不同刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞中PD

不同剌激劑對(duì)淋巴細(xì)胞中PD-1與TIM3蛋白表達(dá)的影響李凌;來(lái)芳芳;杜婷婷;張森;劉盈;陳曉光【期刊名稱】《《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)》》【年(卷)，期】2019(014)002【總頁(yè)數(shù)】9頁(yè)(P127-135)【關(guān)鍵詞】程序性細(xì)胞死亡受體1;T細(xì)胞免疫球蛋白黏液素3;淋巴細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)【作者】李凌;來(lái)芳芳;杜婷婷;張森;劉盈;陳曉光【作者單位】100050北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室【正文語(yǔ)種】中文目的研究不同刺激劑對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞中PD-1與TIM3蛋白表達(dá)的影響。方法采用密度離心法分離人外周血淋巴細(xì)胞，并通過(guò)Westernblot檢測(cè)在抗CD3/CD28抗體、PHA、SEB、ConA4種不同刺激劑下人外周血淋巴細(xì)胞PD-1與TIM3總蛋白的變化情況，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)4種刺激條件下T淋巴細(xì)胞及其CD3+CD4+、CD3+CD8+亞群膜表面的PD-1與TIM3的改變。結(jié)果Westernblot結(jié)果顯示，4種刺激劑均能刺激總的PD-1蛋白的表達(dá)，減少總TIM3蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞分析儀結(jié)果顯示，在4種刺激劑作用下，人外周血T淋巴細(xì)胞表面及其CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞亞群膜表面的PD-1與TIM3蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。結(jié)論4種常見(jiàn)刺激劑均可誘導(dǎo)總PD-1蛋白和細(xì)胞膜上PD-1蛋白的表達(dá)，降低TIM3總蛋白的表達(dá)以及誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表面TIM3蛋白的表達(dá)。其中PHA較其他3種刺激劑展現(xiàn)出較好的劑量關(guān)系。腫瘤免疫療法是繼傳統(tǒng)的腫瘤治療，即化療、放療和手術(shù)切除之后的第四種腫瘤治療方法［1］，其通過(guò)重新啟動(dòng)并維持腫瘤-免疫循環(huán)，恢復(fù)機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng)。近年來(lái)，針對(duì)以程序性細(xì)胞死亡受體1(programmedcelldeathprotein1，PD-1)為代表的免疫檢查點(diǎn)的治療，已成為一種重要而有效的免疫療法［2］。PD-1是一種在激活的淋巴細(xì)胞上表達(dá)的抑制性受體，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的程序性細(xì)胞死亡配體1(programmedcelldeathligand1，PD-L1)結(jié)合，調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［3-4］。T細(xì)胞免疫球蛋白黏液素3(Tcellimmunoglobulinandmucin3，TIM3)是細(xì)胞表面膜蛋白［5-6］，通過(guò)與其配體半乳糖凝集素9(galectin9，Gal-9)的結(jié)合，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞耗竭或凋亡［7］。在腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)過(guò)程中，通過(guò)某種特定的刺激劑激活T淋巴細(xì)胞的增殖與活化是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法［8］。因此，本文選用4種刺激劑，即抗CD3/CD28抗體(anti-CD3/CD28antibody)、植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)、金黃色葡萄球菌B型腸毒素(StaphylococcusaureusEnterotoxinB，SEB)、刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)刺激人外周T淋巴細(xì)胞的增殖，以免疫檢查點(diǎn)PD-1和TIM3作為研究對(duì)象，研究在T淋巴細(xì)胞增殖狀態(tài)下PD-1與TIM3兩種蛋白的變化情況，為探究PD-1與TIM3的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.1.1研究樣本健康志愿者的抗凝全血由中國(guó)食品藥品檢定研究院贈(zèng)予。