人IGF-Ⅱ基因cDNA化學(xué)合成與克隆

人IGF-Ⅱ基因cDNA化學(xué)合成與克隆

胰島素樣生長因子(insulinlikegrowthfactorⅡ，IGF-Ⅱ）是一類多功能調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育，體外培養(yǎng)細胞的增殖與分化，機體脂肪和糖代謝方面均有重要影響，主要由肝臟合成，血液含量極低，近年發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ基因在肝癌等多種腫瘤中異常表達[1]。IGF-Ⅱ生物學(xué)功能可能通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等方式起作用。但其確切的生理機制尚不清楚。IGF-Ⅱ基因cDNA編碼成熟IGF-Ⅱ共有201個核苷酸，編碼67個氨基酸，分A、B、C、D4個功能區(qū)域(domain)，5'端cDNA編碼B功能區(qū)域，含96個核苷酸，編碼32個氨基酸，該區(qū)域與胰島素及IGF-Ⅰ部分同源。為深入研究IGF-ⅡB功能區(qū)域，我們采用化學(xué)方法人工合成了含編碼該區(qū)域的人IGF-ⅡcDNA。材料與方法1.主要試劑堿基合成單體全套試劑購自加拿大Sangon，T4Kinase購自BioLabs，T4Ligase、EcoRⅠ、XbaⅠ、質(zhì)粒pGEM7Zf(+)購自BoehringerMannheim，菌株DH5α購自華美生物公司。PC/gene基因序列分析軟件由毛積芳教授提供。

2.首先經(jīng)PC/gene基因軟件分析和設(shè)計不同的6個片段，順序為正鏈5'F1F2F33'，負鏈5'F6F5F43'，F(xiàn)1、F6各含24個核苷酸，F(xiàn)2、F3、F4、F5各含39個核苷酸，F(xiàn)65'端設(shè)XbaⅠ酶切位點，F(xiàn)15'端設(shè)EcoRⅠ酶切位點。由ABI391DNA合成儀分別合成6個不同片段，經(jīng)氨解、聚丙烯酰胺電泳、純化、冷凍干燥后備用。

3.合成片段5'端磷酸化[2]取F2、F3、F4、F5片段溶于雙蒸水，取6ml(50pmol)分別磷酸化后，經(jīng)酚、氯仿抽提、無水乙醇沉淀后溶于10ml雙蒸水中。

4.退火與連接F1、F6各取1μl(50pmol)與磷酸化的F2、F3、F4、F5片段混合于20μl雙蒸水中，加熱至90℃5分鐘，緩慢退火至室溫，退火片段加T4Ligase14℃連接過夜。70℃10分鐘，用等體積酚：氯仿抽提，無水乙醇沉淀，晾干，溶于雙蒸水10μl中。

5.pGEM7Zf(+)雙酶切pGEM7Zf(+)質(zhì)粒5ml約800ng加EcoRⅠ、XbaⅠ、37℃酶切1小時，酶切大片段經(jīng)低溫溶點膠分離純化，溶于雙蒸水16ml中。

6.IGF-Ⅱ質(zhì)粒重組pGEM7Zf(+)雙酶切大片段與IGF-Ⅱ退火片斷按1:3摩爾數(shù)混合，加T4Ligase14℃連接過夜，所得質(zhì)粒稱為pIGF-Ⅱ。

7.IGF-Ⅱ重組克隆與篩選DH5a感受態(tài)制備[3]，重組子pIGF-Ⅱ轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a后，涂于含x-galIPTG，AmpLB平皿上，37℃培養(yǎng)16小時，進行藍白斑篩選，重組子IGF-Ⅱ為白色克隆。

8.人IGF-ⅡcDNA的序列測序DNA雙鏈測序按USB測序試劑盒說明書操作。結(jié)果根據(jù)IGF-ⅡmRNA前體確定的IGF-ⅡcDNA的核苷酸序列[4]，選擇編碼B區(qū)的cDNA序列為合成對象，分6個片段，其F1F2F3順序相連與F4F5F6順序片段互補，使配對互補特異，保證一次性退火構(gòu)建成功率增大，同時F1、F6設(shè)計的酶切位點與pGEM7Zf(+)相匹配，有利于重組克隆，利用PC/gene軟件分析，保證了片段二級結(jié)構(gòu)及退火溫度的相對均衡。

