腫瘤血管生成及其檢測實用版課件

腫瘤血管生成及其檢測腫瘤血管生成及其檢測1（優(yōu)選）腫瘤血管生成及其檢測（優(yōu)選）腫瘤血管生成及其檢測2腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實現(xiàn)的，并在腫瘤的生長和擴(kuò)散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。已有研究證明，腫瘤血管生成活躍程度對組織病理分級、放射治療以及在預(yù)后判斷上都有重要的評估價值。

腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogene3第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程一、血管生成現(xiàn)象(一)血管生成的概念1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對血管生成重要性的認(rèn)識，特別是提出“腫瘤生長依賴于血管生成”觀點，始于1971年Folkman對腫瘤血管生成的研究報道。

第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程4血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis)

(二)血管生成的研究方法雞胚絨毛尿囊膜試驗角膜移植實驗血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouti5開窗實驗動物移植瘤等在體模型三維膠分析法細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)等離體模型識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05血管生成因子:VEGF及其受體家族FGF家族及其受體Ang和Tie受體家族Angiotropin血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PDECGF)

開窗實驗6二．腫瘤血管生成的基本過程(一)血管生成的基本過程血管生成的基本步驟是①血管生成因子的產(chǎn)生過多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；②血管部位細(xì)胞外基質(zhì)改變、基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞芽生、增殖和遷移；二．腫瘤血管生成的基本過程7③新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫通。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、脫離基底膜和血管壁細(xì)胞改變可能是血管消退的主要病理學(xué)事件。(二)腫瘤血管生成的過程1．腫瘤生長的階段性

①無血管期(avascularphase)或稱血管前期(prevascularphase)

腫瘤直徑不超過1～2mm

③新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；82．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認(rèn)為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；(五)其他血管生成因子腫瘤直徑不超過1～2mm加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內(nèi)分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。棄一抗和1%BSA，用0.這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。01MPBS洗膜，5min×3次。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。二．腫瘤血管生成的基本過程(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。②血管期(vascularphase)腫瘤迅速生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移2.腫瘤血管的起源腫瘤中的血管可能有3種來源①血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細(xì)胞團(tuán)先處于無血管期生長，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)血管生成；另一種是瘤細(xì)胞先依賴宿主組織已存在的血管生長，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成②血管套疊性生長2．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生9③內(nèi)皮祖細(xì)胞3．腫瘤血管生成的過程

瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血管生成因子(VEGF等)

小血管毛細(xì)血管伸展內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成毛細(xì)血管芽新生毛細(xì)血管形成并連通③內(nèi)皮祖細(xì)胞10第二節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點區(qū)”(hotspots)，這也是進(jìn)行腫瘤微血管密度測定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。第二節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性11腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍然不完善。內(nèi)皮細(xì)胞～般比較幼稚，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細(xì)胞可直接與血管管腔相連。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。

腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)12不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內(nèi)分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細(xì)胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細(xì)胞癌等血管呈壁薄、明顯擴(kuò)張的血竇。不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同13以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有:①梭形內(nèi)皮細(xì)胞呈索狀排列，枝狀分布，有或無明顯的血管腔，呈原始、幼稚的微血管②內(nèi)皮細(xì)胞增生、肥大，管腔狹小，呈現(xiàn)厚壁血管③內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成球形血管壁內(nèi)血管．呈現(xiàn)“腎小球樣結(jié)構(gòu)”；④管腔大、管壁較薄的相對較大的微血管，并形成血管心假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)；⑤大量管壁退變和鈣化的新生血管；以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有:14⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；⑦血管內(nèi)皮區(qū)域性極度增生，呈片狀的梭形細(xì)胞，構(gòu)成“假肉瘤化”。二、腫瘤微血管的生物學(xué)特性①低反應(yīng)性②高通透性③低供氧能力

⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；154）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計入結(jié)果，單個的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個血管計數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細(xì)胞直徑的血管不計數(shù)。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，而VEGFR3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。該實驗?zāi)Ｐ筒恍枰油庠葱陨L因子，并用該模型檢測研究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構(gòu)體及其受體在原代血管生長及子代新生血管形成中的作用。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。Westernblot的過程分四階段很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。2．VEGF及其受體的作用:識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。太慢不均勻，特別是甘油。腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。④新生血管管腔的貫通。紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒。最近，VogelsteinB和KinzlerKW采用基因表達(dá)的系列分析(serialanalysisofgeneexpressionSAGE)方法，比較研究了結(jié)直腸癌和正常腸黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)．二者基因表達(dá)存在差異。他們得到了79種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子，其中TEM8僅表達(dá)于腫瘤內(nèi)皮而不表達(dá)于黃體形成中的內(nèi)皮細(xì)胞，提示腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。

4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。最近，16第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進(jìn)血管生成。組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。

