhì)粒圖7PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R重組質(zhì)粒酶切鑒Fig.7Restrictiveenzymedigestionysis binant真核細(xì)胞CHO-K1Sp2/0G418MTX的敏感度確300M；Sp2/0G418250g/ml，MTX篩選時用濃度為20M。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩用PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后G418MTX3Slotblot檢測篩88SlotblotCHO-K1細(xì)胞高表達(dá)孔B1E4Fig.8StableandhighlevelexpressionofHSV-1gCgeneinCHO-K1cellE6、G3、G5G6（9E6、G3、G5和G6進(jìn)行兩次亞克隆，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)細(xì)胞系。Fig.9StableandhighlevelexpressionofHSV-1gCgeneinSp2/0cell用Westernblot分析PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R真核100,000處出現(xiàn)目標(biāo)條帶（10），Mr105,000gC-1糖并不是其全長。M：Marker；1：gC蛋白樣；2：空載體對照10HSV-1gCWesternblot檢測結(jié)果Fig.10TheWesternblotysisofexpressedHSV-1gCSDS結(jié)果M：Marker；1：gC蛋白樣；2：空載體對照11HSV-1gC蛋白SDS結(jié)果Fig.11SDS- ysisofthepurifiedHSV-1gC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系穩(wěn)定性檢測和無培養(yǎng)，可以大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，穩(wěn)轉(zhuǎn)Sp2/0細(xì)胞系無培養(yǎng)，狀態(tài)較差，還需討關(guān)于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于哺乳動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，外源在哺需的元件。外源在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)包括的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)效果好，CHO細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞均具有以上特點(diǎn)，所以被（tPA）、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、表面抗原（HBsAg）、干擾素胞中得到表達(dá)。在已的大約73種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的有35種，CHO細(xì)胞培養(yǎng)的就占27種，還有一些是用Sp2/0細(xì)胞HSVgC的表達(dá)比較，早期的研究表達(dá)gC的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系甚至需要用HSV細(xì)胞進(jìn)行輔助才能獲得蛋白，雖然用昆蟲細(xì)胞表達(dá)可以部關(guān)于載體本研究為提高HSVgC的表達(dá)效果采取了多項措施，首先我們對真核表同時在載體中克隆入核基質(zhì)附著區(qū)(MatrixAttaentRegions,MARs)，其是真核生物染色質(zhì)中與核基質(zhì)(或核骨架)特異結(jié)合的DNA序列，此序列也有很大降低，pH7.65時只有野生型的1/4,000，pH值接近5時才與野生型相的表達(dá)低，如不考慮其他因素，理論上只有DHFR表達(dá)量較高的細(xì)胞才細(xì)胞幾乎不能形成抗MTX的細(xì)胞克隆，而轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以表達(dá)DHFR-關(guān)于無培成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的替代成分，使培題。進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，新的無培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)growthfactor,EGF）等，不少細(xì)胞即能在無供應(yīng)的情況下生長，尤其是本實(shí)驗(yàn)中CHO細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系均用無無動物組分培養(yǎng)基培養(yǎng)，CHO細(xì)胞基本能適應(yīng)無培養(yǎng)基，但Sp2/0細(xì)胞大部分關(guān)于HSVgC-HSV-1gC是編碼的免疫逃避分子之一：gC-1可以直接結(jié)合補(bǔ)體C3b，進(jìn)而抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的中和反應(yīng)[56]Hook等選用HSV-1陽性、HSV-的患者研究HSVgC和gE對中和的影響，結(jié)果顯示對gC/gE突變的中和能力要強(qiáng)于對野生型的中和能力，說明HSVgC和用HSVgC-1免疫小鼠提取的免疫球蛋白（Ig）可gC-1與C3b的結(jié)合，用1×106PFUHSV-1小鼠，未免疫的小鼠全部，10ng和50nggD單獨(dú)免疫保護(hù)率分別為60％和90％，而10μggC和10ng或50nggD聯(lián)合免疫保護(hù)本研究表達(dá)的分泌型HSVgC-1在Slotblot條件下可以和本室前期的性，用抗His抗體進(jìn)行Westernblot檢測可以檢測出一Mr為100000的蛋白，天然HSVgC-1Mr為120,000左右，根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)的Mr為69,000，分子量區(qū)，去除了gC-1的C端54個氨基酸殘此該表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)小于天然gC-1，他條帶，以上均結(jié)果說明我們的表達(dá)產(chǎn)物比較完整。雖然我們已成功地用CHO-K1細(xì)胞表達(dá)了HSV可溶性gC-1，且目前已經(jīng)獲得能用SDS檢測 構(gòu)建了含HSV-1gC蛋白與DHFR-L22R的真核表達(dá)載PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22RgC-1蛋白CHO-K1Sp2/0細(xì)胞系，且其His-Ni瓊脂糖填料進(jìn)行目的蛋白gC-1，且其具有良好的特異性結(jié)合活性。參考文谷鴻喜,.醫(yī)學(xué)微生物學(xué).第一版,醫(yī)學(xué),2008:賈文祥,,,等.醫(yī)學(xué)微生物學(xué).第一版,:人民衛(wèi),2009:395-SitaAwasthiJohnM,LubinskiRoselynJ,etal.AnHSV-1gDmutantasanentry-impairedlivevaccine.Vaccine,2008,26(9):1195-1203.CoreyL,LangenbergAG,AshleyR. binantglycoproteinvaccineforthepreventionofgenitalHSV-2infection:tworandomizedcontrolledtrials.JAMA,1999,282(4):331-340. 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