染色體工程課件

第九章染色體工程1第九章染色體工程122什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengineering）：是人們按照一定的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達(dá)到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。廣義上講它還應(yīng)包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)，因此也稱為染色體操作。3什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengi第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體第二節(jié)雌、雄核發(fā)育第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第五節(jié)人工染色體4第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體4第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體技術(shù)方法倍性鑒定方法優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)5第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體5多倍體（polyploid）是指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體而言。在自然界中，多倍體現(xiàn)象在高等植物中相當(dāng)多，而動(dòng)物界卻少得多。1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快，成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以人工誘導(dǎo)多倍體、改善動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀倍受重視。6多倍體（polyploid）是指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染一、技術(shù)方法7一、技術(shù)方法7多倍體是由于細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過(guò)抑制受精卵第二極體的放出產(chǎn)生三倍體，或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、物理和化學(xué)的方法得到多倍體。8多倍體是由于細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過(guò)抑制受精卵1.生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過(guò)雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動(dòng)物可以通過(guò)雜交產(chǎn)生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。例如用雌性草魚(yú)（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。異育銀鯽與興國(guó)紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過(guò)細(xì)胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。這種不同科、屬、種之間的遠(yuǎn)源雜交，會(huì)導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。91.生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過(guò)雜交尤其是種間雜交獲得異源多包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。⑴溫度休克法：冷休克法（0～5℃）和熱休克法（30℃）。

定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。

關(guān)鍵：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達(dá)到這一點(diǎn)，必須考慮溫度處理的開(kāi)始時(shí)間（TA）、處理持續(xù)時(shí)間（D）和處理溫度（T）這三個(gè)因素。目前對(duì)魚(yú)類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報(bào)道較多。一般來(lái)說(shuō)，冷水性魚(yú)類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法好，而溫水性魚(yú)類用冷休克效果較好。

優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)、易操作，是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。2.物理學(xué)方法10包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來(lái)產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時(shí)間短（3～5min），對(duì)受精卵損傷小、成活率高。

缺點(diǎn)：需要專門的設(shè)備——水壓機(jī)，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。11⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極

有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來(lái)阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。

細(xì)胞松馳素B：能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。秋水仙堿：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。

其它藥物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。

缺點(diǎn)：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時(shí)加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒(méi)有價(jià)值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實(shí)際中的應(yīng)用不及物理方法。3.化學(xué)方法12有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來(lái)阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分二、倍性鑒定方法13二、倍性鑒定方法13間接法：核體積測(cè)量、蛋白質(zhì)電泳、系列化學(xué)分析、形態(tài)學(xué)檢查等；直接法：染色體計(jì)數(shù)、DNA含量測(cè)定等。14間接法：核體積測(cè)量、蛋白質(zhì)電泳、系列化學(xué)分析、形態(tài)學(xué)檢查等

核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測(cè)量法省時(shí)、簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)就能進(jìn)行而廣為人們采用，但缺乏準(zhǔn)確性，亦測(cè)不出嵌合體，往往需要校正；生化分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。15核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與

染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)；DNA含量測(cè)定：流式細(xì)胞儀。是較為先進(jìn)常用的方法，其測(cè)定快速準(zhǔn)確，并能測(cè)出嵌合體，但需要特殊的儀器設(shè)備。采用何種方法均有利有弊，進(jìn)行鑒定主要依賴于所測(cè)樣本的發(fā)育時(shí)期、實(shí)驗(yàn)要求和所具備的儀器設(shè)備條件。16染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺三、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)17三、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)17多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，具有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。許多誘導(dǎo)的多倍體動(dòng)物如兩棲類、魚(yú)類、貝類等都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率。種間雜種生長(zhǎng)快，可以同時(shí)具有兩個(gè)不同的種的優(yōu)良特性。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動(dòng)物生長(zhǎng)，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時(shí)間或影響商品價(jià)值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚(yú)、昆蟲(chóng)等方面已有應(yīng)用。某些多倍體動(dòng)物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟(jì)性狀較二倍體好。

