原位雜交組織化學(xué)課件

第八章

原位雜交組織化學(xué)第八章

原位雜交組織化學(xué)1原位雜交組織化學(xué)（ISHH）原理：用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。特點：雜交在載玻片上的細胞進行。分類：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同--DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交根據(jù)探針標記物是否直接被檢測—直接法、間接法原位雜交組織化學(xué)（ISHH）2一原位雜交的由來與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種液相雜交：參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括：①吸附雜交②發(fā)光液相雜交③液相夾心雜交④復(fù)性速率液相分子雜交一原位雜交的由來與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用3固相雜交：是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術(shù)包括：①菌落原位雜交②斑點雜交法③Southern印跡雜交④Northern印跡雜交⑤組織原位雜交固相雜交：4（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點：①由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加；②探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了；③非放射性標記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。④新的非放射性標記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點：5二原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visualization）：放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色二原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則：6（一）原位雜交的基本要求1固定2玻片和組織切片的處理3雜交4雜交后處理5顯示6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷（一）原位雜交的基本要求1固定7

1固定

固定劑的應(yīng)用和選擇原則：①保持細胞結(jié)構(gòu)；②最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA水平；③使探針易于進入細胞或組織。DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。1固定DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的8固定劑：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定劑、Carnoy’s液

優(yōu)缺點：

沉淀性固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存RNA，且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。

戊二醛：能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。多聚甲醛：仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。固定劑：優(yōu)缺點：9多聚甲醛——mRNA的定位

將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。多聚甲醛——mRNA的定位10病理學(xué)活檢取材——福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號。石蠟包埋切片——由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片，同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。冷凍切片——應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。病理學(xué)活檢取材——福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測D112玻片和組織切片的處理

（1）玻片的處理熱肥皂刷洗自來水清洗清潔液中浸泡24h清水洗凈烘干95%酒精中浸泡24h蒸餾水沖洗烘干

烘箱溫度＞150℃過夜以去除RNA酶蓋玻片硅化處理錫箔紙包裹無塵存放2玻片和組織切片的處理（1）玻片的處理12（2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。

常用方法：稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶等。

優(yōu)點:通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性,提高雜交信號.缺點:減低RNA的保存,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài).因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。（2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性13（3）減低背景染色

預(yù)雜交（Prehybridization）:是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。雜交后洗滌:采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。（3）減低背景染色預(yù)雜交（Prehybridization14（4）防止RNA酶的污染①在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。②所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒鍋。③要破壞RNA酶，最低溫度必須在150℃左右。④消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。⑤雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。（4）防止RNA酶的污染153雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。

雜交方式:是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。

加蓋片的目的

防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā);硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑,無氣泡,不會影響組織切片與雜交液的接觸;蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。3雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進入細胞16第八章原位雜交組織化學(xué)17雜交注意環(huán)節(jié)（1）探針的濃度原則:探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。雜交液的量要適當:以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落,過量的雜交液含核酸探針濃度過高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。雜交注意環(huán)節(jié)雜交液的量要適當:18

（2）探針的長度

最佳長度應(yīng)在50～100個堿基之間。探針短---易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。500個堿基的探針---雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針---可應(yīng)用.超過500個堿基的探針---在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數(shù)。（2）探針的長度19

（3）雜交的溫度和時間

雜交溫度：

DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜交中，DNA、RNA探針需要的Tm分別是90℃、95℃，這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和甲酰胺，減低Tm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。

（3）雜交的溫度和時間20雜交時間：16-20h或孵育過夜甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖：雜交時間：甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，21

（4）雜交嚴格度（Hybridizationstringency）

雜交嚴格度：表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。低嚴格度：雜交及沖洗條件在Tm35–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度：Tm20-30℃的范圍。高嚴格度：為Tm10-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。（4）雜交嚴格度（Hybridizationstring224雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。注意事項：漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測背景染色作為改善漂洗程序的指針。4雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的235顯示Visualization

又稱檢測系統(tǒng)Detectionsystem根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。放射自顯影：

圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。

非放射性核酸探針雜交的細胞或組織：

酶檢測系統(tǒng)顯色顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。5顯示Visualization又稱檢測系統(tǒng)246對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和Southern印跡雜交法。②可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細胞中。

③預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同一RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。④檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標記探針的情況下進行。多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和S25（二）核酸探針1核酸探針的種類2探針的標記與應(yīng)用（二）核酸探針1核酸探針的種類261核酸探針的種類

（1）按標記方式分類

直接法和間接法：１）直接標記探針

應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（FITC）或羅丹明Rhodamine等熒光物質(zhì)的dNTP或NTP直接標記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。

２）間接標記探針采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。1核酸探針的種類（1）按標記方式分類２）間接標記27兩種方法的比較：（1）直接標記的DNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需通過繁瑣的檢測步驟；（2）間接標記的探針可進行多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。（3）對于多色FISH，往往選擇直接標記法標記探針。兩種方法的比較：28

