河南科技大學微生物工程學課件第四章發(fā)酵工藝的控制

發(fā)酵工藝的控制

第四章發(fā)酵工藝的控制第四章工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個最適的環(huán)境，使我們所需要的代謝活動得以最充分的表達。工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個最適的環(huán)境，使我們一、溫度對發(fā)酵的影響及控制1，影響發(fā)酵溫度的因素產(chǎn)熱因素：生物熱攪拌熱散熱因素：蒸發(fā)熱輻射熱一、溫度對發(fā)酵的影響及控制1，影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。

Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射發(fā)酵熱發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。生物熱：生物熱是生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為CO2,NH3時釋放出的大量能量。用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動熱能散發(fā)影響生物熱的因素：生物熱隨菌株，培養(yǎng)基，發(fā)酵時期的不同而不同。生物熱的大小還與菌體的呼吸強度有對應關系。生物熱：生物熱是生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳實驗發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號的生物熱高于低產(chǎn)量批號的生物熱。說明抗生素合成時微生物的新陳代謝十分旺盛。

1、抗生素相對活性為12、抗生素相對活性為0.5發(fā)酵過程中生物熱的變化實驗發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號的生物熱高于低產(chǎn)量批號的生物熱。說明攪拌熱：通風發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液體之間，液體與設備之間的摩擦而產(chǎn)生的熱。

Q攪拌=3600（P/V）3600：熱功當量（kJ/（kW.h））（P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（kW/m3）攪拌熱：通風發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液體之間，蒸發(fā)熱：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化。空氣進入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進行熱交換。同時必然會引起水分的蒸發(fā)；蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。蒸發(fā)熱的計算：

Q蒸發(fā)=G（I2-I1）

G：空氣流量，按干重計算，kg/h

I1、I2：進出發(fā)酵罐的空氣的熱焓量，J/kg（干空氣）蒸發(fā)熱：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同輻射熱：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。輻射熱可通過罐內(nèi)外的溫差求得，一般不超過發(fā)酵熱的5%。輻射熱：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。影響各種酶的反應速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)影響產(chǎn)物質(zhì)量影響生物合成的方向例如，四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時能產(chǎn)生金霉素。在低于30℃溫度下，該菌種合成金霉素能力較強。當溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高。在溫度達35℃則只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。2，溫度對發(fā)酵的影響影響各種酶的反應速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)2，溫度對發(fā)酵的影響最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生長或發(fā)酵產(chǎn)物的生成。最適發(fā)酵溫度與菌種，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件和菌體生長階段有關。最適發(fā)酵溫度的選擇在發(fā)酵的整個周期內(nèi)僅選一個最適培養(yǎng)溫度不一定好。溫度的選擇要參考其它發(fā)酵條件。溫度的選擇還應考慮培養(yǎng)基成分和濃度3，最適溫度的確定最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生長或發(fā)酵產(chǎn)發(fā)酵罐：夾套（10M3以下）盤管（蛇管）（10M3以上）4，溫度的控制4，溫度的控制河南科技大學微生物工程學課件第四章發(fā)酵工藝的控制二、pH對發(fā)酵的影響及控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標，是一項重要的發(fā)酵參數(shù)。它對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。盡管多數(shù)微生物能在3－4個pH單位的pH范圍內(nèi)生長，但是在發(fā)酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使pH在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。二、pH對發(fā)酵的影響及控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物1，pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響pH影響酶的活性pH影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)pH影響培養(yǎng)基某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解pH影響菌體代謝過程，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變1，pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響pH影響酶的活性2，發(fā)酵過程中pH的變化生長階段：pH有上升或下降趨勢（相對于接種后起始pH而言）生成階段：pH趨于穩(wěn)定，維持在最適產(chǎn)物合成的范圍。自溶階段：隨著基質(zhì)的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH上升，此時菌絲趨于自溶而代謝活動終止。2，發(fā)酵過程中pH的變化生長階段：pH有上升或下降趨勢（相碳源過量，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加之溶解氧不足，致使有機酸大量積累而pH下降。消泡油添加過量生理酸性物質(zhì)的存在（NH2SO4），氨被利用，pH下降3，引起pH下降的因素3，引起pH下降的因素氮源過多,生理堿性物質(zhì)的存在（NaNO3），中間補料，氨水或尿素等堿性物質(zhì)的加入過多使pH上升。4，引起pH上升的因素4，引起pH上升的因素原則：有利于菌體生長和產(chǎn)物的合成。一般根據(jù)實驗結(jié)果確定。最適pH與菌株，培養(yǎng)基組成，發(fā)酵工藝有關。應按發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的pH范圍。5，最適pH的選擇原則：有利于菌體生長和產(chǎn)物的合成。一般根據(jù)實驗結(jié)果確定。5，●大多數(shù)細菌生長的最適pH6.3～7.5●霉菌最適生長pH3～6●放線菌生長最適

