谷胱甘肽還原酶活性的測定

谷胱甘肽還原酶活性的測定一、目的要求學習果蔬組織中谷胱甘肽還原酶活性的測定原理和方法。二、基本原理谷胱甘肽還原酶（Glutathionereductase，GR）是一種黃素酶，每分子酶蛋白含有一分子的黃素腺嘌呤二酸（FAD）。谷胱甘肽還原酶在許多組織中都有分布，維持細胞內充足的還原型谷胱甘肽（GSH）水平。還原型谷胱甘肽（GSH）可使含巰基（-SH）的蛋白質或酶處于還原狀態(tài)或活性狀態(tài)，對于維持蛋白質或酶的正常功能，維持細胞內較高的還原勢具有很大意義。在還原型輔酶Ⅱ（Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate[reducedform]，NADPH）提供氫的條件下，GR能將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成還原型谷胱甘肽（GSH），同時，NADPH形成NADP+。反應式如下：NADPH在波長340nm處有吸收峰，因此可以通過測定OD340的減小來計算谷胱甘肽還原酶的活性。三、材料、儀器及試劑（一）材料各種水果和蔬菜（如梨、馬鈴薯）。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、試管、計時器、水浴鍋、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）、紫外分光光度計。（三）試劑1．100mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液（含1mmol/LEDTA），母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：稱取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：稱取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸餾水溶解，定容至1000mL。取84.0mL母液A和16.0mL母液B混合后，調節(jié)pH至7.5，然后稀釋至200mL，即為100mmol/L、pH7.5磷酸緩沖液。稱取29.2mgEDTA，用100mmol/L、pH7.5磷酸緩沖液溶解、定容至100mL即可。2．5mmol/LGSSG溶液稱取20.3mgGSSG，用蒸餾水溶解、定容至10mL。配制成GSSG溶液后，適當分裝，于-20℃保存，或者4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。3．4mmol/LNADPH溶液稱取33mgNADPH-Na4，用蒸餾水溶解、定容至10mL。所配得溶液宜于-70℃保存。四、實驗步驟（一）酶液制備稱取5.0g果蔬樣品置于經(jīng)預冷的研缽中，加入5.0mL經(jīng)4℃預冷的100mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液（含1mmol/LEDTA），冰浴研磨勻漿后，于4℃、12000×g離心30min，收集上清液用于酶活性測定。（二）活性測定取1支試管，依次加入2.7mL100mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液（含1mmol/LEDTA）、0.1mL5mmol/LGSSG溶液和0.2mL酶液。最后加入40μL4mmol/LNADPH溶液以啟動酶促反應，立即混合，并開始計時。對分光光度計進行調零，從啟動后15s開始測定、記錄反應混合液在波長340nm處的吸光度值，每隔30秒記錄一次OD340值，至少連續(xù)測定3分鐘，獲得6個點的數(shù)據(jù)。實驗重復三次。五、實驗結果與計算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復次數(shù)樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)340nm吸光度值樣品中GR活性(0.01△OD340·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD340計算值平均值±標準偏差1232．計算結果記錄反應體系在波長340nm處的吸光度值，制作OD340值隨時間變化曲線，根據(jù)曲線的初始線性部分計算每分鐘吸光度變化值△OD340。谷胱甘肽還原酶（GR）活性以測定條件下每分鐘每克鮮重（FW）果蔬樣品反應體系在340nm吸光度值減少0.01時為一個酶活性單位（U），即U=0.01△OD340·min-1·g-1FW。計算公式：式中：△OD340——反應混合液吸光度值的變化；△t——酶促反應時間，min；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；W——樣品重量，g。也可以用每分鐘反應體系吸光度值減小0.01所需的酶量為1個酶活性單位（U），表示為0.01△OD340·min-1·mg-1蛋白質。六、注意事項1．配制的NADPH溶液宜立即于-70℃保存。在4℃可以保存一天；在-20℃保存一周后NADPH會減少10%以上。2．一