第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制17一、血管生成因子血管生成的始動需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機(jī)械性因子均參與了血管生成過程。已知的血管生成因子有數(shù)十種，其中VEGF和Ang家族是已知的、特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，在血管生成中作用可能也是最為重要的。一、血管生成因子18(一)VEGF及其受體家族1．VEGF家族及其愛體VEGF又稱血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，為分子量34~45kD的同源二聚體糖蛋白，屬于堿性蛋白。VEGF基因通過轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個氨基酸組成。(一)VEGF及其受體家族19其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴(kuò)散力強(qiáng)，易于到達(dá)靶細(xì)胞。近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結(jié)構(gòu)上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤生長因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGFB(VEGF相關(guān)因子，VEGFrelatedfactor，VRF)，VEGFC(VEGF相關(guān)蛋白，VEGFrelatedprotein，VRP)，以及VEGFD／FIGF和VEGFE等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為20VEGF受體包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(Flk1／KDR)和VEGFR3(Flt4)2．VEGF及其受體的作用:早期血管的形成需要VEGF的調(diào)節(jié)，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGFA)通過其受體VEGFR1(Flt1)和VEGFR2(Flk1／KDR)促進(jìn)內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成.

VEGF受體包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(Fl21由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，而VEGFR3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中皆有過表達(dá)。VEGF及其受體在腫瘤中的表達(dá)常與腫瘤分化程度密切相關(guān)。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，22大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達(dá)，VEGF165VEGF121兩種VEGF最常見。在VEGF家族中，VEGFC和VEGD既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有研究報道，人體多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGFC。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C實，腫瘤細(xì)胞VEGFC的高表達(dá)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGFC和VEGFD還來源于浸潤的巨噬細(xì)胞。大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達(dá)，VEGF165VEG23缺氧是包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個強(qiáng)烈的誘導(dǎo)因子

離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達(dá)的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。多種癌基因的激活通過上調(diào)VEGF表達(dá)而誘導(dǎo)血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過程。

缺氧是包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個強(qiáng)烈的24(二)FGF家族及其受體1．FGF家族目前研究最為深入的是堿性戒纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)。bFGF和aFGF在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，二者之間有53％的序列同源。

2．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。

(二)FGF家族及其受體25其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。

bFGF和aFGF均與肝素有很強(qiáng)的親和力，研究表明這種高親和力對于FGF與細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合是非常重要的。

其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺263．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實現(xiàn)的。已經(jīng)識別4種FGFR，包括FGFR1(flg)、FGFR2(bek)、FGFR3和FGFR4。FGFR1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中FGFR1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織中有些細(xì)胞呈現(xiàn)FGFR1陽性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細(xì)胞亦是如此。

3．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)27(三)

Angiotropin

AngiOtropin是一個含銅離子的4．5kD核酸與多肽的聚合物。將angiotropin加入到已匯合的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，它以劑量依賴方式刺激內(nèi)皮遷移并快速排列成管樣結(jié)構(gòu)，這種效應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞是特異的。由于它是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，所以它可能啟動炎癥和傷口愈合中的血管生成過程。(三)Angiotropin28腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。太慢不均勻，特別是甘油。④新生血管管腔的貫通。1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。腫瘤中的血管可能有3種來源(一)血管生成的基本過程②血管期(vascularphase)因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實驗。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定(VEGF等)小血管毛細(xì)血管伸展每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。④新生血管管腔的貫通。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。3．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)（四）血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PDECGF)PDECGF是一個酸性45kD單鏈多肽。它是內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，能刺激人和豬的內(nèi)皮細(xì)胞增生。用PDECGF轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，其裸鼠移植瘤血管密度明顯增加。(五)其他血管生成因子Ang和Tie受體家族EGFTGF粒細(xì)胞集落刺激因子／粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GCSF／GM—CSF)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一29(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì)血管基底膜的降解是血管生成過程中的重要事件，只有基底膜降解之后，內(nèi)皮細(xì)胞才能遷移入周圍組織并形成血管芽?；啄さ慕到馐且粡?fù)雜過程，涉及一系列酶的作用，這些酶包括基質(zhì)金屬蛋白溶酶、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinasetypeplasminogen,uPA)；絲氨酸蛋白酶(serineproteases)、細(xì)胞外蛋白體(proteasome)、糖苷酶(endoglycosidases)、組織蛋白酶(cathepsins)和多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(serineproteinase)。(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì)30uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。UPA使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)為纖維蛋白溶酶,后者能降解基質(zhì)蛋白并激和幾種基質(zhì)金屬蛋白酶。(八)細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)黏附受體在血管生成型中不但需要細(xì)胞因子與相應(yīng)受體的結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)(extraceIlularmatrix,ECM)也起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞獨自在接受生長因子的刺激時只表現(xiàn)增生，而在有細(xì)胞外基質(zhì)的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞才能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。UPA使纖維蛋白溶31二、缺氧對血管生成的誘導(dǎo)作用缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括缺氧誘導(dǎo)因子1、2(hypoxiainducingfactorl，2，HIF1．HIF2)和NFКB,其中以HIFl在血管生成中的作用最為重要。在腫瘤組織中，缺氧一方面可導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡，另一方面也刺激殘留瘤細(xì)胞上調(diào)血管生成因子的表達(dá)。二、缺氧對血管生成的誘導(dǎo)作用32第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法一.腫瘤血管生成的體內(nèi)研究動物模型

腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗?zāi)Ｐ椭饕袆游?大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)等四種動物模型。國內(nèi)學(xué)者對這四種模型均有研究。有研究認(rèn)為CAM是研究血管生成較好的實驗?zāi)Ｐ?，其方法簡便二成本低，儀器設(shè)備條件要求不高，易于操作，便于推廣；并可用于進(jìn)行大樣本研究，或用于影響血管生成的因素或藥物的篩選和評價。因此，特將CAM試驗方法作簡單介紹

第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法33雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:(1)．雞胚準(zhǔn)備和接種組織選擇北京白雞種蛋，洗凈，用l1000苯扎溴銨(新潔爾滅)液浸泡3分鐘，置37．8土0．5℃培養(yǎng)箱中孵育。雞胚發(fā)育第7天，蛋殼消毒后，標(biāo)記制作2cmX3cm左右觀察窗。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。(2)組織接種在制備雞胚觀察窗的次日，即雞胚發(fā)育第8天進(jìn)行組織接種。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。

雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:34(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。(4)CAM的血管生成表現(xiàn)組織接種24小時后，CAM血管開始向接種組織生長，隨培養(yǎng)時間的延長，血管數(shù)目及直徑均明顯增加；第2天，新細(xì)小血管直接趨向組織；(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，35第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放射狀血管網(wǎng)；爾后，CAM血管繼續(xù)明顯增加。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；而接種部位的CAM血管在接種組織周圍彌散樣增加，以組織為中心向周圍呈放射狀分布，在首先與組織發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域CAM血管更多。第4天，可見新生細(xì)小CAM血管生長形成中、粗血管，并在中、粗血管繼續(xù)分支出細(xì)小血管，形成新的血管網(wǎng)。CAM血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，可區(qū)別動、靜脈。

第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放36(5)CAM血管生成實驗?zāi)Ｐ偷挠猛綜AM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得兩方面結(jié)果①檢測評價接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進(jìn)因子、抑制因子的活性和作用的檢測，如腫瘤血管生成的研究等；②對接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進(jìn)行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用.(5)CAM血管生成實驗?zāi)Ｐ偷挠猛綜AM血管生成模型用于血管37對照抗血管生成藥物作用以后對照抗血管生成藥物作用以后38

盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認(rèn)為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；另外，在該類模型中，血管生成物必須植入眼角膜囊、頰囊、或絨毛尿膜囊使之誘導(dǎo)血管生成，難免產(chǎn)生人為因素誘導(dǎo)的血管生成；血管生成促進(jìn)因子、抑制因子等需要從多聚載體中釋放出來；操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:二.人胎盤血管培養(yǎng)實驗(體外)

Kathryn等認(rèn)為不但既往的體內(nèi)血管生成實驗研究模型有上述不足之處，而體外的血管生成實驗研究也主要是內(nèi)皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)，將內(nèi)皮細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，或者暴露于各種血管生成刺激因子，使之誘導(dǎo)其血管形成。

盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)39(一)免疫組織化學(xué)檢測出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl051)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。(二)FGF家族及其受體VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。15—40120.01MPBS分別洗膜，5min×4次。SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)

該類體外實驗研究，有很多人為因素影響，不能代表體內(nèi)生理反應(yīng)，因為內(nèi)皮細(xì)胞在生長因子存在的條件下培養(yǎng)了很長一段時間，已被激活。因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實驗。

于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。從自愿選擇剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時之內(nèi)的人胎盤頂端表面截取約長2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。

(一)免疫組織化學(xué)檢測該類體外實驗研究，有很多人為因素40培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。然后將培養(yǎng)板置37℃保濕孵育培養(yǎng)14～21天，每周換培養(yǎng)基2次。用減數(shù)成相系統(tǒng)計；算原來血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計數(shù)新生長形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長曲線。培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，可在孔中分別加入各種血管生成41用免疫組化、流式細(xì)胞儀、電鏡等分別檢測了CD34，WeibelPalade小體標(biāo)志物等，證實新生血管中含有內(nèi)皮細(xì)胞。該實驗?zāi)Ｐ筒恍枰油庠葱陨L因子，并用該模型檢測研究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構(gòu)體及其受體在原代血管生長及子代新生血管形成中的作用。結(jié)果表明該模型是篩選人類血管生成潛在激活增強(qiáng)因子和抑制因子行之有效的體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

用免疫組化、流式細(xì)胞儀、電鏡等分別檢測了CD34，We42三.腫瘤微血管密度計數(shù)(MVD)