pH7～8●大多數(shù)細菌生長的最適pH6.3～7.5●霉菌最適生最適pH與微生物生長、產(chǎn)物形成的四種類型：菌體比生長速率μ和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率QP的最適pH在一個相似的較寬的范圍內(nèi)（比較容易控制）；μ較寬，Qp范圍較窄，或μ較窄，Qp范圍較寬（難控制，應嚴格控制）；μ和Qp對pH都很敏感，其最適pH相同（應嚴格控制）；更復雜，μ和Qp對pH都很敏感，并有各自的最適pH（難度最大）；最適pH與微生物生長、產(chǎn)物形成的四種類型：河南科技大學微生物工程學課件第四章發(fā)酵工藝的控制調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的配方調(diào)節(jié)碳氮比（C/N）添加緩沖劑，例如加入輕質(zhì)CaCO3補料控制直接加酸加堿補加碳源或氮源，例如可以根據(jù)生產(chǎn)菌的代謝需要用改變加糖速率來控制pH,也可通過中間補加尿素或硫酸銨等調(diào)節(jié)6，pH的控制調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的配方6，pH的控制大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約6000倍左右(氧在水中的飽和度約為l0mg/L)

。許多發(fā)酵的生產(chǎn)能力受到氧利用限制，因此氧成為影響發(fā)酵效率的重要因素。三、氧對發(fā)酵的影響大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的。三、氧對發(fā)酵的影響基質(zhì)微生物g氧/g干菌體葡萄糖大腸桿菌0.4甲醇假單孢菌1.2辛烷假單孢菌1.7生長于不同基質(zhì)上的不同微生物的需氧要求基質(zhì)微生物g氧/g干菌體葡萄糖大腸桿菌0.4甲醇假單1.臨界氧濃度（C臨）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，或微生物對發(fā)酵液中溶解氧濃度的最低要求。DissolvedOxygenConcentrationQO2Ccritical1.臨界氧濃度（C臨）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，■某些微生物的臨界氧濃度微生物溫度（?C）臨界氧濃度（mmol/L）固氮菌300.018大腸桿菌370.008酵母300.004產(chǎn)黃青霉240.022■某些微生物的臨界氧濃度微生物溫度（?C）臨界氧濃度固2、溶氧對發(fā)酵的影響溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受到干擾。發(fā)酵工業(yè)的目標是要得到菌體發(fā)酵的產(chǎn)物而不是菌體本身。因此，由氧饑餓而引起的細胞代謝干擾，可能對形成某些產(chǎn)物是有利的。當提供的氧濃度遠大于臨界值時，雖對菌體形成無妨，但也許能刺激產(chǎn)物的形成。某種產(chǎn)物形成的最佳條件可能不同于菌體生長的最佳通氣條件。2、溶氧對發(fā)酵的影響溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受根據(jù)需氧不同，可將初級代謝發(fā)酵分為：

a.供氧充足條件下，產(chǎn)量最大；若供氧不足，合成受強烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等

b.供氧充足條件下，可得最高產(chǎn)量；若供氧受限，產(chǎn)量受影響不明顯；如：異亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸等

c.若供氧受限，細胞呼吸受抑制時，才獲得最大量產(chǎn)物；若供氧充足，產(chǎn)物形成反而受抑制；如：亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸等根據(jù)需氧不同，可將初級代謝發(fā)酵分為：但在實際生產(chǎn)過程中需注意：溶解氧濃度過低（代謝異常，產(chǎn)量降低）溶解氧濃度過高（代謝異常，菌體提前自溶）但在實際生產(chǎn)過程中需注意：3、發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，此時需氧超過供氧，溶氧明顯下降發(fā)酵中后期，溶氧濃度明顯地受工藝控制手段的影響，如補料的數(shù)量、時機和方式等發(fā)酵后期由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會明顯地上升3、發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不4、溶氧的控制調(diào)節(jié)通風與攪拌限制基礎培養(yǎng)基的濃度，使發(fā)酵器內(nèi)的生物體濃度維持于適當水平；并以補料方式供給某些營養(yǎng)成分而控制菌體生長率和呼吸率。