（2）按核酸性質(zhì)分類

①DNA探針②cDNA探針③RNA探針④寡核苷酸探針（3）按染色體上位置分類：①重復(fù)序列探針②涂染探針③基因探針及其它（2）按核酸性質(zhì)分類（3）按染色體上位置分類：292探針的標記與應(yīng)用

切口平移法（Nicktranslation）隨機引物法(RandomPrimer)末端標記法PCR標記法體外轉(zhuǎn)錄標記法不同模板需不同標記方法2探針的標記與應(yīng)用切口平移法（Nicktranslat30

生物素標記cRNA探針

在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用1光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用2酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用生物素標記cRNA探針

在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用1光敏311光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用

光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上，屬于化學(xué)修飾法，此方法簡單；成本低；適用于大量制備（>50ug）。光敏生物素試劑種類：

光生物素（乙酸鹽）補骨脂素生物素。生物素-聚乙二醇-當歸素（BPA）：在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結(jié)合。BPA反應(yīng)物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個特異性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。1光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用光敏生物素試劑種類：32第八章原位雜交組織化學(xué)33光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下：１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。２0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。３0.4%TrixtionX-100PBS洗15min。４1ug/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。５4%多聚甲醛PBS固定。６0.1mol/LPBS洗2×3min。７0.25%乙酸酐10min。８2×SSC洗10min。９取10ul含相應(yīng)探針的雜交液滴于標本上，如果是cDNA探針，則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上冰浴冷卻，然后再用。10蓋上硅化蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?3℃濕盒保溫12—16h。１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。34114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。122×SSC（含20ug/mlRNaesA，適于RNA探針）37℃洗30min。131×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。140.05mol/LPBS洗4×5min。153%BSA（0.4%TritonX-100PBS配）37℃保溫30min。16堿性磷酸酶室溫1~3h。170.05mol/LPBS洗4×5min。18緩沖液Ⅰ洗2×5min。19緩沖液Ⅱ洗2×5min。20NBT/BCIP液顯色，室溫，暗處3h。2120mmol/LEDTA，pH8.0終止顯色。22甘油明膠直接封片。114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30352酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用原理：酶促生物素標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA中，制成標記探針，敏感度高于化學(xué)修飾法，但操作程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高。反應(yīng)步驟如下：①用PBS沖洗黏附有切片的載玻片。②將載玻片浸入0.3%H2O2，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。③PBS洗2×3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫1h或4℃過夜。④PBS洗2×3min。2酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用①用PBS沖洗黏附有切36⑤加生物素化室溫30min孵育。⑥PBS洗2×3min。⑦應(yīng)用ABC復(fù)合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合，室溫孵育1h。⑧PBS洗2×3min。⑨DAB溶液孵育3-15min。⑩水洗，復(fù)染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。⑤加生物素化室溫30min孵育。37地高辛標記cRNA探針的應(yīng)用地高辛標記cRNA探針的應(yīng)用38地高辛標記cRNA探針的應(yīng)用原理：

地高辛（Dig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反應(yīng)，地高辛標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通過隨即引物或缺口平移法，將Dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成Dig-配基標記的核酸探針。將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達到檢測目的。地高辛標記cRNA探針的應(yīng)用原理：將這種標記的探針與組織39

常用的免疫酶學(xué)檢測方法：

Dig-HRP檢測系統(tǒng)：

以DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色；以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結(jié)果為藍色。

Dig-AKP檢測系統(tǒng)：

以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍紫色沉淀。

AKP靈敏度和分辨率較HRP高，但HRP的優(yōu)點為廉價、穩(wěn)定。常用的免疫酶學(xué)檢測方法：40地高辛標記的核酸探針較穩(wěn)定，-20℃儲存可達2年，隨時可以取用，但在現(xiàn)實應(yīng)用中，人們?nèi)圆捎眯迈r的地高辛標記3-6個月以內(nèi)的核酸探針。為節(jié)省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復(fù)多次使用。地高辛標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。由于地高辛標記cRNA探針在原位雜交細胞化學(xué)中已愈來愈得到廣泛的應(yīng)用，我們在基本方法中較詳細的敘述其操作過程。地高辛探針的應(yīng)用地高辛標記的核酸探針較穩(wěn)定，-20℃儲存可達2年，隨時可以地41

基本操作步驟：

1）組織處理

冷凍切片：切片貼在預(yù)先清潔、高溫處理并涂以粘附劑的載玻片上，先在37℃預(yù)干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存數(shù)月之久，也有報告可保存數(shù)年之久的，但仍以新鮮制片為好。

