發(fā)育生物學課件

Morphogenesis:VertebrateLimbDevelopment第十四章附肢的發(fā)育和再生附肢發(fā)育的研究是發(fā)育生物學的一個重要課題。脊椎動物，特別是鳥類和兩棲類附肢（limb）的發(fā)育包含了大量的、各種各樣的誘導作用。有尾類的蠑螈和美西螈附肢具有明顯的再生能力，是研究再生的極好模型。一、脊椎動物附肢的發(fā)育脊椎動物的附肢是一個極其復雜的器官，每一塊骨和肌肉的位置都被精密地組織在一起。附肢在三個基本軸上是不對稱的，但左前肢總是和右前肢呈鏡面對稱。脊椎動物的附肢都是由體壁中胚層和外部的表皮共同組成的。孵化10天的完整雞翅標本，示三個發(fā)育軸：近側-遠側軸、前后軸及背腹軸。在所有的四足動物中，附肢發(fā)育的基本形態(tài)發(fā)生原則（basicmorphogeneticrules）是相同的。構建一個附肢所需要的位置信息要在一個三維（或包括時間在內的四維）的、相互協(xié)調的系統(tǒng)中發(fā)揮作用?，F在已鑒定了一系列蛋白，在附肢近遠軸、前后軸和背腹軸的形成過程中發(fā)揮作用。1、附肢的起源脊椎動物的附肢在起源上是由胚胎體壁向外生長形成的，主要是由來自中胚層的疏松間質形成的中央核，以及來自外胚層的表皮兩大部分組成。附肢的原基稱為附肢芽（limbbud）。附肢芽形成的位置在每一物種是恒定的，由Hox基因沿身體前后軸表達的水平決定。雞胚胎的肢芽。孵化后第三天胚胎的側面出現肢芽翅肢芽腿肢芽頂外胚層嵴美西螈（Ambystomamaculatum）的預定前肢場前腎肩帶腮周側翼組織附肢腮體節(jié)2、附肢的早期發(fā)育附肢早期發(fā)育的第一個跡象是體節(jié)中胚層細胞沿胚胎長軸的增殖，逐漸在表皮的下面形成厚的細胞團,它們從附肢場的側板中胚層和體節(jié)中胚層分離出來，進而轉變?yōu)殚g質細胞進行遷移。附肢的發(fā)育開始于間質細胞從附肢的骨骼前體細胞(limbskeletalprecursors)和附肢的肌肉前體細胞(limbmuscleprecursors)分離后的增殖，這些細胞在內胚層組織下聚集并形成一環(huán)狀的突起，此突起稱為肢芽。

Inductionoftheearlylimbbud:Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)肢芽形成的信號來自于側板中胚層(lateralplatemesoderm)細胞，這些細胞會分泌成纖維生長因子FGF10，而FGF10能夠促使外胚層和中胚層之間分肢形成的交互作用。當含有FGF10的小珠子被放置于側翼內胚層下方，會有額外的分肢形成。

(A)在分肢正常形成之處的側板中胚層lateralplatemesoderm里，有FGF10表現。(B)當將會分泌FGF10的細胞轉植于雞胚的側翼時，FGF10會使一異位的分肢形成。

FGF10的表達及其在雞肢發(fā)育過程中的作用Wntproteinsandfibroblastgrowthfactors(FGFs)FGF10原本分布于整個側板中胚層，但是在附肢形成之前，FGF10便被限制在側板中胚層將形成附肢的區(qū)域，FGF10被限制主要與Wntproteins有關。孵化48－54h雞胚附肢芽開始形成的分子模型如圖所示，一開始FGF10表現于整個側板中胚層，然后在后肢形成之處，受到Wnt8c限制。而在前肢形成之處，則受到Wnt2b限制。FGF10經由外胚層的Wnt3a來誘發(fā)頂外胚層嵴(AER)中的FGF8表現，FGF8能誘導并維持Wntproteins表現，使得FGF10于側板中胚層內能連續(xù)性地表現。頂外胚層嵴前肢、后肢的分化Gain-of-function實驗結果表明，轉錄因子TBX4和TBX5分別與后肢和前肢的特化有關。Loss-of-function資料也表明，人類TBX5基因缺失會導致上肢和心臟的異常，但下肢基本不受影響。TBX4和TBX5在FGF10誘導形成的肢芽中的表達異位表達TBX4，可以使FGF10誘導形成的前肢轉變?yōu)楹笾珤呙桦婄R觀察孵化4.5天的雞胚肢芽，顯示頂外胚層嵴AER。附肢發(fā)育中外胚層和中胚層間的相互作用附肢的向外生長涉及AER和中胚層間持續(xù)的相互作用。一旦中胚層誘導其上方的外胚層形成AER，AER與中胚層的相互作用對附肢的向外生長是最重要的。中胚層在附肢發(fā)育中也起著關鍵的作用。AER起初的形成和繼續(xù)存在依賴于位于其下方的中胚層。漸進帶(PZ)在附肢發(fā)育中的作用漸進帶位于肢芽的頂端，由快速分裂和增值的未分化細胞組成。頂外胚層嵴位于漸進帶的上表面。不同時期的ZP細胞的移植對附肢發(fā)育有著不同的影響(見下圖)AER對下方的漸進帶發(fā)出信號，如將AER移植到早期肢芽的背部將誘導異位生長。Themajorsignalisfibroblastgrowthfactors,FGF-8throughoutridgeandFGF-4intheposteriorregion.