4、溶氧的控制調(diào)節(jié)通風與攪拌四、發(fā)酵過程中的泡沫及其控制1，泡沫的性質(zhì)泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系。泡沫間被一層液膜隔開而彼此不相連通。發(fā)酵過程中所遇到的泡沫，其分散相是無菌空氣和代謝氣體，連續(xù)相是發(fā)酵液。四、發(fā)酵過程中的泡沫及其控制1，泡沫的性質(zhì)一類存在于發(fā)酵液的液面上，這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辮的界線。如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液中所見到的。另一種泡沫是出現(xiàn)在粘稠的菌絲發(fā)酵液當中。這種泡沫分散很細，而且很均勻，也較穩(wěn)定。泡沫與液體間沒有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。2，泡沫的類型一類存在于發(fā)酵液的液面上，這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡由外界引進的氣流被機械地分散形成（通風、攪拌）發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成（發(fā)泡性物質(zhì)）。3，泡沫產(chǎn)生的原因由外界引進的氣流被機械地分散形成（通風、攪拌）3，泡沫產(chǎn)生的降低發(fā)酵設備的利用率增加了菌群的非均一性增加了染菌的機會導致產(chǎn)物的損失消泡劑會給后提取工序帶來困難4，泡沫對發(fā)酵的不利影響降低發(fā)酵設備的利用率4，泡沫對發(fā)酵的不利影響通氣與攪拌的強度培養(yǎng)基的配比及原材料組成培養(yǎng)基的破壞程度接種量的大小培養(yǎng)液本身性質(zhì)的變化染菌5，影響泡沫穩(wěn)定的因素通氣與攪拌的強度5，影響泡沫穩(wěn)定的因素不同攪拌速度和通氣量對泡沫影響不同攪拌速度和通氣量對泡沫影響不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用滅菌時間對泡沫穩(wěn)定性的影響

滅菌時間對泡沫穩(wěn)定性的影響6，發(fā)酵過程泡沫的變化6，發(fā)酵過程泡沫的變化7，發(fā)酵過程泡沫控制的方法物理消沫法化學消沫法7，發(fā)酵過程泡沫控制的方法物理消沫法物理消泡法方法罐內(nèi)消沫法：罐外消沫法：原理靠機械力引起強烈振動或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機械力將排出氣體中的液體加以分離回收。優(yōu)點不需要引進外界物質(zhì)、節(jié)省原材料、減少污染機會缺點不能從根本眾消除引起穩(wěn)定泡沫的因素。物理消泡法方法原理優(yōu)點缺點化學消泡法機理當泡沫的表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成雙電層時，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機械強度或加入某些具有強極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液膜上的空間，降低液膜強度，使泡沫破裂。當泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導致泡沫破裂?；瘜W消泡法機理消泡劑的種類和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。聚醚類：在生產(chǎn)上應用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又稱泡敵)。高級醇類：十八醇是較常用的一種，可以單獨或與載體一起使用。硅酮類：硅酮類消沫劑主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。消泡劑的種類和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉

純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。

所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產(chǎn)的其它微生物。

幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭遇雜菌或噬菌體的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或質(zhì)量，重者可能導致倒罐，甚至停產(chǎn)，造成原料、人力和設備動力的浪費。五、雜菌的防治

純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。五一、雜菌污染的原因與防治

1、從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因

1）從染菌的時間分析●早期（如接種后12h或24h），除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底?！裣喾?，中、后期染菌則可能與中間補料、設備滲漏以及操作不合理等有關，也可能是空氣過濾器不嚴所致。2）從污染的雜菌類型分析●

污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設備存在死角所致；●污染無芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸汽的冷凝水中帶來的，或空氣系統(tǒng)不嚴造成。3）從發(fā)酵罐及批次分析大批發(fā)酵罐染菌是指整個工廠各個產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成的。個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設備問題而造成的。如閥門的滲漏或罐體破損，特別是蛇形管的穿孔，有時不易察覺。有時設備破損引起的染菌會出現(xiàn)每批染菌時間前移現(xiàn)象。個別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復雜，各種染菌途徑都有可能引起。一、雜菌污染的原因與防治1、從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因