用FⅧ因子單克隆抗體在組織切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色。MVD計數(shù)按Weidner等的方法并加以改動，先在低倍視野內(nèi)找到MVD最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)計數(shù)微血管的數(shù)目。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計入結(jié)果，單個的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個血管計數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細(xì)胞直徑的血管不計數(shù)。計5個視野的IMVD，取其平均值作為IMVD。三.腫瘤微血管密度計數(shù)(MVD)43四.腫瘤血管生成調(diào)控因子的檢測以VEGF為例,根據(jù)實驗條件和需要可以從蛋白質(zhì)水平或核酸水平進(jìn)行檢測:(一)免疫組織化學(xué)檢測用VEGF單克隆抗體在組織切片或細(xì)胞爬片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕黃色。四.腫瘤血管生成調(diào)控因子的檢測44培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)45培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)46培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)47(二)Westernblot基本原理:免疫印跡又稱Western印跡(Western

blot)，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。

(二)Westernblot48Westernblot的過程分四階段a.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定b.SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）c.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)d.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(雜交)1.蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定A.樣品的制備組織的處理方法組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOPbuffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。Westernblot的過程分四階段49細(xì)胞的處理方法離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5×STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。分泌蛋白的提取直接收集分泌液，加入βME、溴酚藍(lán)制樣。B.蛋白的定量方法:a.雙縮脲法b.Lowry法c.紫外吸收法:e.Bradford比色法

細(xì)胞的處理方法離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5×S502.SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）A實際操作做膠前的準(zhǔn)備1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3)按將要檢測的抗體對應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。制膠，電泳1）裝好架子。2)按照<<分子克隆>>配方配制分離膠。在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。

2.SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）51倒好濃縮膠后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4)待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用6080V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用100120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。注意事項及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過樣品槽。3）gel通常在0.51h內(nèi)凝集最好，過快表TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或失效。倒好濃縮膠后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。524）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象︶條帶呈笑臉狀，原因凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過多。4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不533.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜):在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜的選擇印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜):54轉(zhuǎn)膜有2種方法:A.半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。1)實驗條件的選擇電流1mA2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。轉(zhuǎn)膜有2種方法:55目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉(zhuǎn)移時間(h)801408%1.52.02580101.515—40120.75<20150.52)實驗操作（1）濾紙和膜的準(zhǔn)備(在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。a.檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有立即配制b.檢查是否有合適大小的濾紙和膜。目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度56c.將膜泡入甲醇中，約12分鐘。再轉(zhuǎn)入transferbuffer中。d.將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。（2）轉(zhuǎn)移a.在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。b.將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的濕潤。c.將膠剝出，去掉stackgel，小心的移到膜上。d.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。e.將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。倒上些transferbuffer，再鋪兩張靠膠濾紙。f.裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時間。g.轉(zhuǎn)移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時調(diào)整。c.將膜泡入甲醇中，約12分鐘。再轉(zhuǎn)入transferbu57腫瘤血管生成及其檢測實用版課件583注意事項及常遇到的問題1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5小時，(1mA2mA/cm2，10%gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。B.濕法這里暫不做介紹。3注意事項及常遇到的問題59

C.轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1．染膠用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。2．染膜有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceausred、FastgreenFC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。C.轉(zhuǎn)移后效果的鑒定604.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(雜交)a、用0.01MPBS洗膜，5min×3次。b.封閉（block）:封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有:bovineserumalbumin(BSA)，nonfatmilk，tween20等，我們一般用nonfatmilk。在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk(TBST溶解)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block(一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜)，并清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。Block4°C1小時。

4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(雜交)61c.棄封閉液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。d.加入一抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。

e.棄一抗和1%BSA，用0.01MPBS分別洗膜，5min×4次。

f.加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。

g.棄二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

h.加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

c.棄封閉液，用0.01MPBS洗膜，5min×62腫瘤血管生成及其檢測腫瘤血管生成及其檢測63（優(yōu)選）腫瘤血管生成及其檢測（優(yōu)選）腫瘤血管生成及其檢測64腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)實現(xiàn)的，并在腫瘤的生長和擴(kuò)散(侵襲和轉(zhuǎn)移)中起重要作用。已有研究證明，腫瘤血管生成活躍程度對組織病理分級、放射治療以及在預(yù)后判斷上都有重要的評估價值。

腫瘤內(nèi)的新生血管和淋巴管分別通過血管生成(angiogene65第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程一、血管生成現(xiàn)象(一)血管生成的概念1945年Algire提出了“腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。對血管生成重要性的認(rèn)識，特別是提出“腫瘤生長依賴于血管生成”觀點，始于1971年Folkman對腫瘤血管生成的研究報道。

第一節(jié)腫瘤血管生成的基本過程66血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內(nèi)皮細(xì)胞分化形成新血管的過程即血管形成(vasculogenesis)

(二)血管生成的研究方法雞胚絨毛尿囊膜試驗角膜移植實驗血管生成是指活體組織在已存在的微血管床上芽生(sprouti67開窗實驗動物移植瘤等在體模型三維膠分析法細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)等離體模型識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05血管生成因子:VEGF及其受體家族FGF家族及其受體Ang和Tie受體家族Angiotropin血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PDECGF)

開窗實驗68二．腫瘤血管生成的基本過程(一)血管生成的基本過程血管生成的基本步驟是①血管生成因子的產(chǎn)生過多使之與抑制因子失衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活，產(chǎn)生血管生成表型；②血管部位細(xì)胞外基質(zhì)改變、基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞芽生、增殖和遷移；二．腫瘤血管生成的基本過程69③新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；④新生血管管腔的貫通。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、脫離基底膜和血管壁細(xì)胞改變可能是血管消退的主要病理學(xué)事件。(二)腫瘤血管生成的過程1．腫瘤生長的階段性