1.1.2試劑人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；PHA、SEB和ConA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；人源抗CD3、CD28抗體購(gòu)自美國(guó)MiltenyiBiotec公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FITC抗人CD3抗體、PE抗人CD4抗體、APC抗人CD8抗體、PE/Cy7抗人PD-1抗體和APC/Cy7抗人TIM3抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京碧云天生物技術(shù)有限公司。1.1.3儀器FACSVerse流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品；冷凍離心機(jī)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。1.2.1淋巴細(xì)胞的制備將健康志愿者的新鮮抗凝血與等體積的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混合稀釋，再緩慢加至一定體積的淋巴細(xì)胞分離液上方，保持兩液面界面清晰（分離液、抗凝未經(jīng)稀釋的全血、PBS體積比為1:1:1）。于室溫，以800xg離心30min。離心結(jié)束后，小心吸取中間的一層薄而致密的白膜（淋巴細(xì)胞層）至另一層離心管中，用PBS重懸洗滌2次，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1x108個(gè)/ml。1.2.2不同刺激劑刺激淋巴細(xì)胞將上述細(xì)胞接種至12孑L細(xì)胞培養(yǎng)板中，于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，分別在每孔加入不同劑量的刺激劑，抗CD3/CD28抗體（終濃度：0.001、0.01.0.1pg/ml）.PHA（終濃度：0.2、1、5|jg/ml）、SEB（終濃度：10、50、250ng/ml）、ConA（終濃度：0.125、0.5、2pg/ml）,每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行孔，置于37C5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48和72h。1.2.3Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)變化總蛋白提取將處理過(guò)的細(xì)胞收集到空EP管中，450xg離心5min，收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入適量RIPA裂解液(10mmol/LTris-HClpH7.4、5mmol/LEDTA、1%TritonX-100、150mmol/LNaCl、0.1mmol/LPMSF)后冰上裂解1h后，于4°C、12000r/min離心25min，收集上清液，進(jìn)行蛋白定量。蛋白含量的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明，梯度稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品，96孔板中每孔加入10pl標(biāo)品液及待測(cè)樣品液，再加入100pl的A、B混合液(A:B=50:1),輕輕振蕩混勻后放置于37°C孵箱孵育30min，于595nm波長(zhǎng)測(cè)定標(biāo)品和樣品的光密度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將測(cè)得各樣品的光密度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品的蛋白濃度。SDS電泳與轉(zhuǎn)膜配制5%的濃縮膠和10%的分離膠。將上述已測(cè)定完成蛋白含量的樣品稀釋至同一濃度，與5xSDS上樣緩沖液混合，煮沸冷卻后上樣，每孔蛋白上樣量為30pg,采用恒壓80V電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒定電壓100V于冰水浴中轉(zhuǎn)移100min。免疫雜交和顯影將電轉(zhuǎn)后的PVDF膜用加入5%脫脂奶粉的含有0.05%Tween-20的Tris鹽緩沖液(TBS-T)室溫封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)30min。加入合適稀釋比例(1:500~1:1000)的一抗，4C孵育過(guò)夜。第二天，TBS-T緩沖液洗膜3次，每次5min。加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h。用TBS-T緩沖液清洗膜3次，每次10min。加入ECL化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液，于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)顯影并保存圖像，用ImageJ對(duì)目的條帶的灰度值進(jìn)行分析，并以p-actin為內(nèi)參，對(duì)目的條帶的表達(dá)量進(jìn)行定量分析并統(tǒng)計(jì)。