免疫磁珠技術(shù)

關(guān)于免疫磁珠技術(shù)第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日目錄1免疫磁珠技術(shù)簡介1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.2免疫磁珠技術(shù)2免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用2.1IMB技術(shù)在食品有害微生物檢測中的應(yīng)用2.2免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用2.3免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用2.4免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展方向第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.免疫磁珠技術(shù)簡介1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.1.1免疫磁珠的結(jié)構(gòu)

免疫磁珠（IMB），也稱免疫磁性微球，是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料，最外層是免疫配基。

第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日載體微球

載體微球功能基高分子層磁性物質(zhì)金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)。第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日免疫配基

免疫配基通過生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同，從而可結(jié)合不同的免疫配基，如抗原、抗體、凝集素、DNA和RNA等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)，而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性，保證磁珠的特殊識別功能。第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.1.2免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性，從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的新復(fù)合物在磁場中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一致磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場時顯示其磁性，并做定向移動，從磁場移出時磁性消除，磁珠分散，由此可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕；免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)。第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.2免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原—抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，從而達(dá)到分離抗原的目的。基本原理：磁性微球經(jīng)過一定處理后,可將抗體結(jié)合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原—微球復(fù)合物,該復(fù)合物在磁場中具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性,在磁力作用下,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動,從而達(dá)到分離抗原的目的。第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日以細(xì)胞分離為例圖解免疫磁珠技術(shù)的原理第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1食品有害微生物檢測中的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，它能從樣品中迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高了精準(zhǔn)性。還能捕獲受損傷的靶細(xì)菌，而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁珠技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品樣品中致病微生物的檢測。2.免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日

2.1.1大腸桿菌O157的檢測傳統(tǒng)分離E.coliO157∶H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時長、工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coliO157∶H7，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度?，F(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國也已將免疫磁珠法對大腸桿菌O157的檢測納入國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T4789.36-2008）和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1059.5-2006)。第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質(zhì)225mL免疫磁珠捕獲涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落5個~10個，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSIMUG-LST陽性GB/T4789.36-2008免疫磁珠捕獲法檢測程序陰性血清學(xué)試驗(yàn)非O157細(xì)菌生化試驗(yàn)報(bào)告↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日增菌

免疫磁珠捕獲與分離

1.將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號，每個樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支Eppendorff管的蓋子，每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠懸液。

2.取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL，加人到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10s。每個樣品更換1支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染。

具體操作步驟第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日3.結(jié)合:在18℃~30℃環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在DynalMXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動或用手輕微轉(zhuǎn)10min，使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。4.捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時，在Eppendorff管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。

5.吸取上清液:取1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠聚集物時，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到Eppendorff管中，并重復(fù)4步驟。每個樣品換用1支無菌加長吸管。第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日6.洗滌:洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟

4~6。7.重復(fù)上述步驟4~5。8.免疫磁珠懸浮:將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

9.涂布平板:用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于36℃士10℃培養(yǎng)18h---24h。第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日菌落識別在CT-SMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色;在改CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。

初步生化試驗(yàn):在CT-SMAC和改良CHROMagar

O157弧菌顯色瓊脂平板上挑取5個~10個典型或可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，于36℃士1℃培養(yǎng)18

h~24

h。必要時進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生者為陽性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果;對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36℃士1℃培養(yǎng)18

h~24

h，并進(jìn)行鑒定。第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日大腸桿菌O157的檢測Fratamico等將兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離O157∶H7菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的O157∶H7抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂質(zhì)體（IMB/IL）熒光試驗(yàn)方法，可在8h內(nèi)快速檢測出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至1cfu/mL的E.coliO157∶H7，而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性樣本中區(qū)分出E.coliO157∶H7感染樣本。

第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1.2單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約5～14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時也可以通過免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測，縮短了檢測時間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測限。2008年，我國將免疫磁珠檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T0184.3-2008)。第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日檢樣25g(mL)對225mLFB1増菌液（30℃士1℃，24h士1h）1mL轉(zhuǎn)種10mLFB2増菌液（35℃，24h士1h）通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar顯色培養(yǎng)基，OXA/PALCAM瓊脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑選5個典型菌落接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養(yǎng)鑒定和確認(rèn)試驗(yàn)單增李斯特菌的檢測方法第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日1樣品制備

2增菌

3免疫磁珠分離((IMS）

1)免疫捕獲

混增菌培養(yǎng)液.沉淀所有的粗糙食物殘?jiān)?從增菌培養(yǎng)液中移取1mL上層液體(要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒)加人Eppendorf管中.加20μL準(zhǔn)備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。

第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日

2）分離

將Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800輕緩擺動磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的Eppendorf管管蓋,從磁極對面一側(cè)慢慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個樣品換一次槍頭;加1

mI滅菌的PBS

，并重新蓋好蓋子.將磁極從支架上移走，1800輕緩擺動磁架5次一6次,使管內(nèi)各成分混合,后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開.并加100μL滅菌的PBS到管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有磁性分離器.，可以用手搖代替.