1.優(yōu)點(diǎn)18多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，具有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。準(zhǔn)確的處理時(shí)間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準(zhǔn)確可靠的倍性鑒定方法的確定。2.缺點(diǎn)19準(zhǔn)確的處理時(shí)間；2.缺點(diǎn)19第二節(jié)雌、雄核發(fā)育人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法雌核發(fā)育的鑒別雌核發(fā)育的意義人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育20第二節(jié)雌、雄核發(fā)育20雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。同種或異種精子進(jìn)入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來(lái)自雌核，只具有母本的性狀。自然界中一些無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類等存在。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或γ射線等處理后的失活精子來(lái)“受精”，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動(dòng)物。21雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依凡雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。1911年，赫特威氏就第一個(gè)成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。赫特威氏效應(yīng)指只有在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯?，才能?dǎo)致精子染色體完全失活，屆時(shí)精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動(dòng)發(fā)育的作用。22凡雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法23一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法23物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。

化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。

顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子遺傳物質(zhì)的失活24物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；利用溫度、壓力或化學(xué)方法，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2.雌核染色體數(shù)目減少的阻止25阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；2.雌核染色體數(shù)目減少首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細(xì)的吸管將精核去掉。在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。26首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。26二、雌核發(fā)育的鑒別27二、雌核發(fā)育的鑒別27鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依據(jù)。也可以通過(guò)細(xì)胞學(xué)的研究，如若是雌核發(fā)育，其囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來(lái)自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。用遺傳標(biāo)志的方法來(lái)鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來(lái)。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個(gè)體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過(guò)阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個(gè)體，則子代的情況取決于著絲點(diǎn)與基因間的距離。在著絲點(diǎn)與基因距離遠(yuǎn)離時(shí)，將明顯增加雜合型子代的比例。28鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依三、雌核發(fā)育的意義29三、雌核發(fā)育的意義29為生產(chǎn)單性種群提供了可能。能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體。提供某些致死突變種的生物品質(zhì)。在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁殖。廣泛地用于進(jìn)行基因-著絲點(diǎn)的定位研究?？衫卯a(chǎn)生新的純系來(lái)篩選除去有害的等位基因。30為生產(chǎn)單性種群提供了可能。30四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育31四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育31雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個(gè)體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價(jià)值，利用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫(kù)，保存種質(zhì)資源，對(duì)基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。32雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)染色體分離染色體微切割33第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)331.原理：由于熒光染料Hoechst只對(duì)A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對(duì)G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會(huì)呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長(zhǎng)輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制就可將發(fā)出同一波長(zhǎng)的染色體收集在一起，從而實(shí)現(xiàn)染色體的分離。一、

染色體分離341.原理：由于熒光染料Hoechst只對(duì)A-T特異性染色，細(xì)胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體分離2.染色體分離的具體步驟35細(xì)胞分裂同步處理2.染色體分離的353636微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對(duì)目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細(xì)胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、