1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)變化流式抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞收集1.2.2中培養(yǎng)72h的淋巴細(xì)胞，取106個(gè)細(xì)胞于EP管中，450xg離心5min，以預(yù)冷的PBS洗2次，棄上清后PBS重懸細(xì)胞，每管按抗體說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量的CD3、CD4、CD8、PD-1、TIM3流式抗體，避光冰上染色1h，然后加入1mlPBS終止染色。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面PD-1與TIM3蛋白改變將染色后細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，并用200plPBS重懸，采用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面PD-1與TIM3表面蛋白的表達(dá)情況。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用表示，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用ImageJ對(duì)目的條帶的灰度值進(jìn)行分析，并以p-actin為內(nèi)參，對(duì)目的條帶的表達(dá)量進(jìn)行定量分析并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1。在抗CD3/CD28抗體、PHA、SEB以及ConA的刺激下，人外周血淋巴細(xì)胞的PD-1表達(dá)均有上調(diào)，TIM3表達(dá)均有下調(diào)。其中在PHA刺激下，條帶展現(xiàn)出劑量依賴性地促進(jìn)PD-1的表達(dá)，在PHA5pg/ml濃度的刺激下，PD-1上調(diào)最為明顯。SEB相比于其他3種刺激劑可更為明顯地抑制TIM3的表達(dá)。為觀察刺激時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)PD-1與TIM3總蛋白的影響，分別于48和72h時(shí)對(duì)目的蛋白收樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，在PHA及ConA刺激下，相比于48h,72h表現(xiàn)出更好的劑量依賴性上調(diào)PD-1和抑制TIM3表達(dá)作用。以CD3+FITC流式抗體標(biāo)識(shí)T淋巴細(xì)胞，對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。采用Flowjo7.6軟件對(duì)T淋巴細(xì)胞表面PD-1蛋白的改變進(jìn)行分析。如圖2A和2C所示，隨著抗CD3/CD28抗體濃度由0.001pg/ml增加至0.1pg/ml,PE-CY7熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度由未加刺激的199±3增加至1146±156,PD-1表達(dá)上調(diào)。隨著PHA濃度由0.2pg/ml增加至5pg/ml,PE-CY7熒光強(qiáng)度(240±17.1161±127.2257.5±209.5)逐漸增強(qiáng)，PD-1蛋白表達(dá)逐漸增多，并表現(xiàn)出劑量依賴性。隨著SEB濃度由10ng/ml增加至250ng/ml,PE-CY7熒光強(qiáng)度(1408.5±176.5.1962±85.2260±130)逐漸增強(qiáng)，提示較少的劑量即可顯著上調(diào)PD-1的表達(dá)，其最高劑量與PHA5pg/ml刺激后效果相當(dāng)。隨著ConA濃度由0.125pg/ml增加至2pg/ml,PE-CY7熒光強(qiáng)度分別為740±142.1597.5±104.5.2048.5±105.5,PD-1表達(dá)依次上調(diào)。綜上，在PHA與ConA的刺激下，PD-1表達(dá)上調(diào)有明顯劑量依賴性，PHA.SEB.ConA此3種刺激劑上調(diào)PD-1表達(dá)最為顯著。以CD3+FITC流式抗體標(biāo)識(shí)T淋巴細(xì)胞，對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。采用Flowjo7.6軟件對(duì)T淋巴細(xì)胞表面TIM3蛋白的改變進(jìn)行分析。如圖2B和2D所示，隨著抗CD3/CD28抗體濃度由0.001pg/ml增加至0.1pg/ml,APC-Cy7熒光強(qiáng)度由未刺激的167±12增加至308±25,提示TIM3蛋白表達(dá)的上調(diào)。隨著PHA濃度由0.2pg/ml增加至5pg/ml,APC-Cy7熒光強(qiáng)度(207±12.515±63.889.5±59.5)依次增強(qiáng)，TIM3蛋白顯現(xiàn)出較好的劑量依賴性增強(qiáng)。隨著SEB濃度由10ng/ml增加至250ng/ml,APC-Cy7熒光強(qiáng)度(601±40.734.5±66.5.1092.5±96.5)逐漸增強(qiáng)，TIM3表達(dá)顯著上調(diào)。隨著ConA濃度由0.125pg/ml增加至2pg/ml,APC-Cy7熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)增強(qiáng)，分別為214.5±21.5.439±40.721±72,表明TIM3蛋白隨刺激濃度增加表達(dá)上調(diào)。