①無血管期(avascularphase)或稱血管前期(prevascularphase)

腫瘤直徑不超過1～2mm

③新生內(nèi)皮細(xì)胞索形成管狀毛細(xì)血管襻及管腔；702．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認(rèn)為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；(五)其他血管生成因子腫瘤直徑不超過1～2mm加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內(nèi)分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。棄一抗和1%BSA，用0.這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。01MPBS洗膜，5min×3次。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。二．腫瘤血管生成的基本過程(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。②血管期(vascularphase)腫瘤迅速生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移2.腫瘤血管的起源腫瘤中的血管可能有3種來源①血管生成:以兩種方式發(fā)生,一是腫瘤細(xì)胞團(tuán)先處于無血管期生長，后因缺氧而產(chǎn)生大量血管生成因子，從而誘導(dǎo)血管生成；另一種是瘤細(xì)胞先依賴宿主組織已存在的血管生長，繼而出現(xiàn)瘤內(nèi)血管消退，然后再因缺氧誘導(dǎo)血管生成因子作用而發(fā)生血管生成②血管套疊性生長2．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生71③內(nèi)皮祖細(xì)胞3．腫瘤血管生成的過程

瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞血管生成因子(VEGF等)

小血管毛細(xì)血管伸展內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成毛細(xì)血管芽新生毛細(xì)血管形成并連通③內(nèi)皮祖細(xì)胞72第二節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性腫瘤微血管不僅在形態(tài)上不同于正常血管，而且在生物學(xué)功能上也有其特殊性。一．腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。血管生成最活躍、微血管密度最高的區(qū)域被稱為所謂“血管熱點區(qū)”(hotspots)，這也是進(jìn)行腫瘤微血管密度測定的選擇區(qū)域。很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。第二節(jié)腫瘤微血管形態(tài)和生物學(xué)特性73腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。新生血管呈血竇狀、條索狀，管壁薄，甚至僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞；或管壁很厚，但結(jié)構(gòu)上仍然不完善。內(nèi)皮細(xì)胞～般比較幼稚，細(xì)胞間常有裂隙，且缺乏基底膜，有時血管外的腫瘤細(xì)胞可直接與血管管腔相連。腫瘤血管的結(jié)構(gòu)缺陷是這些血管具有高通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。

腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)74不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。生長活躍的惡性腫瘤常富于血管．如內(nèi)分泌腫瘤．腎癌、骨肉瘤、絨毛膜癌、破骨細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌等，而硬癌、軟骨瘤和軟骨肉瘤中血管甚少。不同腫瘤血管的形態(tài)又有一定的差異，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中新生血管不僅豐富，而且內(nèi)皮細(xì)胞呈不同程度的增生、肥大；絨毛膜癌、肝細(xì)胞癌等血管呈壁薄、明顯擴(kuò)張的血竇。不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同75以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有:①梭形內(nèi)皮細(xì)胞呈索狀排列，枝狀分布，有或無明顯的血管腔，呈原始、幼稚的微血管②內(nèi)皮細(xì)胞增生、肥大，管腔狹小，呈現(xiàn)厚壁血管③內(nèi)皮細(xì)胞增生，形成球形血管壁內(nèi)血管．呈現(xiàn)“腎小球樣結(jié)構(gòu)”；④管腔大、管壁較薄的相對較大的微血管，并形成血管心假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)；⑤大量管壁退變和鈣化的新生血管；以惡性膠質(zhì)瘤為例，腫瘤組織內(nèi)新生血管的主要表現(xiàn)形式有:76⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；⑦血管內(nèi)皮區(qū)域性極度增生，呈片狀的梭形細(xì)胞，構(gòu)成“假肉瘤化”。二、腫瘤微血管的生物學(xué)特性①低反應(yīng)性②高通透性③低供氧能力

⑥增生血管叢呈蛇形密集排列，形成腫瘤與瘤周組織間的血管屏障；774）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。分辨不清或染色模糊的細(xì)胞不計入結(jié)果，單個的棕黃色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇作一個血管計數(shù)，但肌層較厚及血管腔面積>8個紅細(xì)胞直徑的血管不計數(shù)。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，而VEGFR3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。該實驗?zāi)Ｐ筒恍枰油庠葱陨L因子，并用該模型檢測研究了aFGF、bFGF，三種VEGF異構(gòu)體及其受體在原代血管生長及子代新生血管形成中的作用。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。Westernblot的過程分四階段很多腫瘤的微血管新生主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣。2．VEGF及其受體的作用:識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl05操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。太慢不均勻，特別是甘油。腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。④新生血管管腔的貫通。紋理（縱向條紋）樣品中含有不溶性顆粒。最近，VogelsteinB和KinzlerKW采用基因表達(dá)的系列分析(serialanalysisofgeneexpressionSAGE)方法，比較研究了結(jié)直腸癌和正常腸黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)．二者基因表達(dá)存在差異。他們得到了79種差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子，其中TEM8僅表達(dá)于腫瘤內(nèi)皮而不表達(dá)于黃體形成中的內(nèi)皮細(xì)胞，提示腫瘤血管生成和生理狀態(tài)下的血管生成有明顯不同。這一發(fā)現(xiàn)為血管生成的基礎(chǔ)和臨床研究提供了重要資料，也引起了血管生成和腫瘤治療研究者的重視。