染色體微切割37微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法38第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)38將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)）。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）39將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基一、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞（或微核體）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。供體：微細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化供體基因的表達(dá)、對(duì)受體細(xì)胞影響小、微核染色體穩(wěn)定40一、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞（或微核體）：是指含有一條或微細(xì)胞制備微細(xì)胞融合41微細(xì)胞制備411.微細(xì)胞的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期，從而在染色體周圍逐漸形成核膜而成為眾多的微核。然后在細(xì)胞松弛素B的作用下使微核逐漸突出細(xì)胞膜外。最后經(jīng)過(guò)離心獲得含有一個(gè)微核、四周有一薄層細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細(xì)胞。421.微細(xì)胞的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞2.微細(xì)胞的融合制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細(xì)胞。常采用PEG作為細(xì)胞融合劑。最好選用帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志的受體細(xì)胞。由于微細(xì)胞的染色體含有互補(bǔ)的原養(yǎng)型基因，微細(xì)胞與受體細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞即可在特定的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被篩選出來(lái)。432.微細(xì)胞的融合制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一種技術(shù)?；静襟E：⑴誘發(fā)細(xì)胞同步分裂；⑵阻斷細(xì)胞分裂于中期；⑶破碎細(xì)胞；⑷離心收集中期染色體；⑸通過(guò)適當(dāng)?shù)姆诸愞D(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。二、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法44染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一細(xì)胞同步化與染色體的分離染色體的轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞的分離與鑒定染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程45細(xì)胞同步化與染色體的分離染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程451.細(xì)胞同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞離心收集中期相細(xì)胞沉淀洗滌數(shù)次在中性緩沖液中培育用注射針噴射細(xì)胞，使染色體釋放離心收集染色體沉淀蔗糖梯度離心或用流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x分離單條染色體461.細(xì)胞同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生2.染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體細(xì)胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀，再用二甲基亞砜處理受體細(xì)胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。472.染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3.導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離與鑒定48分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選3.導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離第五節(jié)人工染色體49第五節(jié)人工染色體49染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配。它需要3個(gè)關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN）和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。

50染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來(lái)就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalianartificialchromosome）51將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來(lái)就得到人造微基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列，人們利用這些序列構(gòu)建載體，重組后的DNA以線性狀態(tài)存在，這樣不僅穩(wěn)定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工染色體。如利用從酵母染色體上分離的ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建的染色體即稱為酵母人工染色體。52基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能

53

54

5555本章內(nèi)容到此結(jié)束謝謝大家歡迎研討56本章內(nèi)容到此結(jié)束謝謝大家歡迎研討56【復(fù)習(xí)思考題】經(jīng)常采用的人工誘導(dǎo)多倍體形成的手段有哪些？要達(dá)到實(shí)驗(yàn)條件下二倍體雌核發(fā)育目的需要解決哪些問(wèn)題？選擇、判斷題：1911年，人工條件下，

第一個(gè)在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯鲁晒Φ厝斯は司尤旧w活性，導(dǎo)致精子染色體完全失活。A.赫特威氏B.沃克C.克拉克D.摩爾根多倍體的鑒定不宜采取的方法是

。A.核體積測(cè)量B.染色體計(jì)數(shù)C.血平板計(jì)數(shù)D.利用血液成分、酶的含量等進(jìn)行生化分析溫度休克法包括冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）兩種，即用略高于或略低于最適溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。測(cè)定細(xì)胞核體積對(duì)細(xì)胞多倍體進(jìn)行測(cè)定屬于直接法。

57【復(fù)習(xí)思考題】57第九章染色體工程58第九章染色體工程1592什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengineering）：是人們按照一定的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達(dá)到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。廣義上講它還應(yīng)包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)，因此也稱為染色體操作。60什么是染色體工程？染色體工程（chromosomeengi第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體第二節(jié)雌、雄核發(fā)育第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第五節(jié)人工染色體61第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體4第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體技術(shù)方法倍性鑒定方法優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)62第一節(jié)人工誘導(dǎo)多倍體5多倍體（polyploid）是指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體而言。在自然界中，多倍體現(xiàn)象在高等植物中相當(dāng)多，而動(dòng)物界卻少得多。1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快，成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以人工誘導(dǎo)多倍體、改善動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀倍受重視。63多倍體（polyploid）是指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染一、技術(shù)方法64一、技術(shù)方法7多倍體是由于細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過(guò)抑制受精卵第二極體的放出產(chǎn)生三倍體，或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、物理和化學(xué)的方法得到多倍體。65多倍體是由于細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過(guò)抑制受精卵1.生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過(guò)雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動(dòng)物可以通過(guò)雜交產(chǎn)生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。例如用雌性草魚(yú)（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。異育銀鯽與興國(guó)紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過(guò)細(xì)胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。這種不同科、屬、種之間的遠(yuǎn)源雜交，會(huì)導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。661.生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過(guò)雜交尤其是種間雜交獲得異源多包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。⑴溫度休克法：冷休克法（0～5℃）和熱休克法（30℃）。