漸進帶（PZ）細胞控制近－遠端分化A.將早期翅芽的PZ移植到已經形成尺骨和撓骨的晚期翅芽中，形成額外的尺骨和撓骨。B.將晚期翅芽的PZ移植到早期翅芽中，中間結構缺失。附肢發(fā)育中至少要求三種類型的外胚層和中胚層間的相互作用：第一，中胚層起始附肢芽向外生長和形成AER；第二，AER進一步刺激肢芽的向外生長以及肢芽中胚層的增殖和分化；第三，附肢芽中胚層提供保持AER所必須的刺激。近遠軸（P-D)的發(fā)育附肢沿近遠軸的分化是由AER和附肢中胚層誘導的相互作用產生的。附肢芽的逐漸向外生長是由于位于AER下面間質細胞的增殖，而AER釋放的分子維持間質細胞不斷進行分裂。由AER合成、釋放到其下的間質中的成纖維細胞生長因子FGF可能是雞胚中維持間質細胞增殖的分子。如果AER在肢干發(fā)育的任何時期被移除，則末端肢更進一步的骨骼發(fā)育將會停止如果有過多的AER移植到一個已經存在的肢芽上，會形成多余的構造，此構造通常接近肢干的末端。如果腿部的間質組織直接被置放在翅膀的AER下，后肢的末端構造(腳指)會生長在翅膀的末端如果在AER下的肢干間質組織被非肢干的間質組織取代，那么AER會退化，并且枝干的發(fā)育會停止如果AER被一個裝有FGF的有孔小珠所取代，那么仍然可以發(fā)育成正常的肢干在肢干發(fā)育中，越早移除AER，則肢干的缺失越大。上圖分別為在第三天、第三又二分之一天、第四天移除AER以及不移除AER對翅膀生長的影響。頂外胚層嵴（AER)對于肢芽近遠軸圖式的發(fā)育是必須的生長因子可以替代頂外胚層嵴。將AER切除后，移植能釋放生長因子FGF-8的玻璃珠，可使肢幾乎正常發(fā)育。Specifyingthelimbmesoderm:DeterminingtheP/Dpolarityofthelimb

附肢沿P/D軸的分化是由AER和附肢中胚層誘導的相互作用產生的。PZ的間質細胞在其中起到重要作用。但是這些間質細胞如何特化近-遠軸？有兩個模式被提出來解釋這個現象：①漸進帶模式（progresszonemodel）重視“時間”的量度②早期定位與擴散模式（earlyallocationandprogenitorexpansionmodel）重視“空間”的量度

漸進帶模式（progresszonemodel）

Progresszonemodel是假設每個中胚層細胞被分化的原因，是由它在漸進帶(progresszone;PZ)中分裂所花的時間長短來決定。一個細胞在增長區(qū)所花的時間越長，它獲得越多有絲分裂的機會，而其構造越往遠程發(fā)展。既然增長區(qū)要維持一定的大小，當肢干生長時，細胞必須不斷離開增長區(qū)；一旦細胞離開，他們就形成軟骨組織。所以，第一個離開的細胞會變成stylopod(靠近體側部分，如肱骨)，而最后離開的細胞形成autopod(遠離體側部分，如指骨)，見下圖(A)早期定位與擴散模式Earlyallocationandprogenitorexpansionmodel認為肢芽在很早就已經分化了，后來的細胞分裂只是擴張已經分化的區(qū)域，見下圖(B)。當早期將AER移除的時候，這些特化的區(qū)域還沒擴張，所以大部分的間質細胞(在AER200μm之內)都死亡了，但當在較后期的胚胎階段，肢芽生長且區(qū)域擴張了，200μm的范圍只會刪除掉autopod的部分。