根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、管道不嚴、設備死角）和空氣問題（過濾器不嚴、過濾器失效、過濾器受潮）為主，種子（二級種子染菌）次之，而培養(yǎng)基消毒不透的情況較少。根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、2、防止染菌要點（1）空氣系統(tǒng)

提高空壓機進口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過濾器失效。

如提高空壓機吸氣口位置并加強壓縮前的過濾；防止空氣冷卻器漏水而進入空氣系統(tǒng)；在空氣過濾器滅菌時要防止沖翻介質(zhì)而短路，防止烤焦介質(zhì)或著火；裝填纖維介質(zhì)時要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。2、防止染菌要點（1）空氣系統(tǒng)提高空壓機進口（2）設備

●發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴密度?！裼贸瑑艄ぷ髋_及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度?！襁B消設備的連消塔要簡單，易拆裝清理，操作時蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。（2）設備●發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免（3）工藝操作

①空罐準備放罐后應進行全面檢查和清洗。蛇管和夾層要按設計規(guī)定的壓力定期試壓?？障麜r應先將罐內(nèi)空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌。

②實罐滅菌

配制培養(yǎng)基時要防止原料結(jié)塊。配料罐出口應有篩板過濾器（篩孔直徑≤0.5mm），以防塊狀物及異物進入罐內(nèi)。滅菌時，要保證各路進氣暢通及罐內(nèi)料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力，嚴防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。

（3）工藝操作①空罐準備放罐后應進行全面檢查和清洗。④補料

補入發(fā)酵罐內(nèi)的料液一定要保證無菌。

⑤種子

有關種子操作的制度要嚴格遵守；搖瓶瓶塞要確保嚴密。④補料⑤種子⑥無菌試驗無菌試驗要嚴格取樣操作，力求減少誤差。應同時用肉湯和雙碟作對照，以便迅速作出判斷。當發(fā)現(xiàn)染菌時，要通過分辨菌型來探索菌源，并對雜菌做耐熱試驗考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進發(fā)酵罐。⑥無菌試驗3、無菌檢查與染菌的處理

為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中分別進行無菌檢查，以便及時發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時進行必要處理是很重要的。

（1）無菌檢查

◆染菌通常通過3個途徑發(fā)現(xiàn)：無菌試驗、發(fā)酵液直接鏡檢、發(fā)酵液的生化分析。其中無菌試驗是判斷染菌的主要依據(jù)。

◆無菌試驗方法有雙碟培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)等，其中以雙碟和肉湯培養(yǎng)為主。3、無菌檢查與染菌的處理為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過（2）染菌的判斷

◆

以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應為主，鏡檢為輔?！裘?h一次的無菌檢查，至少用2只酚紅肉湯及1只雙碟同時取樣?！魺o菌試驗時，如果肉湯連續(xù)3次變色（紅→黃）或產(chǎn)生渾濁，或雙碟培養(yǎng)連續(xù)3次有雜菌菌落，即判斷為染菌。（2）染菌的判斷◆以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應為主，鏡檢為輔（3）染菌的處理

發(fā)現(xiàn)染菌后，應立即根據(jù)染菌的種類及產(chǎn)生菌的菌齡等具體情況分別進行處理。除據(jù)染菌時間及危害程度對污染罐進行挽救或處理外，對有關設備也應進行處理。◆發(fā)酵中后期染菌，可加入適當?shù)臍⒕鷦┗蚩股兀换虬迅邌挝坏暮笃诎l(fā)酵液壓一部分到染菌罐中，抑制雜菌生長速度；或者降低罐溫，減緩雜菌繁殖速度?！舴N子罐染菌后，種子不能再接入發(fā)酵罐中，這時可用備用種子接種。如無備用種子，則可選一適當培養(yǎng)齡的發(fā)酵罐培養(yǎng)物作種子，即生產(chǎn)上所說的“倒種”?！舭l(fā)酵罐前期染菌后，如培養(yǎng)基中C、N含量尚高，則可重新滅菌，接種后再運轉(zhuǎn)；若染的雜菌危害性較大，則放掉部分料液，補入新料液，重新滅菌、接種。（3）染菌的處理發(fā)現(xiàn)染菌后，應立即根據(jù)染菌的種類及產(chǎn)生六.染噬菌體的防治六.染噬菌體的防治1.染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現(xiàn)發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復連續(xù)感染，使生產(chǎn)無法進行，甚至使種子全部喪失。1.染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體