其中SEB250ng/ml時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)最為顯著，對(duì)TIM3誘導(dǎo)上調(diào)作用最強(qiáng)。輔助T細(xì)胞(helperTcell,Th細(xì)胞)在免疫反應(yīng)中扮演中間過(guò)程的角色，它可以增生擴(kuò)散來(lái)激活其他類型的產(chǎn)生直接免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控或輔助其他淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能，是已知的HIV的目標(biāo)細(xì)胞，在艾滋病發(fā)病時(shí)會(huì)急劇減少。其主要表面標(biāo)志是CD4。因而在流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)以CD3+FITCCD4+PE來(lái)標(biāo)識(shí)人外周血淋巴細(xì)胞中的輔助T細(xì)胞。采用Flowjo7.6軟件對(duì)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面TIM3蛋白的改變進(jìn)行分析。如圖3所示，4種刺激劑對(duì)CD3+CD4+表面的PD-1與TIM3蛋白表達(dá)都有上調(diào)作用，其中，抗CD3/CD28抗體在0.001pg/ml即可表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)PD-1上調(diào)作用，但對(duì)TIM3的改變并不明顯。PHA濃度在0.2pg/ml時(shí)上調(diào)PD-1.TIM3的作用均不顯著，但濃度升高為5pg/ml時(shí)，PD1.TIM3熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，表達(dá)增多。SEB于較低劑量即可展現(xiàn)出對(duì)PD-1蛋白與TIM3蛋白表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)作用，且有劑量依賴性的升高。ConA的誘導(dǎo)作用較PHA更好。細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxicTcell,CTL)，也被稱為殺傷性T細(xì)胞。在免疫反應(yīng)中扮演重要作用，尤其是在消滅受感染細(xì)胞的過(guò)程中，可對(duì)其產(chǎn)生特殊抗原反應(yīng)的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行殺滅。細(xì)胞毒T細(xì)胞的主要表面標(biāo)志是CD8+，因而在流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)時(shí)以CD3+FITC和CD8+APC來(lái)標(biāo)識(shí)人外周血淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞毒T細(xì)胞。采用Flowjo7.6軟件對(duì)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1與TIM3蛋白的改變進(jìn)行分析。如圖4所示，4種刺激劑對(duì)CD3+CD8+表面的PD-1與TIM3蛋白表達(dá)都有上調(diào)作用。其中PHA在1pg/ml與5pg/ml.SEB在50ng/ml和250ng/ml、ConA在2pg/ml時(shí)可顯著誘導(dǎo)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。4種刺激劑對(duì)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面的TIM3蛋白的改變強(qiáng)于對(duì)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的改變，其誘導(dǎo)作用隨濃度增加而增強(qiáng)。近年來(lái)，針對(duì)PD-1與PD-L1免疫檢查點(diǎn)的阻斷劑已被證明在多種癌癥類型治療過(guò)程中顯著改善了腫瘤患者的臨床進(jìn)展和不良預(yù)后?，F(xiàn)已有多種PD-1/PD-L1藥物已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，如Keytruda、Opdivo、Tecentriq等［9］。盡管針對(duì)PD-1/PD-L1的免疫檢查點(diǎn)抗體具有令人驚嘆的抗腫瘤活性，但對(duì)其治療后產(chǎn)生的抗性也逐漸引起人們重視，有研究指出其適應(yīng)性耐藥的機(jī)制源于T細(xì)胞表面替代性免疫檢查點(diǎn)的上調(diào)，尤其是TIM3。許多數(shù)據(jù)已表明TIM3等免疫檢查點(diǎn)的上調(diào)可能是與對(duì)PD-1阻斷治療后產(chǎn)生適應(yīng)性抗性相關(guān)的靶向的生物標(biāo)志物［10］。并有研究指出，TIM3與PD-1阻斷劑的聯(lián)合應(yīng)用可以在抗腫瘤治療中取得更好的療效［11］。然而，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道在淋巴細(xì)胞激活狀態(tài)下免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1與TIM3蛋白表達(dá)的變化。因此，探索兩者的關(guān)系對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)T細(xì)胞的激活機(jī)制和腫瘤免疫治療聯(lián)合用藥尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用人外周血提取獲得淋巴細(xì)胞，在現(xiàn)有常規(guī)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)常用的4種刺激劑在刺激T細(xì)胞增殖后其細(xì)胞PD-1與TIM3蛋白的變化情況進(jìn)行了觀察，并采用流式細(xì)胞儀對(duì)增殖后的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群分析，較為細(xì)致地研究了CD3+CD4+T細(xì)胞與CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-1與TIM3蛋白水平的改變。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論何種刺激劑都可以引起淋巴細(xì)胞PD-1總蛋白的上調(diào)和TIM3總蛋白的下調(diào)。其中SEB表現(xiàn)出顯著抑制TIM3總蛋白表達(dá)的能力，PHA在上調(diào)PD-1蛋白與抑制TIM3蛋白中展現(xiàn)出其較好的劑量依賴性，在5pg/ml時(shí)其作用效果最強(qiáng)。抗CD3/CD28抗體通過(guò)體外模擬特異性T淋巴細(xì)胞活化的第一信號(hào)和第二信號(hào)，可激活淋巴細(xì)胞，但其對(duì)淋巴細(xì)胞PD-1的誘導(dǎo)作用并不強(qiáng)。ConA為促細(xì)胞有絲分裂素，主要對(duì)T淋巴細(xì)胞有激發(fā)作用，在實(shí)驗(yàn)中常用于鼠類T細(xì)胞的激活，在本實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)出較好的刺激活性與劑量依賴性。已有報(bào)道指出，PD-1作為負(fù)性協(xié)同刺激分子受體，可在活化的T、B和NK等細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)[12],這與本實(shí)驗(yàn)中蛋白免疫印跡法得到的結(jié)果一致。在流式細(xì)胞技術(shù)的分析中可以觀察到，在人外周血淋巴細(xì)胞中，PD-1表面蛋白顯著上調(diào)。為進(jìn)一步細(xì)化該蛋白表達(dá)在不同類型T細(xì)胞中的變化趨勢(shì)，我們選用CD4與CD8流式抗體進(jìn)一步對(duì)所提取的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群，即輔助性T細(xì)胞群和殺傷性T細(xì)胞群。在對(duì)不同亞群的流式分析中我們可以看到，CD3+CD4+T細(xì)胞與CD3+CD8+T細(xì)胞在4種刺激劑的誘導(dǎo)作用下，表面的PD-1蛋白熒光強(qiáng)度均有顯著增強(qiáng)，其中PHA與ConA的量效關(guān)系最為明顯。值得注意的是，T淋巴細(xì)胞表面的TIM3蛋白在4種刺激劑的作用下均顯示熒光增強(qiáng)，即蛋白水平上調(diào)。再進(jìn)一步對(duì)T淋巴細(xì)胞分群后的檢測(cè)結(jié)果顯示，TIM3蛋白在CD3+CD4+與CD3+CD8+T細(xì)胞上也有上調(diào)。目前，已有許多研究表明，腫瘤患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的PD-1顯示出上調(diào)，與此同時(shí)，TIM3蛋白也展示出同樣的上調(diào)表達(dá)，PD-1與TIM3共表達(dá)于腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的CD8+細(xì)胞上，使殺傷性T細(xì)胞減少I(mǎi)FN-y、TNF和IL-12的產(chǎn)生，介導(dǎo)T細(xì)胞功能的耗竭與免疫耐受[11,13-14],本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，膜表面PD-1的上調(diào)伴隨有TIM3的上調(diào)表達(dá)。這提示我們臨床上使用PD-1/PD-L1阻斷劑的同時(shí)應(yīng)用TIM3/Gal-9的阻斷劑是有意義的。雙重阻斷PD-1與TIM3信號(hào)可有效幫助衰竭T細(xì)胞，促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中，TIM3表面蛋白的上調(diào)與通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)的總TIM3的下調(diào)結(jié)果相反，推測(cè)T淋巴細(xì)胞在刺激劑的刺激作用下TIM3可能發(fā)生了細(xì)胞水平的定位改變。有文獻(xiàn)指出，細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，都依賴于蛋白質(zhì)空間位置的變化和運(yùn)動(dòng)，成熟的蛋白質(zhì)必須在特定的細(xì)胞部位才能發(fā)揮其生物學(xué)功能［15］。而本實(shí)驗(yàn)中，TIM3總蛋白減少與細(xì)胞膜表面蛋白增加的改變，可能與TIM3的功能活性相關(guān)，但究竟細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的TIM3在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮怎樣的作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。ObjectiveTostudytheeffectsofdifferentstimulatorsonPD-1andTIM3expressioninhumanperipheralbloodlymphocytes.MethodsHumanperipheralbloodlymphocyteswereisolatedbydensitycentrifugation.Fourdifferentstimulatorsusedareanti-CD3/CD28antibody,PHA,SEBandConA,respectively.TotalPD-1andTIM3expressioninhumanperipheralbloodlymphocytesunderfourdifferentconditionswereevaluatedbyWesternblot,whilePD-1andTIM3expressiononthemembraneweredetectedbyflowcytometry.ResultsWesternblotresultsindicatedthattotalPD-1expressionwasincreased,whiletotalTIM3expressionwasdecreasedupontreatmentwithallthefourstimulatorsinTlymphocytes.However,FlowcytometryresultsindicatedthatPD-1andTIM3expressionontheTlymphocytesmembranewereincreasedunderthesefourconditions.WealsonoticedthatPD-1andTIM3expressionwereup-regulatedinTcellsubpopulationCD3+CD4+,CD3+CD8+cells.ConclusionAllthefourcommonstimulatorscouldinducePD-1andTIM3expressiononthemembrane,whiletotalexpressionoftheproteinsshowsdifferentexpressionpattern.Comparedwithotherstimulators,PHAinducesbetterdose-dependentresponseinhumanperipheralbloodlymphocytes.【相關(guān)文獻(xiàn)】GalluzziL,VacchelliE,Bravo-SanPedroJM,etal.Classificationofcurrentanticancerimmunotherapies.Oncotarget,2014,5(24):12472-12508.Marin-AcevedoJA,SoyanoAE,DholariaB,etal.Cancerimmunotherapybeyondimmunecheckpointinhibitors.JHematolOncol,2018,11(1):8.KeirME,LiangSC,GuleriaI,etal.TissueexpressionofPD-L1mediatesperipheralTcelltolerance.JExpMed,2006,203(4):883-895.OkazakiT,HonjoT.ThePD-1-PD-Lpathwayinimmunologicaltolerance.TrendsImmunol,2006,27(4):195-201.MonneyL,SabatosCA,GagliaJL,etal.Th1-specificcellsurfaceproteinTim-3regulatesmacrophageactivationandseverityofanautoimmunedisease.Nature,2002,415(6871):536-541.HastingsWD,AndersonDE,KassamN,etal.TIM-3isexpressedonactivatedhumanCD4+TcellsandregulatesTh1andTh17cytokines.CentEurJImmunol,2009,39(9):2492-2501.ZhuC,AndersonAC,SchubartA,etal.TheTim-3ligandgalectin-9negativelyregulatesThelpertype1immunity.NatImmunol,2005,6(12):1245-1252.XueNN,DongK,LaiFF,etal.CFSE-labeledproliferativeassaysforassessmentofTcellfunctioninducedbydifferentstimulants.JHarbinUnivCommerce(NatSciEd),2017,33(2):129-134.(inChinese)薛妮娜,董凱,來(lái)芳芳，等.CFSE法檢測(cè)刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞增殖與活化.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,33(2):129-134.PageDB,PostowMA,CallahanMK