間質細胞特化近-遠軸的兩種模式Hoxgenes,meisgenes,andthespecificationoftheP/Daxis

同源基因(homologousgene)在附肢發(fā)育中起到重要作用，它可以用于解釋附肢發(fā)育中的所有主要現象。包括Hoxgenes決定附肢域(limbfield)，Hox-Dgenes決定指的特化等。同源基因比較右圖(A)為正常老鼠的前肢，而圖(B)為Hoxa-11與Hoxd-11兩基因都已突變失去功能的老鼠前肢，其橈骨跟尺骨皆已消失。Hoxgenes在P/Daxis形成中的作用Hoxgene特化前肢特定部分的假設Hox-9特化肩胛骨，Hox-10特化肱骨，Hox-11特化尺骨跟橈骨，Hox-12特化掌骨，Hox-13特化指骨。Hox基因在四肢形成期間的表現量改變情形。在肢柱形成時(phaseⅠ)，Hoxd-9與Hoxd-10表現在新形成的肢芽。而在形成肢桿時(phaseⅡ)，Hoxd-9到Hoxd-13都有表現在肢芽的后端，但只有Hox-9在前端跟后端都有表現。在肢身形成時，Hox基因的表現相反過來，Hoxd-13和Hoxa-13在前端跟后端都有表現，而Hoxd-10到Hoxd-12以及Hoxa-12表現在后端。Hox基因和附肢畸形

附肢畸形在人類發(fā)育中還是比較普遍的.大約1%的新生嬰兒有附肢前后軸向發(fā)育的缺陷人類的許多遺傳缺陷（如Shh

信號途徑或Hox基因突變）是導致附肢發(fā)育畸形的原因。Thehandshowsarelativelymilddefect,polydactyly(多指畸形).

Thepicturesbelowshowamuchmoreseverelimbphenotypethatisassociatedwithmutationsofthe

Hoxd13gene.Noticethedifferencebetweentheheterozygous(雜合型)ontheleftandathehomozygous(純合型)conditionontheright.Againwecanseetheimportantcontributionstounderstandinghumandiseasesthathavecomefromstudyingthelowlyfruitfly!果蠅和雞的翅膀發(fā)育相關基因比較示意圖Trulyamazingthatstructuresthatappearsodifferentandthatoccuronanimalsseparatedbymorethan600millionyearsofevolutionsharethefundamentalmolecularmechanismspatterning.附肢發(fā)育中背－腹軸的分化背－腹軸與來自中胚層和外胚層兩者的細胞特化相關背腹軸分化可能是由肢芽背部外胚層的特異性旁分泌因子(Wnt7a)

誘導產生的。背部中胚層同時誘導背部肢芽的rFng和Wnt7a分子表達。腹部中胚層誘導engrailed-1（en-1）在肢芽腹部表達。Dorsal-VentralAxisofLimbWnt-7a在背部外胚層中表達，它誘導背部中胚層的Lmx-1表達并特化背部軸向形成。rFng同樣也在背部外胚層中表達。en-1表達細胞和rFng表達細胞之間的相互抑制作用，將決定頂外胚層嵴AER的中部邊緣位置。En-1表達細胞與Wnt-7a相互抑制，由此對肢芽腹部區(qū)域進行定位.外胚層控制發(fā)育中肢的背腹軸圖式的形成。Wnt-7a在背部外胚層中表達，而Engrailed基因在腹部外胚層中表達。lmx-1基因在背中胚層中被Wnt-7a誘導表達，并且參與背部結構的確定中腎間質細胞前－后軸的特化

中胚層有一區(qū)域－極化活動區(qū)(ZPA)，從ZPA發(fā)出信號指導肢芽后端的位置定位。ZPA可擴散形態(tài)發(fā)生子模型(ZPAdiffusiblemorphogenmodel):ZPA組織通過分泌一種可溶性形態(tài)發(fā)生素起作用，該物質從ZPA向外擴散由肢芽后端向前端形成一種濃度梯度。RA(retinoicacid)：視黃酸

Tickle(1982):

retinoicacidcouldmimictheeffectsofZPAexperimentssupportedtheroleofRAastheZPAmorphogen

BryantandaJapanesegroup

(1987):