石蠟包埋切片：應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精脫水。一般不提倡浸入二甲苯溶液，但在細胞內(nèi)mRNA含量高時應(yīng)用二甲苯脫蠟后人能顯示。經(jīng)水洗后經(jīng)37℃烤箱4h或者過夜，然后進行雜交前的處理。

基本操作步驟：42下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。①PBS洗2×3min。②選擇幾張切片作為RNA酶對照片。其他切片暫放于PBS內(nèi)。③蛋白激酶K消化：將組織切片放在LEDTA中孵育15-20min。消化時間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗調(diào)整。④0.1mol/L甘氨酸/PBS5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。⑤在4%多聚甲醛/PBS3min。⑥以PBS漂洗2×3min。⑦浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐以封閉非特異性結(jié)合部位。⑧2×SSC漂洗15min。下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。①PBS洗243

2）雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml）的雜交液，按每張切片10-20ul的量覆蓋切片。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭?×SSC濕盒內(nèi)在42℃，16～18h過夜。

3）顯示①用緩沖液Ⅰ沖洗雜交后的載波片2×3min。②浸入緩沖液Ⅰ中室溫孵育10min，以封閉非特異性部位。③加數(shù)滴抗地高辛抗血清，室溫孵育2h。④緩沖液Ⅰ漂洗3×3min；浸入緩沖液Ⅱ，室溫10min。

2）雜交3）顯示44

⑤浸入BCIP/NBT中，室溫孵育10～30min（或更長時間，視需要而定）。最好用錫箔紙包裹反映盒，使顯色在黑暗中進行。定期卻出切片在顯微鏡下檢測反應(yīng)強度，根據(jù)反應(yīng)強度決定延長或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為藍紫色。⑥將切片浸入緩沖也Ⅲ以終止反應(yīng)。⑦復(fù)染，可用派咯寧丫10-30s。⑧流水洗5-10min，直至水無色為止。⑨以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可用DPX封固。⑤浸入BCIP/NBT中，室溫孵育10～30min（45第八章

原位雜交組織化學(xué)第八章

原位雜交組織化學(xué)46原位雜交組織化學(xué)（ISHH）原理：用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。特點：雜交在載玻片上的細胞進行。分類：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同--DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交根據(jù)探針標記物是否直接被檢測—直接法、間接法原位雜交組織化學(xué)（ISHH）47一原位雜交的由來與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種液相雜交：參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括：①吸附雜交②發(fā)光液相雜交③液相夾心雜交④復(fù)性速率液相分子雜交一原位雜交的由來與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用48固相雜交：是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術(shù)包括：①菌落原位雜交②斑點雜交法③Southern印跡雜交④Northern印跡雜交⑤組織原位雜交固相雜交：49（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點：①由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加；②探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了；③非放射性標記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。④新的非放射性標記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點：50二原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visualization）：放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色二原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則：51（一）原位雜交的基本要求1固定2玻片和組織切片的處理3雜交4雜交后處理5顯示6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷（一）原位雜交的基本要求1固定52

1固定

固定劑的應(yīng)用和選擇原則：①保持細胞結(jié)構(gòu)；②最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA水平；③使探針易于進入細胞或組織。DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。1固定DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的53固定劑：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定劑、Carnoy’s液

優(yōu)缺點：

沉淀性固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存RNA，且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。

戊二醛：能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。多聚甲醛：仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。固定劑：優(yōu)缺點：54多聚甲醛——mRNA的定位

將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。多聚甲醛——mRNA的定位55病理學(xué)活檢取材——福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號。石蠟包埋切片——由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片，同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。冷凍切片——應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。病理學(xué)活檢取材——福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測D562玻片和組織切片的處理

（1）玻片的處理熱肥皂刷洗自來水清洗清潔液中浸泡24h清水洗凈烘干95%酒精中浸泡24h蒸餾水沖洗烘干

烘箱溫度＞150℃過夜以去除RNA酶蓋玻片硅化處理錫箔紙包裹無塵存放2玻片和組織切片的處理（1）玻片的處理57（2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。

常用方法：稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶等。

優(yōu)點:通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性,提高雜交信號.缺點:減低RNA的保存,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài).因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。（2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性58（3）減低背景染色

預(yù)雜交（Prehybridization）:是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。雜交后洗滌:采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。（3）減低背景染色預(yù)雜交（Prehybridization59（4）防止RNA酶的污染①在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。②所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒鍋。③要破壞RNA酶，最低溫度必須在150℃左右。④消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。⑤雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。（4）防止RNA酶的污染603雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。

雜交方式:是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。

加蓋片的目的

防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā);硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑,無氣泡,不會影響組織切片與雜交液的接觸;蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。3雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進入細胞61第八章原位雜交組織化學(xué)62雜交注意環(huán)節(jié)（1）探針的濃度原則:探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。雜交液的量要適當:以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落,過量的雜交液含核酸探針濃度過高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。雜交注意環(huán)節(jié)雜交液的量要適當:63