染噬菌體表現(xiàn)為：鏡檢可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴重時完全看不到菌體，且是在短時間內(nèi)菌體自溶。發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時之內(nèi)可達8.0以上，不再下降。發(fā)酵液殘?zhí)歉撸写碳こ粑?，粘度大，泡沫多。生產(chǎn)量甚少或增長緩慢或停止有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗染噬菌體表現(xiàn)為：2.產(chǎn)生噬菌體的原因

通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體的危害，經(jīng)過1~2年以后，主要是由于生產(chǎn)和試驗過程中不斷不加注意地把許多活菌體排放到環(huán)境中去，自然界中的噬菌體就在活菌體中大量生長，造成了自然界中噬菌體增殖的好機會。這些噬菌體隨著風沙塵土和空氣流動傳播，以及人們的走動、車輛的往來也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體有可能潛入生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，尤其是通過空氣系統(tǒng)進入種子室、種子罐、發(fā)酵罐。2.產(chǎn)生噬菌體的原因通常在工廠投產(chǎn)初期并不感到噬菌體3.染噬菌體的檢測

在培養(yǎng)皿上倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點種在上層培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)過夜，觀察有無透明圈出現(xiàn)。3.染噬菌體的檢測噬菌斑噬菌斑4.噬菌體的防治

1、必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度，定期檢查、定期清掃，車間四周有嚴重污染噬菌體的地方應及時撒石灰或漂白粉。

2、車間地面和通往車間的道路盡量采取水泥地面

3、種子和發(fā)酵工段的操作人員要嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，認真地進行種子保管，不使用本身帶有噬菌體的菌種。感染噬菌體的培養(yǎng)物不得帶入菌種室、搖瓶間4.噬菌體的防治1、必須建立工廠環(huán)境清潔衛(wèi)生制度

4、認真進行發(fā)酵罐、補料系統(tǒng)的滅菌。嚴格控制逃液和取樣分析和洗罐所廢棄的菌體。對倒罐所排放的廢液應滅菌后才可排放。

5、選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種。

6、發(fā)現(xiàn)噬菌體停攪拌、小通風，將發(fā)酵液加熱到70~800C殺死噬菌體，才可排放。發(fā)酵罐周圍的管道也必須徹底滅菌。4、認真進行發(fā)酵罐、補料系統(tǒng)的滅菌。嚴格控制逃液和發(fā)酵工藝的控制

第四章發(fā)酵工藝的控制第四章工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個最適的環(huán)境，使我們所需要的代謝活動得以最充分的表達。工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個最適的環(huán)境，使我們一、溫度對發(fā)酵的影響及控制1，影響發(fā)酵溫度的因素產(chǎn)熱因素：生物熱攪拌熱散熱因素：蒸發(fā)熱輻射熱一、溫度對發(fā)酵的影響及控制1，影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。

Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射發(fā)酵熱發(fā)酵熱就是發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量。生物熱：生物熱是生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為CO2,NH3時釋放出的大量能量。用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動熱能散發(fā)影響生物熱的因素：生物熱隨菌株，培養(yǎng)基，發(fā)酵時期的不同而不同。生物熱的大小還與菌體的呼吸強度有對應關系。生物熱：生物熱是生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳實驗發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號的生物熱高于低產(chǎn)量批號的生物熱。說明抗生素合成時微生物的新陳代謝十分旺盛。

1、抗生素相對活性為12、抗生素相對活性為0.5發(fā)酵過程中生物熱的變化實驗發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號的生物熱高于低產(chǎn)量批號的生物熱。說明攪拌熱：通風發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液體之間，液體與設備之間的摩擦而產(chǎn)生的熱。

Q攪拌=3600（P/V）3600：熱功當量（kJ/（kW.h））（P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（kW/m3）攪拌熱：通風發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機械運動造成液體之間，蒸發(fā)熱：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化?？諝膺M入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進行熱交換。同時必然會引起水分的蒸發(fā)；蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。蒸發(fā)熱的計算：

Q蒸發(fā)=G（I2-I1）

G：空氣流量，按干重計算，kg/h

I1、I2：進出發(fā)酵罐的空氣的熱焓量，J/kg（干空氣）蒸發(fā)熱：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同輻射熱：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。輻射熱可通過罐內(nèi)外的溫差求得，一般不超過發(fā)酵熱的5%。輻射熱：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過罐體向外輻射的熱量。影響各種酶的反應速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)影響產(chǎn)物質(zhì)量影響生物合成的方向例如，四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時能產(chǎn)生金霉素。在低于30℃溫度下，該菌種合成金霉素能力較強。當溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高。在溫度達35℃則只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。2，溫度對發(fā)酵的影響影響各種酶的反應速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)2，溫度對發(fā)酵的影響最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生長或發(fā)酵產(chǎn)物的生成。最適發(fā)酵溫度與菌種，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件和菌體生長階段有關。最適發(fā)酵溫度的選擇在發(fā)酵的整個周期內(nèi)僅選一個最適培養(yǎng)溫度不一定好。溫度的選擇要參考其它發(fā)酵條件。溫度的選擇還應考慮培養(yǎng)基成分和濃度3，最適溫度的確定最適溫度是一種相對概念，是指在該溫度下最適于菌的生長或發(fā)酵產(chǎn)發(fā)酵罐：夾套（10M3以下）盤管（蛇管）（10M3以上）4，溫度的控制4，溫度的控制河南科技大學微生物工程學課件第四章發(fā)酵工藝的控制二、pH對發(fā)酵的影響及控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標，是一項重要的發(fā)酵參數(shù)。它對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。盡管多數(shù)微生物能在3－4個pH單位的pH范圍內(nèi)生長，但是在發(fā)酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使pH在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。二、pH對發(fā)酵的影響及控制發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物1，pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響pH影響酶的活性pH影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)pH影響培養(yǎng)基某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解pH影響菌體代謝過程，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變1，pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響pH影響酶的活性2，發(fā)酵過程中pH的變化生長階段：pH有上升或下降趨勢（相對于接種后起始pH而言）生成階段：pH趨于穩(wěn)定，維持在最適產(chǎn)物合成的范圍。自溶階段：隨著基質(zhì)的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH上升，此時菌絲趨于自溶而代謝活動終止。2，發(fā)酵過程中pH的變化生長階段：pH有上升或下降趨勢（相碳源過量，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加之溶解氧不足，致使有機酸大量積累而pH下降。消泡油添加過量生理酸性物質(zhì)的存在（NH2SO4），氨被利用，pH下降3，引起pH下降的因素3，引起pH下降的因素氮源過多,生理堿性物質(zhì)的存在（NaNO3），中間補料，氨水或尿素等堿性物質(zhì)的加入過多使pH上升。4，引起pH上升的因素4，引起pH上升的因素原則：有利于菌體生長和產(chǎn)物的合成。一般根據(jù)實驗結(jié)果確定。最適pH與菌株，培養(yǎng)基組成，發(fā)酵工藝有關。應按發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的pH范圍。5，最適pH的選擇原則：有利于菌體生長和產(chǎn)物的合成。一般根據(jù)實驗結(jié)果確定。5，●大多數(shù)細菌生長的最適pH6.3～7.5●霉菌最適生長pH3～6●放線菌生長最適

pH7～8●大多數(shù)細菌生長的最適pH6.3～7.5●霉菌最適生最適pH與微生物生長、產(chǎn)物形成的四種類型：菌體比生長速率μ和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率QP的最適pH在一個相似的較寬的范圍內(nèi)（比較容易控制）；μ較寬，Qp范圍較窄，或μ較窄，Qp范圍較寬（難控制，應嚴格控制）；μ和Qp對pH都很敏感，其最適pH相同（應嚴格控制）；更復雜，μ和Qp對pH都很敏感，并有各自的最適pH（難度最大）；最適pH與微生物生長、產(chǎn)物形成的四種類型：河南科技大學微生物工程學課件第四章發(fā)酵工藝的控制調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的配方調(diào)節(jié)碳氮比（C/N）添加緩沖劑，例如加入輕質(zhì)CaCO3補料控制直接加酸加堿補加碳源或氮源，例如可以根據(jù)生產(chǎn)菌的代謝需要用改變加糖速率來控制pH,也可通過中間補加尿素或硫酸銨等調(diào)節(jié)6，pH的控制調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基的配方6，pH的控制大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約6000倍左右(氧在水中的飽和度約為l0mg/L)