4.分離培養(yǎng)

1）分離培養(yǎng)

第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日吸取50μL免疫磁珠懸液.加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂平板上.用無菌接種環(huán)劃線.35℃士1℃培養(yǎng)22h-48h。

2）篩選

李斯特氏菌在CHROMagar顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色.且在其周圍形成一個暈環(huán)。李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長22

h后菌落呈現(xiàn)黑色.直徑為1mm.在其周圍形成一個黑色環(huán)。培養(yǎng)48h，菌落仍呈黑色.直徑2mm

--3mm.除在菌落周圍有一環(huán)外.在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在()XA瓊脂平板上菌落相似。在CHROMagar顯色培養(yǎng)基及OXA或PALCAM瓊脂平板上挑取5個或更多可疑菌落.接種于TSA-YE瓊脂平板上.純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。

5.鑒定和確認(rèn)

第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測Skjerve等通過包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株鑒定，此法的敏感性為102～104cfu/mL樣品。Hudson等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)與PCR結(jié)合，24h內(nèi)即可檢出火腿中的單增李斯特菌。第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1.3沙門氏菌的檢測例1：Notzon等用IMB-熒光PCR檢測肉類中的沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴(kuò)增，12～13h即可完成檢測過程，IMB-熒光PCR在檢測自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。例2：Blackburn等將用生物素標(biāo)記的抗沙門菌多價多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)105cfu/g食物，總的檢測時間從5d減少至1~2d。第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)IMB技術(shù)適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測，能快速有效富集食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原菌，且有良好的靈敏度和特異性，檢測限可達(dá)到1—10cfu/25g;在檢測時間方面可將常規(guī)檢測方法中的72小時檢測周期縮短至40小時，而且能有效減輕過程交叉污染;篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR以及微生物全自動鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測和鑒定提供了有效的快速篩選技術(shù)。第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1.4金黃色葡萄球菌的檢測例1：陳伶俐等將人IgG結(jié)合到磁珠上，用該磁珠對樣品中的金黃葡萄球菌進(jìn)行了快速分離檢驗(yàn)。取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁場下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對照。結(jié)果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。對磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。例2：劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內(nèi)富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達(dá)100CFU，同時磁珠可保持活性達(dá)3周以上。第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1.5副溶血性弧菌的檢測Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測從環(huán)境來源的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌，分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象陽性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為03:K6。第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日IMB技術(shù)優(yōu)點(diǎn)該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比,極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMS可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物,IMS為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.1.6 其他致病菌的檢測志賀氏菌例：Islam等應(yīng)用O抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠，快速檢測糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯(lián)合法檢測志賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7h)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌例：Kapperud等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開來。第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.2免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用2.2.1免疫磁珠與PCR的聯(lián)用鑒于PCR技術(shù)靈敏度較低這一缺點(diǎn)，將免疫磁珠技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了新的檢測系統(tǒng)——磁免疫PCR。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對樣品進(jìn)行前處理，將菌進(jìn)行富集裂解，再以iap基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，而且十分靈敏。第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.2.2免疫磁珠與ELISA的聯(lián)用利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗體致敏，制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)親和素建立ELISA檢測系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結(jié)果用該方法對甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng／mL。免疫磁性捕獲ELISA檢測技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法。

第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.2.3免疫磁珠與發(fā)光檢測手段的聯(lián)用發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析等。

免疫磁珠熒光微球第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.3IMB技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用2.3.1免疫檢測IMB技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測，它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，它可以檢測腫瘤細(xì)胞，如骨髓中腫瘤細(xì)胞的檢測和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的檢測。另外這種技術(shù)還可以對腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向治療和免疫磁性凈化治療。第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.3.2細(xì)胞分離細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個方面，傳統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時，有的十分昂貴，由于免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時只需要抗體和磁鐵，既簡便靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。分離細(xì)胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液中分離靶細(xì)胞的方法稱為陽性分