定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。

關(guān)鍵：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達(dá)到這一點(diǎn)，必須考慮溫度處理的開(kāi)始時(shí)間（TA）、處理持續(xù)時(shí)間（D）和處理溫度（T）這三個(gè)因素。目前對(duì)魚(yú)類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報(bào)道較多。一般來(lái)說(shuō)，冷水性魚(yú)類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法好，而溫水性魚(yú)類用冷休克效果較好。

優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)、易操作，是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。2.物理學(xué)方法67包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來(lái)產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時(shí)間短（3～5min），對(duì)受精卵損傷小、成活率高。

缺點(diǎn)：需要專門的設(shè)備——水壓機(jī)，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。68⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極

有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來(lái)阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。

細(xì)胞松馳素B：能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。秋水仙堿：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。

其它藥物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。

缺點(diǎn)：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時(shí)加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒(méi)有價(jià)值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實(shí)際中的應(yīng)用不及物理方法。3.化學(xué)方法69有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來(lái)阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分二、倍性鑒定方法70二、倍性鑒定方法13間接法：核體積測(cè)量、蛋白質(zhì)電泳、系列化學(xué)分析、形態(tài)學(xué)檢查等；直接法：染色體計(jì)數(shù)、DNA含量測(cè)定等。71間接法：核體積測(cè)量、蛋白質(zhì)電泳、系列化學(xué)分析、形態(tài)學(xué)檢查等

核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測(cè)量法省時(shí)、簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)就能進(jìn)行而廣為人們采用，但缺乏準(zhǔn)確性，亦測(cè)不出嵌合體，往往需要校正；生化分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。72核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與

染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)；DNA含量測(cè)定：流式細(xì)胞儀。是較為先進(jìn)常用的方法，其測(cè)定快速準(zhǔn)確，并能測(cè)出嵌合體，但需要特殊的儀器設(shè)備。采用何種方法均有利有弊，進(jìn)行鑒定主要依賴于所測(cè)樣本的發(fā)育時(shí)期、實(shí)驗(yàn)要求和所具備的儀器設(shè)備條件。73染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺三、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)74三、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)17多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，具有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。許多誘導(dǎo)的多倍體動(dòng)物如兩棲類、魚(yú)類、貝類等都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率。種間雜種生長(zhǎng)快，可以同時(shí)具有兩個(gè)不同的種的優(yōu)良特性。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動(dòng)物生長(zhǎng)，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時(shí)間或影響商品價(jià)值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚(yú)、昆蟲(chóng)等方面已有應(yīng)用。某些多倍體動(dòng)物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟(jì)性狀較二倍體好。

1.優(yōu)點(diǎn)75多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，具有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。準(zhǔn)確的處理時(shí)間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準(zhǔn)確可靠的倍性鑒定方法的確定。2.缺點(diǎn)76準(zhǔn)確的處理時(shí)間；2.缺點(diǎn)19第二節(jié)雌、雄核發(fā)育人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法雌核發(fā)育的鑒別雌核發(fā)育的意義人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育77第二節(jié)雌、雄核發(fā)育20雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。同種或異種精子進(jìn)入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來(lái)自雌核，只具有母本的性狀。自然界中一些無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類等存在。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或γ射線等處理后的失活精子來(lái)“受精”，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動(dòng)物。78雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依凡雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。1911年，赫特威氏就第一個(gè)成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。赫特威氏效應(yīng)指只有在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯?，才能?dǎo)致精子染色體完全失活，屆時(shí)精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動(dòng)發(fā)育的作用。79凡雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法80一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法23物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。