4）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。最近，78第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞受缺氧刺激等使局部微環(huán)境發(fā)生變化的因素作用而合成和釋放大量血管生成因子從不同環(huán)節(jié)促進(jìn)血管生成。組織中同時也存在內(nèi)源性血管生成抑制因子，對血管生成起抑制作用。

第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制79一、血管生成因子血管生成的始動需要血管生成因子。一系列血管生成因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)和黏附分子及其抑制物，以及代謝性和機(jī)械性因子均參與了血管生成過程。已知的血管生成因子有數(shù)十種，其中VEGF和Ang家族是已知的、特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，在血管生成中作用可能也是最為重要的。一、血管生成因子80(一)VEGF及其受體家族1．VEGF家族及其愛體VEGF又稱血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，為分子量34~45kD的同源二聚體糖蛋白，屬于堿性蛋白。VEGF基因通過轉(zhuǎn)錄水平的剪切，可產(chǎn)生5種變異體，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分別由206、189、165、145和121個氨基酸組成。(一)VEGF及其受體家族81其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為可溶性分泌蛋白，擴(kuò)散力強(qiáng)，易于到達(dá)靶細(xì)胞。近年又發(fā)現(xiàn)其他一些與VEGF功能相似、結(jié)構(gòu)上有一定同源性的多肽因子，包括胎盤生長因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGFB(VEGF相關(guān)因子，VEGFrelatedfactor，VRF)，VEGFC(VEGF相關(guān)蛋白，VEGFrelatedprotein，VRP)，以及VEGFD／FIGF和VEGFE等成員，它們共同構(gòu)成VEGF家族其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均為82VEGF受體包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(Flk1／KDR)和VEGFR3(Flt4)2．VEGF及其受體的作用:早期血管的形成需要VEGF的調(diào)節(jié)，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂和分化，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF(主要是VEGFA)通過其受體VEGFR1(Flt1)和VEGFR2(Flk1／KDR)促進(jìn)內(nèi)皮分化、增殖、遷移和原始血管形成.

VEGF受體包括VEGFR1(Flt1)、VEGFR2(Fl83由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，而VEGFR3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異的強(qiáng)效有絲分裂原，而且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中發(fā)揮重要作用。VEGF在幾乎所有的人體腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中皆有過表達(dá)。VEGF及其受體在腫瘤中的表達(dá)常與腫瘤分化程度密切相關(guān)。由新形成的內(nèi)皮組裝成管腔樣結(jié)構(gòu)需要VEGFR1的表達(dá)和激活，84大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達(dá)，VEGF165VEGF121兩種VEGF最常見。在VEGF家族中，VEGFC和VEGD既可誘導(dǎo)血管生成，又可誘導(dǎo)淋巴管生成。已有研究報道，人體多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGFC。體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C實，腫瘤細(xì)胞VEGFC的高表達(dá)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤組織淋巴管生成。腫瘤組織中的VEGFC和VEGFD還來源于浸潤的巨噬細(xì)胞。大多數(shù)實體瘤VEGF基因均有過表達(dá)，VEGF165VEG85缺氧是包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個強(qiáng)烈的誘導(dǎo)因子

離體條件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表達(dá)的誘因。VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。腫瘤中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平常與VEGF呈正相關(guān)，NO與VEGF之間具有相互調(diào)節(jié)作用。多種癌基因的激活通過上調(diào)VEGF表達(dá)而誘導(dǎo)血管生成，失活的抑癌基因(如突變型p53基因)也參與了VEGF介導(dǎo)的血管生成過程。

缺氧是包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞系產(chǎn)生VEGF的一個強(qiáng)烈的86(二)FGF家族及其受體1．FGF家族目前研究最為深入的是堿性戒纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)。bFGF和aFGF在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，二者之間有53％的序列同源。

2．FGF的分布和生物學(xué)作用bFGF是體內(nèi)分布廣泛的生長因子之一，可在不同腫瘤中表達(dá)，包括膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌等許多培養(yǎng)的細(xì)胞系都可以合成它。

(二)FGF家族及其受體87其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶降解基底膜，誘導(dǎo)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖和分化。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。

bFGF和aFGF均與肝素有很強(qiáng)的親和力，研究表明這種高親和力對于FGF與細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合是非常重要的。

其功能具有多樣性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、趨化性和遷移，刺883．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實現(xiàn)的。已經(jīng)識別4種FGFR，包括FGFR1(flg)、FGFR2(bek)、FGFR3和FGFR4。FGFR1在bFGF／FGFR系統(tǒng)中的作用最大。正常腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中FGFR1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，即組織中有些細(xì)胞呈現(xiàn)FGFR1陽性，有些則顯示陰性；血管內(nèi)皮細(xì)胞亦是如此。

