DB51∕T 2910-2022 鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術規(guī)程

DB51ICS65.150CCSB52四川省地方標準DB51/T2910—2022鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術規(guī)程TechnicalspecificationforthediagnosisofPlesiomonasshigelloidesforsturgeon2022-05-20發(fā)布2022-07-01實施DB51/T2910-2022目次前言.................................................................................II1范圍.................................................................................12規(guī)范性引用文件......................................................................13術語和定義..........................................................................14試劑和材料..........................................................................15設備與器械..........................................................................26臨床檢查............................................................................27實驗室樣品采集......................................................................28細菌分離與純化......................................................................29細菌鑒定............................................................................210結果判定...........................................................................411綜合判定...........................................................................4附錄A（規(guī)范性）試劑配方.............................................................5附錄B（資料性）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列..................................6I

DB51/T2910-2022前言文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——本次為首次發(fā)布。IIDB51/T2910—2022鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷技術規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了鱘魚類志賀鄰單胞菌病診斷的術語和定義、試劑和材料、設備和器材、臨床檢查、實驗室樣品采集、細菌分離與純化、細菌鑒定、結果判定和綜合判定等技術規(guī)程。本文件適用于達氏鱘（Acipenserdabryanus）和西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）的類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28-2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T18652-2002致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法SC/T7013-2008水生動物產地檢疫采樣技術規(guī)范SC/T7014-2006水生動物檢疫實驗技術規(guī)范SC/T7201.1-2006魚類細菌病檢疫技術規(guī)程第1部分：通用技術3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1鱘魚類志賀鄰單胞菌病Plesiomonasshigelloidesforsturgeon指由類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）感染引起達氏鱘和西伯利亞鱘發(fā)病或死亡的一種細菌性疾病。4試劑和材料4.1試劑、染色液和培養(yǎng)基檢驗中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg），DNA分子量標準參照物選用專業(yè)試劑公司提供的商品化2+試劑；微生物生化鑒定管可替代相應鑒定培養(yǎng)基或鑒定試劑，上述未提及的見附錄A。4.2水應符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。4.3引物16SrRNA基因DNA序列擴增引物，P-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20℃保存。1

DB51/T2910—20225設備與器械超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、普通光學顯微鏡、PCR擴增儀、電子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盤、剪刀、鑷子、手術刀、培養(yǎng)皿、鉑耳絲、酒精燈等。6臨床檢查6.1臨床癥狀病魚共同特征為反應遲鈍，離群獨游，游動遲緩或側翻，攝食減少或停止攝食。體表檢查6.2體表外部檢查參照SC/T7201.1中6.2執(zhí)行。病魚鰭條基部不同程度的充血、出血；部分病魚腹部膨大；極少病魚無明顯外部病變。6.3剖檢肝臟腫大充血，出血；部分病魚腸道腸腔內有少量淡黃色的粘液，部分病魚腸道無明顯的變化。7實驗室樣品采集樣品采集按SC/T7013執(zhí)行。8細菌分離與純化在無菌的環(huán)境中，用滅菌鉑耳分別勾取病魚的肝、腎，劃線接種至LB固體培養(yǎng)基，28℃培育24-48小時，從中挑取圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的單個菌落在LB平板上進行純化培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基的配制方法見附錄A.1。9細菌鑒定9.1革蘭氏染色參考GB/T18652-2002中2.2.5規(guī)定執(zhí)行。生理生化試驗9.2采用細菌生化鑒定管進行試驗，也可利用全自動細菌鑒定儀鑒定。9.2.1乙酰甲基甲醇（V-P）試驗按SC/T7014中表2的規(guī)定執(zhí)行。有氣泡產生為陽性；無氣泡產生為陰性。9.2.2氧化酶試驗以毛細管吸取四甲基對二苯胺的1%水溶液滴在細菌的菌落上。菌落呈玫瑰紅色、深紫色為陽性，不變色為陰性。2