化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。

顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子遺傳物質(zhì)的失活81物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；利用溫度、壓力或化學(xué)方法，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2.雌核染色體數(shù)目減少的阻止82阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；2.雌核染色體數(shù)目減少首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細(xì)的吸管將精核去掉。在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。83首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。26二、雌核發(fā)育的鑒別84二、雌核發(fā)育的鑒別27鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依據(jù)。也可以通過(guò)細(xì)胞學(xué)的研究，如若是雌核發(fā)育，其囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來(lái)自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。用遺傳標(biāo)志的方法來(lái)鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來(lái)。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個(gè)體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過(guò)阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個(gè)體，則子代的情況取決于著絲點(diǎn)與基因間的距離。在著絲點(diǎn)與基因距離遠(yuǎn)離時(shí)，將明顯增加雜合型子代的比例。85鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依三、雌核發(fā)育的意義86三、雌核發(fā)育的意義29為生產(chǎn)單性種群提供了可能。能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體。提供某些致死突變種的生物品質(zhì)。在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁殖。廣泛地用于進(jìn)行基因-著絲點(diǎn)的定位研究?？衫卯a(chǎn)生新的純系來(lái)篩選除去有害的等位基因。87為生產(chǎn)單性種群提供了可能。30四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育88四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育31雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個(gè)體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價(jià)值，利用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫(kù)，保存種質(zhì)資源，對(duì)基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。89雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)染色體分離染色體微切割90第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)331.原理：由于熒光染料Hoechst只對(duì)A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對(duì)G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會(huì)呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長(zhǎng)輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制就可將發(fā)出同一波長(zhǎng)的染色體收集在一起，從而實(shí)現(xiàn)染色體的分離。一、

染色體分離911.原理：由于熒光染料Hoechst只對(duì)A-T特異性染色，細(xì)胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體分離2.染色體分離的具體步驟92細(xì)胞分裂同步處理2.染色體分離的359336微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對(duì)目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細(xì)胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、

染色體微切割94微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法95第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)38將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)）。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）96將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基一、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞（或微核體）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。供體：微細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化供體基因的表達(dá)、對(duì)受體細(xì)胞影響小、微核染色體穩(wěn)定97一、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞（或微核體）：是指含有一條或微細(xì)胞制備微細(xì)胞融合98微細(xì)胞制備411.微細(xì)胞的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期，從而在染色體周圍逐漸形成核膜而成為眾多的微核。然后在細(xì)胞松弛素B的作用下使微核逐漸突出細(xì)胞膜外。最后經(jīng)過(guò)離心獲得含有一個(gè)微核、四周有一薄層細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細(xì)胞。991.微細(xì)胞的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞2.微細(xì)胞的融合制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細(xì)胞。常采用PEG作為細(xì)胞融合劑。最好選用帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志的受體細(xì)胞。由于微細(xì)胞的染色體含有互補(bǔ)的原養(yǎng)型基因，微細(xì)胞與受體細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞即可在特定的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被篩選出來(lái)。1002.微細(xì)胞的融合制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一種技術(shù)?；静襟E：⑴誘發(fā)細(xì)胞同步分裂；⑵阻斷細(xì)胞分裂于中期；⑶破碎細(xì)胞；⑷離心收集中期染色體；⑸通過(guò)適當(dāng)?shù)姆诸愞D(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。二、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法101染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一細(xì)胞同步化與染色體的分離染色體的轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞的分離與鑒定染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程102細(xì)胞同步化與染色體的分離染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程451.細(xì)胞同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞離心收集中期相細(xì)胞沉淀洗滌數(shù)次在中性緩沖液中培育用注射針噴射細(xì)胞，使染色體釋放離心收集染色體沉淀蔗糖梯度離心或用流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x分離單條染色體1031.細(xì)胞同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生2.染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體細(xì)胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀，再用二甲基亞砜處理受體細(xì)胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。1042.染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3.導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離與鑒定105分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選3.導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離第五節(jié)人工染色體106第五節(jié)人工染色體49染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要