化學(xué)發(fā)光磁酶免疫課件

化學(xué)發(fā)光磁酶免疫上世紀(jì)60年代出現(xiàn)的放射免疫分析法是近代分析檢測(cè)領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，該法靈敏度和準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)被廣泛采用。但這種方法也存在以下一些缺點(diǎn):1.由于采用具有放射性危害的I125為示蹤物，在試劑的制造、應(yīng)用和操作過程中，會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的傷害及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生難以處理的污染。2.由于放射性同位素的危害，國家對(duì)醫(yī)院開展放免分析方法作出了嚴(yán)格的限制和規(guī)定，制約了臨床診斷醫(yī)學(xué)的發(fā)展。3.由于放射性同位素半衰期的限制，決定了放射免疫分析試劑的有效期只有1~2個(gè)月。給試劑的制造、運(yùn)輸、用戶的使用帶來極大不便。化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescentimmunoassay,CLIA）是在上世紀(jì)70年代末由Halmann和Velan首先提出。該法與其他免疫分析方法如放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶免疫分析法相比，具有特異性好、敏感性高、線性范圍寬和儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法作為一種非放射性標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)，克服了放射免疫分析中放射性污染的問題，發(fā)光試劑無毒無害，對(duì)操作人員不會(huì)造成健康侵害，試劑保存周期長(zhǎng)。一、化學(xué)發(fā)光的原理簡(jiǎn)單來講，某些物質(zhì)（發(fā)光劑）在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。（一）辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析

該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。1．魯米諾及其衍生物（二）堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕磁性生物材料以其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、功能化方便、可磁性富集分離及良好的生物相容性等特性，引起了人們的廣泛重視和競(jìng)相研究，并被迅速引入生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中。通常磁球與雙手臂偶聯(lián)劑的一端結(jié)合，偶聯(lián)劑的另一端結(jié)合抗體，所形成的免疫磁球可用于捕獲相應(yīng)的抗原，利用磁性分離器可方便地對(duì)所形成的復(fù)合物富集分離，在通過合適的檢測(cè)手段來檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)，現(xiàn)在此項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于很多分析方法當(dāng)中。SuperParamagneticMicrospheres

MagneticSeparators1、表面修飾方便，2、生物相容性好3、良好的順磁性免疫磁球表面的抗體可特異性極強(qiáng)地捕獲相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)（如細(xì)菌，抗原蛋白），這樣磁性微球就變味具有生物活性的磁性材料（免疫磁球）。利用免疫磁球磁性內(nèi)核的磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的作用下可方便地與其他雜質(zhì)成分迅速分離，這樣可以使分析檢測(cè)過程變得簡(jiǎn)單和更易操作，因此免疫磁球是一種非常有前途的分析手段。二、化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法的優(yōu)點(diǎn)當(dāng)免疫磁球被引入到定量分析方法中后，對(duì)分析方法的發(fā)展起了很大的推動(dòng)作用。與目前常規(guī)使用的微孔板包被法相比，免疫磁球分析方法具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):（1）更好的選擇性。1、相對(duì)于微孔板，免疫磁球有著大的多的活性比表面積，能提供更多的結(jié)合位點(diǎn)。2、可以在溶液中較為均一的分散，其表面所結(jié)合抗體的反應(yīng)位點(diǎn)在溶液中充分暴露，從而顯著減小抗原-抗體反應(yīng)的空間位阻，有利于抗體與待檢物質(zhì)特異性結(jié)合，從而極大提高分析方法的選擇性。（2）更快的反應(yīng)速度，更高的靈敏度和檢測(cè)區(qū)間

微孔板包被法中，靶物質(zhì)通過分子布朗運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)到微孔板的速度較慢，而免疫磁球可均勻分布在樣品溶液中，更易于接近靶物質(zhì)，從而加快抗體與靶物質(zhì)的結(jié)合速度，另外化學(xué)發(fā)光底物比傳統(tǒng)的TMB顯色底物有著更高的靈敏度和具備更寬的線性范圍。（3）易于分離和清洗

其具有良好的超順磁性，容易被外加磁場(chǎng)所吸附，吸附后的磁球可以簡(jiǎn)便地與樣品溶液分離。由于免疫磁球可以利用磁性分離器方便地對(duì)所形成的復(fù)合物富集分離，使得洗滌結(jié)果更徹底、干擾物濃度極大降低和靶物質(zhì)濃度有效富集，進(jìn)而提高分析方法的信噪比和靈敏度?；瘜W(xué)發(fā)光磁酶免疫法綜合了磁性分離技術(shù)簡(jiǎn)便，化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍廣、測(cè)定速度快，以及免疫法的特異性、