。許多發(fā)酵的生產(chǎn)能力受到氧利用限制，因此氧成為影響發(fā)酵效率的重要因素。三、氧對發(fā)酵的影響大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的。三、氧對發(fā)酵的影響基質(zhì)微生物g氧/g干菌體葡萄糖大腸桿菌0.4甲醇假單孢菌1.2辛烷假單孢菌1.7生長于不同基質(zhì)上的不同微生物的需氧要求基質(zhì)微生物g氧/g干菌體葡萄糖大腸桿菌0.4甲醇假單1.臨界氧濃度（C臨）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，或微生物對發(fā)酵液中溶解氧濃度的最低要求。DissolvedOxygenConcentrationQO2Ccritical1.臨界氧濃度（C臨）：指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，■某些微生物的臨界氧濃度微生物溫度（?C）臨界氧濃度（mmol/L）固氮菌300.018大腸桿菌370.008酵母300.004產(chǎn)黃青霉240.022■某些微生物的臨界氧濃度微生物溫度（?C）臨界氧濃度固2、溶氧對發(fā)酵的影響溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受到干擾。發(fā)酵工業(yè)的目標是要得到菌體發(fā)酵的產(chǎn)物而不是菌體本身。因此，由氧饑餓而引起的細胞代謝干擾，可能對形成某些產(chǎn)物是有利的。當提供的氧濃度遠大于臨界值時，雖對菌體形成無妨，但也許能刺激產(chǎn)物的形成。某種產(chǎn)物形成的最佳條件可能不同于菌體生長的最佳通氣條件。2、溶氧對發(fā)酵的影響溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受根據(jù)需氧不同，可將初級代謝發(fā)酵分為：

a.供氧充足條件下，產(chǎn)量最大；若供氧不足，合成受強烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等

b.供氧充足條件下，可得最高產(chǎn)量；若供氧受限，產(chǎn)量受影響不明顯；如：異亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸等

c.若供氧受限，細胞呼吸受抑制時，才獲得最大量產(chǎn)物；若供氧充足，產(chǎn)物形成反而受抑制；如：亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸等根據(jù)需氧不同，可將初級代謝發(fā)酵分為：但在實際生產(chǎn)過程中需注意：溶解氧濃度過低（代謝異常，產(chǎn)量降低）溶解氧濃度過高（代謝異常，菌體提前自溶）但在實際生產(chǎn)過程中需注意：3、發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，此時需氧超過供氧，溶氧明顯下降發(fā)酵中后期，溶氧濃度明顯地受工藝控制手段的影響，如補料的數(shù)量、時機和方式等發(fā)酵后期由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會明顯地上升3、發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不4、溶氧的控制調(diào)節(jié)通風與攪拌限制基礎培養(yǎng)基的濃度，使發(fā)酵器內(nèi)的生物體濃度維持于適當水平；并以補料方式供給某些營養(yǎng)成分而控制菌體生長率和呼吸率。

4、溶氧的控制調(diào)節(jié)通風與攪拌四、發(fā)酵過程中的泡沫及其控制1，泡沫的性質(zhì)泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系。泡沫間被一層液膜隔開而彼此不相連通。發(fā)酵過程中所遇到的泡沫，其分散相是無菌空氣和代謝氣體，連續(xù)相是發(fā)酵液。四、發(fā)酵過程中的泡沫及其控制1，泡沫的性質(zhì)一類存在于發(fā)酵液的液面上，這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辮的界線。如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液中所見到的。另一種泡沫是出現(xiàn)在粘稠的菌絲發(fā)酵液當中。這種泡沫分散很細，而且很均勻，也較穩(wěn)定。泡沫與液體間沒有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。2，泡沫的類型一類存在于發(fā)酵液的液面上，這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡由外界引進的氣流被機械地分散形成（通風、攪拌）發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成（發(fā)泡性物質(zhì)）。3，泡沫產(chǎn)生的原因由外界引進的氣流被機械地分散形成（通風、攪拌）3，泡沫產(chǎn)生的降低發(fā)酵設備的利用率增加了菌群的非均一性增加了染菌的機會導致產(chǎn)物的損失消泡劑會給后提取工序帶來困難4，泡沫對發(fā)酵的不利影響降低發(fā)酵設備的利用率4，泡沫對發(fā)酵的不利影響通氣與攪拌的強度培養(yǎng)基的配比及原材料組成培養(yǎng)基的破壞程度接種量的大小培養(yǎng)液本身性質(zhì)的變化染菌5，影響泡沫穩(wěn)定的因素通氣與攪拌的強度5，影響泡沫穩(wěn)定的因素不同攪拌速度和通氣量對泡沫影響不同攪拌速度和通氣量對泡沫影響不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用滅菌時間對泡沫穩(wěn)定性的影響