3．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)89(三)

Angiotropin

AngiOtropin是一個含銅離子的4．5kD核酸與多肽的聚合物。將angiotropin加入到已匯合的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，它以劑量依賴方式刺激內(nèi)皮遷移并快速排列成管樣結(jié)構(gòu)，這種效應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞是特異的。由于它是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)調(diào)節(jié)劑，所以它可能啟動炎癥和傷口愈合中的血管生成過程。(三)Angiotropin90腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一。太慢不均勻，特別是甘油。④新生血管管腔的貫通。1)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。腫瘤中的血管可能有3種來源(一)血管生成的基本過程②血管期(vascularphase)因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實驗。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定不同類型腫瘤間質(zhì)的血管沒有本質(zhì)區(qū)別，但在形態(tài)和數(shù)量上卻有不同。操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。蛋白樣品的制備及蛋白樣品濃度測定(VEGF等)小血管毛細(xì)血管伸展每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。④新生血管管腔的貫通。bFGF也表現(xiàn)出親神經(jīng)性行為，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化。腫瘤的新生血管分布上常常無規(guī)律，分支紊亂，管腔不規(guī)則，可表現(xiàn)為狹窄、擴(kuò)張或扭曲。3．FGF受體bFGF的生物學(xué)作用是通過與其特異性的細(xì)胞表面受體FGF受體(FGFreceptors，F(xiàn)GFR)結(jié)合而介導(dǎo)實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)膜)（四）血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PDECGF)PDECGF是一個酸性45kD單鏈多肽。它是內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，能刺激人和豬的內(nèi)皮細(xì)胞增生。用PDECGF轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，其裸鼠移植瘤血管密度明顯增加。(五)其他血管生成因子Ang和Tie受體家族EGFTGF粒細(xì)胞集落刺激因子／粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GCSF／GM—CSF)腫瘤組織內(nèi)新生的微血管一般遍布整個腫瘤組織，但分布上并不均一91(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì)血管基底膜的降解是血管生成過程中的重要事件，只有基底膜降解之后，內(nèi)皮細(xì)胞才能遷移入周圍組織并形成血管芽?；啄さ慕到馐且粡?fù)雜過程，涉及一系列酶的作用，這些酶包括基質(zhì)金屬蛋白溶酶、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活因子(urokinasetypeplasminogen,uPA)；絲氨酸蛋白酶(serineproteases)、細(xì)胞外蛋白體(proteasome)、糖苷酶(endoglycosidases)、組織蛋白酶(cathepsins)和多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(serineproteinase)。(七)降解基底膜的相關(guān)物質(zhì)92uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。UPA使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)為纖維蛋白溶酶,后者能降解基質(zhì)蛋白并激和幾種基質(zhì)金屬蛋白酶。(八)細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)黏附受體在血管生成型中不但需要細(xì)胞因子與相應(yīng)受體的結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)(extraceIlularmatrix,ECM)也起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞獨自在接受生長因子的刺激時只表現(xiàn)增生，而在有細(xì)胞外基質(zhì)的條件下，內(nèi)皮細(xì)胞才能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。uPA的作用涉及腫瘤的血管生成與侵襲過程。UPA使纖維蛋白溶93二、缺氧對血管生成的誘導(dǎo)作用缺氧是腫瘤和非腫瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子包括缺氧誘導(dǎo)因子1、2(hypoxiainducingfactorl，2，HIF1．HIF2)和NFКB,其中以HIFl在血管生成中的作用最為重要。在腫瘤組織中，缺氧一方面可導(dǎo)致瘤細(xì)胞死亡，另一方面也刺激殘留瘤細(xì)胞上調(diào)血管生成因子的表達(dá)。二、缺氧對血管生成的誘導(dǎo)作用94第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法一.腫瘤血管生成的體內(nèi)研究動物模型

腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗?zāi)Ｐ椭饕袆游?大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜(CAM)等四種動物模型。國內(nèi)學(xué)者對這四種模型均有研究。有研究認(rèn)為CAM是研究血管生成較好的實驗?zāi)Ｐ?，其方法簡便二成本低，儀器設(shè)備條件要求不高，易于操作，便于推廣；并可用于進(jìn)行大樣本研究，或用于影響血管生成的因素或藥物的篩選和評價。因此，特將CAM試驗方法作簡單介紹

第四節(jié)血管生成的有關(guān)檢測方法95雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:(1)．雞胚準(zhǔn)備和接種組織選擇北京白雞種蛋，洗凈，用l1000苯扎溴銨(新潔爾滅)液浸泡3分鐘，置37．8土0．5℃培養(yǎng)箱中孵育。雞胚發(fā)育第7天，蛋殼消毒后，標(biāo)記制作2cmX3cm左右觀察窗。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。(2)組織接種在制備雞胚觀察窗的次日，即雞胚發(fā)育第8天進(jìn)行組織接種。每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。

雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗:96(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，到組織接種第11天(雞胚發(fā)育第18天)收獲接種組織，取出雞胚，置接種組織連同周圍的CAM于解剖顯微鏡下觀察，并用10％甲醛固定保存，部分組織可作石蠟切片，用作血管生成研究的免疫組化染色等。(4)CAM的血管生成表現(xiàn)組織接種24小時后，CAM血管開始向接種組織生長，隨培養(yǎng)時間的延長，血管數(shù)目及直徑均明顯增加；第2天，新細(xì)小血管直接趨向組織；(3)接種組織的收獲與觀察組織接種后每12小時觀察一次，97第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放射狀血管網(wǎng)；爾后，CAM血管繼續(xù)明顯增加。非接種部位與接種部位比較，CAM血管數(shù)目少，大血管與小血管呈脈樣均勻分布；而接種部位的CAM血管在接種組織周圍彌散樣增加，以組織為中心向周圍呈放射狀分布，在首先與組織發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域CAM血管更多。第4天，可見新生細(xì)小CAM血管生長形成中、粗血管，并在中、粗血管繼續(xù)分支出細(xì)小血管，形成新的血管網(wǎng)。CAM血管管腔結(jié)構(gòu)清晰，可區(qū)別動、靜脈。

第3天，新生血管形成以接種組織為中心，10～20條放98(5)CAM血管生成實驗?zāi)Ｐ偷挠猛綜AM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得兩方面結(jié)果①檢測評價接種物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促進(jìn)因子、抑制因子的活性和作用的檢測，如腫瘤血管生成的研究等；②對接種物，如腫瘤組織、自身的血管生成進(jìn)行研究，用于分析不同組織的血管生成活性和作用，如腫瘤組織有引發(fā)新生血管生成的作用.(5)CAM血管生成實驗?zāi)Ｐ偷挠猛綜AM血管生成模型用于血管99對照抗血管生成藥物作用以后對照抗血管生成藥物作用以后100

盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)，使研究結(jié)果更為可靠，但Kathryn等認(rèn)為仍有一些不足之處，如操作繁瑣，耗時過長；另外，在該類模型中，血管生成物必須植入眼角膜囊、頰囊、或絨毛尿膜囊使之誘導(dǎo)血管生成，難免產(chǎn)生人為因素誘導(dǎo)的血管生成；血管生成促進(jìn)因子、抑制因子等需要從多聚載體中釋放出來；操作方法和測定其結(jié)果的技術(shù)較為復(fù)雜。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:二.人胎盤血管培養(yǎng)實驗(體外)

Kathryn等認(rèn)為不但既往的體內(nèi)血管生成實驗研究模型有上述不足之處，而體外的血管生成實驗研究也主要是內(nèi)皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)，將內(nèi)皮細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，或者暴露于各種血管生成刺激因子，使之誘導(dǎo)其血管形成。

盡管血管生成的體內(nèi)動物模型研究更為接近人體的生理狀態(tài)101(一)免疫組織化學(xué)檢測出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。第三節(jié)腫瘤血管生成的調(diào)控機(jī)制識別內(nèi)皮細(xì)胞的免疫學(xué)標(biāo)記物:第8因子相關(guān)抗原(factorⅧrelatedantigenFⅧAg)、CD3l、CD34、CDl051)檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。(二)FGF家族及其受體VEGF在腫瘤壞死灶周邊常呈強(qiáng)表達(dá)。由于這些不利之處，最近，Kathryn等又建立了一種新的血管生成模型:每個雞胚可接種5—7個組織小塊于接種部位CAM表面，再用透明膠紙封好，繼續(xù)孵育。接種組織視研究目的而定，一定要在接種當(dāng)日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm組織小塊。15—40120.01MPBS分別洗膜，5min×4次。SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）腫瘤血管生成受多種血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的調(diào)控。出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。培養(yǎng)的腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞VEGF陽性表達(dá)

該類體外實驗研究，有很多人為因素影響，不能代表體內(nèi)生理反應(yīng)，因為內(nèi)皮細(xì)胞在生長因子存在的條件下培養(yǎng)了很長一段時間，已被激活。因此，有必要建立一類與體內(nèi)生理反應(yīng)有關(guān)的血管生成實驗方法，尤其是與人類血管生成有關(guān)的血管生成實驗。

于是，Kathryn等建立了一種新的人血管生成模型。從自愿選擇剖腹產(chǎn)手術(shù)24小時之內(nèi)的人胎盤頂端表面截取約長2～5cm，直徑為l～2mm的表淺血管，洗去血污，浸入Hank平衡鹽溶液中。

(一)免疫組織化學(xué)檢測該類體外實驗研究，有很多人為因素102培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，可在孔中分別加入各種血管生成因子，再加l99培養(yǎng)基，將血管片段在凝固前迅速加入培養(yǎng)孔中央，理想的是使血管片段懸浮于培養(yǎng)膠中。然后將培養(yǎng)板置37℃保濕孵育培養(yǎng)14～21天，每周換培養(yǎng)基2次。用減數(shù)成相系統(tǒng)計；算原來血管條生成的血管索數(shù)量，每隔一天計數(shù)新生長形成的微血管條數(shù)，由此描繪微血管生長曲線。培養(yǎng)在48孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，可在孔中分別加入各種血管生成103