重組質(zhì)粒pIGF-Ⅱ經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5a后，在x-galIPTG，AmpLB平皿上長出42個白色菌落，46個藍色菌落，白色菌落約占全部菌落1/2，陰性對照平板無菌落生長，pGEM7Zf(+)轉(zhuǎn)化陽性對照均為藍色菌落，pIGF-Ⅱ轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定符合設(shè)計。

pIGF-ⅡDNA測序結(jié)果4個轉(zhuǎn)化子與原設(shè)計完全一致，無突變堿基序列。討論近年來，IGF-Ⅱ在基礎(chǔ)及臨床研究方面已經(jīng)引起人們關(guān)注，國外極少數(shù)幾家實驗室進行了IGF-Ⅱ基因的表達，多數(shù)為融合蛋白的表達研究。少數(shù)為部分cDNA的融合蛋白表達。人IGF-Ⅱ基因組共有9個外顯子組成，其中前6個外顯子編碼5'-UTR，外顯子1、4、5、6周圍分布多個轉(zhuǎn)錄起始位點，外顯子7、8編碼成熟IGF-Ⅱ肽鏈和E肽N端，外顯子9編碼其余E肽及3'-UTR。由于IGF-Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄受4個啟動子調(diào)控，在人生長發(fā)育及生理病理的不同時期，啟動子的激活各不相同，產(chǎn)生的mRNA具有多種形式，因此也難以克隆到適合大腸桿菌表達的人的IGF-Ⅱ結(jié)構(gòu)基因，而選擇特定cDNA片斷表達似乎更難，全長人IGF-Ⅱ基因化學(xué)合成雙鏈DNA，不僅價格昂貴，且特長的寡聚核苷酸合成時錯配率較高。選擇IGF-ⅡcDNA5'端完整表達B區(qū)的一段cDNA來化學(xué)合成，在不改變IGF-Ⅱ編碼氨基酸序列的基礎(chǔ)上，兩端增加少數(shù)核苷酸，更有利于定向克隆表達于載體中。為更進一步研究B區(qū)的功能提供了基礎(chǔ)。

在構(gòu)建策略選擇上，我們通過一次性快速酶促反應(yīng)得到的6個連接退火片段兩側(cè)5'端都是無磷酸基的，將其直接與pGEM7Zf(+)EcoRⅠ-XbaⅠ大片段進行連接，得到的連接產(chǎn)物的缺口相吻合，轉(zhuǎn)入DH5α后，獲得足夠的陽性克隆。但在挑選轉(zhuǎn)化子時發(fā)現(xiàn)載體大片段自連現(xiàn)象，但經(jīng)初步凝膠電泳即可除之。而正確連接的4例轉(zhuǎn)化子均測序正確，未發(fā)生突變。

構(gòu)建成功pIGF-Ⅱ表達載體，為IGF-Ⅱ反義真核表達載體的構(gòu)建以及肝癌反義基因治療的研究提供了基礎(chǔ)。本題受廣東省自然科學(xué)基金資助

作者單位：510282廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院消化科（張鳴青、楊冬華、徐重）；上海，第二軍醫(yī)大學(xué)生化教研室（蔡在龍、毛積芳、王志強）參考文獻1YangDonghua,LiuWeiwen,GuJiangren,etal.TheexpressionoftheproductsofIGF-Ⅱ,IGF-ⅡreceptorsandCSF-Ⅰreceptorsinhumanprimaryhepatocelluarcarcinomaandjuxtacancerouslivertissue.J.MedCollpla,1993,8:368-376.

2SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloningalaboratorymanual,2nded.NewYork:Coldspringharborlaboratorypress.1989,211-213.

3DavisL,KuchiM,BatteyJ.Basicmethodsinmolecularbiology.2nded.EastNorwalk:AppletionandLange.1994,15-18.

4BellGI,MerryweatherJP,Sanchez-pescadorR,et