RAactedbyinducingZPAtissue

當極化活性區(qū)(thezoneofpolarizingactivity;ZPA)被移植到前端肢芽的中胚層時，一模一樣的手指如鏡像一般，從正常的手指的前端冒出。Specificationofthelimbfield:Hoxgenesandretinoicacid所有陸地的脊椎動物皆只有4個肢芽(limbbud：胚胎上的小突起，由此發(fā)育成肢)，而這4個肢芽皆在彼此的對面。雖然不同脊椎動物的附肢因為形成于不同體節(jié)而有所不同，但是附肢的位置卻是固定的，這與沿著體軸前后端的Hoxgene的表現有關。促使肢芽開始形成的重要物質為視黃酸(retinoicacid，RA)，倘若利用藥物阻斷視黃酸的合成，會因而阻礙肢芽的形成。Bryant和Gardiner(1992)推斷RA沿著體軸前后端形成的濃度梯度可能活化一些特定細胞內的同源基因，因而這些特定細胞被包含在limbfield內。而RA的來源可能是Hensen’snode。

(A)蝌蚪切除尾巴后，于再生的第一天，將尾端殘余的部分浸泡于retinoicacid。之后，蝌蚪于尾端殘余的部分長出許多腳。(B)蝌蚪切除尾巴后，沒有浸泡于RA，使其正常地再生。4周后，于notochord上方可見neuraltube，而肌肉也被包裹成束，卻沒有軟骨或骨頭生成。(C)浸泡于RA的尾端，箭頭所指之處可見肢芽和骨盆的軟骨及骨頭的生成。在右邊箭頭所指之處，更可見股骨的雛型。ShhgeneandZPAHedgehog(hh),asegmentpolaritygene（體節(jié)極性基因）thatwestudiedearlier,isinvolvedinwingpatterning.Riddle(1993)showedthatavertebratehomologofflyhh,calledsonichh(shh),isexpressedbytheZPA.hh基因在前端附肢原基的異位表達利用原位雜合技術顯示Shh蛋白質在ZPA的表現newlimbbudhasbeeninducedbyApplicationofaFGFsoakedbead

右圖為Sonichedgehog(shh)極化活性的分析試驗。先將shhgene插入雞病毒基因序列中鄰近促進子的地方，然后將此重組過的病毒放入培養(yǎng)的雞纖維組織原細胞中。將此經過病毒轉殖的細胞移植到雞胚胎肢芽的前端。結果也產生鏡像般的手指，顯示分泌的蛋白質有極化的活性。

在第17期，剛被誘導出來的AER分泌FGF8到底下的間質細胞。已表達Hoxb-8與dHand的間質細胞被誘導而產生shh，因此在前肢肢芽的后端形成極化活性區(qū)。AER和極化活性區(qū)(ZPA)之間回饋控制的效應第16期的前肢肢芽,兩期之間距離5h在第18期，SHH蛋白質維持FGF在AER中的表現，而AER中的FGF又能維持shh基因的表現。

居間中胚層側板中胚層表面外胚層三個軸的協(xié)調

附肢的3個軸是相互作用和相互協(xié)調的。特化這3個軸機制之間的主要循環(huán)包括(1)由AER(FGF8)和dHAND建立極化活性區(qū)(Sonichedgehog)；(2)由Sonichedgehog(在極化活性區(qū))誘導FGFs產生(在AER)，其方式是藉由Shh誘導Gremlin產生，而Gremlin會阻礙抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a維持Sonichedgehog的表現(在腹側外胚層部分)；(4)由Sonichedgehog阻礙Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)與Gli3抑制子的濃度梯度(gradient)。(1)由AER(FGF8)和dHAND建立極化活性區(qū)(Sonichedgehog)；(2)由Sonichedgehog(在極化活性區(qū))誘導FGFs產生(在AER)，其方式是藉由Shh誘導Gremlin產生，而Gremlin會阻礙抑制FGFs的BMP；(3)由Wnt7a維持Sonichedgehog的表現(在腹側外胚層部分)；(4)由Sonichedgehog阻礙Gli3分裂成抑制子(repressor)的形式，使得形成Gli3活化子(activator)與Gli3抑制子的濃度梯度(gradient)基因敲除實驗證明Wnt7a和En-1分子在附肢軸向形成的重要性Asummaryoftheimportantinteractionsamongthemajoraxialpatterningsystems.Thispredictsthatmutantionsaffectingprimarilyoneaxialsystemwillhavesignificantaffectsontheothers.Thishasbeendemonstratedexperimentallybymakingmouseknockoutsofmanyoftheseimportantmolecules.TheWnt7aKOmousehasaventralizedlimbthatisalsomissingposteriorpatternelementsandtruncated附肢發(fā)育過程中的分子信