滅菌時間對泡沫穩(wěn)定性的影響6，發(fā)酵過程泡沫的變化6，發(fā)酵過程泡沫的變化7，發(fā)酵過程泡沫控制的方法物理消沫法化學消沫法7，發(fā)酵過程泡沫控制的方法物理消沫法物理消泡法方法罐內(nèi)消沫法：罐外消沫法：原理靠機械力引起強烈振動或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機械力將排出氣體中的液體加以分離回收。優(yōu)點不需要引進外界物質(zhì)、節(jié)省原材料、減少污染機會缺點不能從根本眾消除引起穩(wěn)定泡沫的因素。物理消泡法方法原理優(yōu)點缺點化學消泡法機理當泡沫的表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成雙電層時，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機械強度或加入某些具有強極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液膜上的空間，降低液膜強度，使泡沫破裂。當泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導致泡沫破裂?；瘜W消泡法機理消泡劑的種類和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。聚醚類：在生產(chǎn)上應用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又稱泡敵)。高級醇類：十八醇是較常用的一種，可以單獨或與載體一起使用。硅酮類：硅酮類消沫劑主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。消泡劑的種類和性能天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉

純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。

所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產(chǎn)的其它微生物。

幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭遇雜菌或噬菌體的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或質(zhì)量，重者可能導致倒罐，甚至停產(chǎn)，造成原料、人力和設備動力的浪費。五、雜菌的防治

純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。五一、雜菌污染的原因與防治

1、從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因

1）從染菌的時間分析●早期（如接種后12h或24h），除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底?！裣喾?，中、后期染菌則可能與中間補料、設備滲漏以及操作不合理等有關，也可能是空氣過濾器不嚴所致。2）從污染的雜菌類型分析●

污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設備存在死角所致；●污染無芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸汽的冷凝水中帶來的，或空氣系統(tǒng)不嚴造成。3）從發(fā)酵罐及批次分析大批發(fā)酵罐染菌是指整個工廠各個產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成的。個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設備問題而造成的。如閥門的滲漏或罐體破損，特別是蛇形管的穿孔，有時不易察覺。有時設備破損引起的染菌會出現(xiàn)每批染菌時間前移現(xiàn)象。個別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復雜，各種染菌途徑都有可能引起。一、雜菌污染的原因與防治1、從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因

根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、管道不嚴、設備死角）和空氣問題（過濾器不嚴、過濾器失效、過濾器受潮）為主，種子（二級種子染菌）次之，而培養(yǎng)基消毒不透的情況較少。根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設備問題（設備滲漏、2、防止染菌要點（1）空氣系統(tǒng)

提高空壓機進口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過濾器失效。

如提高空壓機吸氣口位置并加強壓縮前的過濾；防止空氣冷卻器漏水而進入空氣系統(tǒng)；在空氣過濾器滅菌時要防止沖翻介質(zhì)而短路，防止烤焦介質(zhì)或著火；裝填纖維介質(zhì)時要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。2、防止染菌要點（1）空氣系統(tǒng)提高空壓機進口（2）設備

●發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴密度?！裼贸瑑艄ぷ髋_及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度?！襁B消設備的連消塔要簡單，易拆裝清理，操作時蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。（2）設備●發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，避免（3）工藝操作

①空罐準備放罐后應進行全面檢查和清洗。蛇管和夾層要按設計規(guī)定的壓力定期試壓。空消時應先將罐內(nèi)空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌。

②實罐滅菌

配制培養(yǎng)基時要防止原料結(jié)塊。配料罐出口應有篩板過濾器（篩孔直徑≤0.5mm），以防塊狀物及異物進入罐內(nèi)。滅菌時，要保證各路進氣暢通及罐內(nèi)料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力，嚴防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。

（3）工藝操作①空罐準備放罐后應進行全面檢查和清洗。④補料

補入發(fā)酵罐內(nèi)的料液一定要保證無菌。

⑤種子

有關種子操作的制度要嚴格遵守；搖瓶瓶塞要確保嚴密。④補料⑤種子⑥無菌試驗無菌試驗要嚴格取樣操作，力求減少誤差。應同時用肉湯和雙碟作對照，以便迅速作出判斷。當發(fā)現(xiàn)染菌時，要通過分辨菌型來探索菌源，并對雜菌做耐熱試驗考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進發(fā)酵罐。⑥無菌試驗3、無菌檢查與染菌的處理

為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中分別進行無菌檢查，以便及時發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時進行必要處理是很重要的。

（1）無菌檢查