（2）探針的長度

最佳長度應(yīng)在50～100個堿基之間。探針短---易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。500個堿基的探針---雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針---可應(yīng)用.超過500個堿基的探針---在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數(shù)。（2）探針的長度64

（3）雜交的溫度和時間

雜交溫度：

DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜交中，DNA、RNA探針需要的Tm分別是90℃、95℃，這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和甲酰胺，減低Tm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。

（3）雜交的溫度和時間65雜交時間：16-20h或孵育過夜甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖：雜交時間：甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，66

（4）雜交嚴格度（Hybridizationstringency）

雜交嚴格度：表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。低嚴格度：雜交及沖洗條件在Tm35–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度：Tm20-30℃的范圍。高嚴格度：為Tm10-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。（4）雜交嚴格度（Hybridizationstring674雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。注意事項：漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測背景染色作為改善漂洗程序的指針。4雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的685顯示Visualization

又稱檢測系統(tǒng)Detectionsystem根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。放射自顯影：

圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。

非放射性核酸探針雜交的細胞或組織：

酶檢測系統(tǒng)顯色顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。5顯示Visualization又稱檢測系統(tǒng)696對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和Southern印跡雜交法。②可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細胞中。

③預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同一RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。④檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標記探針的情況下進行。多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和S70（二）核酸探針1核酸探針的種類2探針的標記與應(yīng)用（二）核酸探針1核酸探針的種類711核酸探針的種類

（1）按標記方式分類

直接法和間接法：１）直接標記探針

應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（FITC）或羅丹明Rhodamine等熒光物質(zhì)的dNTP或NTP直接標記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。

２）間接標記探針采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。1核酸探針的種類（1）按標記方式分類２）間接標記72兩種方法的比較：（1）直接標記的DNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需通過繁瑣的檢測步驟；（2）間接標記的探針可進行多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。（3）對于多色FISH，往往選擇直接標記法標記探針。兩種方法的比較：73

（2）按核酸性質(zhì)分類

①DNA探針②cDNA探針③RNA探針④寡核苷酸探針（3）按染色體上位置分類：①重復(fù)序列探針②涂染探針③基因探針及其它（2）按核酸性質(zhì)分類（3）按染色體上位置分類：742探針的標記與應(yīng)用

切口平移法（Nicktranslation）隨機引物法(RandomPrimer)末端標記法PCR標記法體外轉(zhuǎn)錄標記法不同模板需不同標記方法2探針的標記與應(yīng)用切口平移法（Nicktranslat75

生物素標記cRNA探針

在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用1光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用2酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用生物素標記cRNA探針

在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用1光敏761光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用

光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上，屬于化學(xué)修飾法，此方法簡單；成本低；適用于大量制備（>50ug）。光敏生物素試劑種類：

光生物素（乙酸鹽）補骨脂素生物素。生物素-聚乙二醇-當歸素（BPA）：在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結(jié)合。BPA反應(yīng)物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個特異性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。1光敏生物素標記cRNA探針的應(yīng)用光敏生物素試劑種類：77第八章原位雜交組織化學(xué)78光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下：１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。２0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。３0.4%TrixtionX-100PBS洗15min。４1ug/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。５4%多聚甲醛PBS固定。６0.1mol/LPBS洗2×3min。７0.25%乙酸酐10min。８2×SSC洗10min。９取10ul含相應(yīng)探針的雜交液滴于標本上，如果是cDNA探針，則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上冰浴冷卻，然后再用。10蓋上硅化蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?3℃濕盒保溫12—16h。１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。79114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。122×SSC（含20ug/mlRNaesA，適于RNA探針）37℃洗30min。131×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。140.05mol/LPBS洗4×5min。153%BSA（0.4%TritonX-100PBS配）37℃保溫30min。16堿性磷酸酶室溫1~3h。170.05mol/LPBS洗4×5min。18緩沖液Ⅰ洗2×5min。19緩沖液Ⅱ洗2×5min。20NBT/BCIP液顯色，室溫，暗處3h。2120mmol/LEDTA，pH8.0終止顯色。22甘油明膠直接封片。114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30802酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用原理：酶促生物素標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA中，制成標記探針，敏感度高于化學(xué)修飾法，但操作程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高。反應(yīng)步驟如下：①用PBS沖洗黏附有切片的載玻片。②將載玻片浸入0.3%H2O2，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。③PBS洗2×3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫1h或4℃過夜。④PBS洗2×3min。2酶促生物素標記cRNA探針的應(yīng)用①用PBS沖洗黏附有切81⑤加生物素化室溫30min孵育。⑥PBS洗2×3min。⑦應(yīng)用ABC復(fù)合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合，室溫孵育1h。⑧PBS洗2×3min。⑨DAB溶液孵育3-15min。⑩水洗，復(fù)染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。⑤加生物素化室溫30m