DB51/T2910—20229.2.3吲哚試驗按SC/T7014表2的吲哚（靛基質）試驗的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基變紅為陽性；不變紅為陰性。9.2.4糖、醇類（葡萄糖、甘露醇）發(fā)酵試驗將待檢菌穿刺接種于糖、醇類發(fā)酵試驗培養(yǎng)基（A.2），28℃培養(yǎng)24h后觀察。培養(yǎng)基變黃色為陽性，不變黃色為陰性。9.2.5運動性試驗按GB/T4789.28中2.8的方法配制半固體培養(yǎng)基。把待檢菌穿刺接種于半固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)36h-48h。若待檢菌由穿刺線向四周擴散，其邊緣呈云霧狀，為運動性陽性；若待檢菌只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，為運動性陰性。9.316SrRNA基因序列測定與同源性分析9.3.1細菌基因組DNA抽提酚氯仿法、高鹽法或采用商用試劑盒提取細菌基因組DNA。9.3.216SrRNA基因擴增PCR反應體系：10×PCR緩沖液（無Mg）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）2+1.0μL，引物(20μmol/L)P-F和P-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，無菌雙蒸水補足至50μL?；靹蚝?，3000r/min離心30s。設空白對照，空白對照取等體積的雙蒸水代替DNA模板。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。9.3.3瓊脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液（A.3）配制1％的瓊脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍指示劑溶液（A.4）混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標準參照物作對照。120V電泳約20min-40min，當溴酚藍到達底部時停止。于紫外光下觀察，并在長波紫外燈下用刀片切下含目的條帶（約1500bp）的膠塊，放入無菌離心管中稱重。9.3.4PCR擴增產物純化、測序、序列比對9.3.4.1PCR擴增產物純化按每0.1g瓊脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入9.3.3含有目的條帶膠塊的離心管中。經(jīng)漩渦震蕩儀震蕩1min-2min，將離心管在-70℃放置1h，使凝膠完全凍結。37℃水浴將凍結的凝膠融化后，在漩渦震蕩儀上震蕩1min-2min；14000r/min離心5min。取上層水相轉入另一個離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1）（A.5），混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（A.6），混勻，12000r/min離心5min。向收集的水溶液中加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置-20℃過夜或-70℃放置1h-2h。14000r/min離心10min，棄上清。將沉淀的DNA溶于適當體積的TE緩沖液中，置-20℃保存，待測。9.3.4.2PCR擴增產物測序與同源性分析將上述純化的PCR擴增產物進行序列測定，并與參考序列（附錄B）進行比對分析。3

DB51/T2910—202210結果判定10.1菌落形態(tài)28℃培養(yǎng)24h-48h，形成圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的菌落。10.2細菌染色革蘭氏染色為陰性短桿菌。10.3生理生化試驗生理生化反應試驗結果見表1。表1類志賀鄰單胞菌的生理生化反應結果反應項目氧化酶吲哚結果反應項目甘露醇結果反應項目V-P結果++-+-+葡萄糖運動性注：“+”為陽性，“-”為陰性10.416SrRNA基因序列測定與同源性分析測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達98%以上。11綜合判定符合以下所有特征者判定為類志賀鄰單胞菌病a)臨床癥狀與6相符；b)菌落形態(tài)和染色觀察與10.1和10.2相符；c)生理生化反應結果與10.3相符；d)16SrRNA基因序列同源性分析結果與10.4相符。4DB51/T2910—2022附錄A（規(guī)范性）試劑配方A.1LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5g瓊脂或者瓊脂糖15g蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，115℃滅菌20min。A.2糖、醇類發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨2gNaCl5gK2HPO40.2g被測糖或醇類10g瓊脂6g溴百里酚藍1％水溶液3mL（溴百里酚藍先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制1％的水溶液）蒸餾水1000mLpH7.0-7.2，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4.5cm，115℃滅菌20min。A.350×TAE電泳緩沖液在800mL雙蒸水中溶解242gTris堿，加入57.1mL冰乙酸和37.2gEDTA，充分混勻后，加雙蒸水定容至1L，室溫保存。使用時，配成1×TAE電泳緩沖液。A.4溴酚藍指示劑溶液6×上樣緩沖液將溴酚藍100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，調至藍色。A.5酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE緩沖液，4℃保存。A.6氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。5DB51/T2910—2022附錄B（資料性）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGG