基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素

第七章克隆基因的表達(dá)外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞?？寺』虻谋磉_(dá)：原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物生物反應(yīng)器常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng)的類型用原核生物作宿主AdividingE.coli

第一節(jié)

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成。很多功能上相關(guān)的基因前后相連成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2.以操縱子為單位1.只有一種RNA聚合酶3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上位于mRNA的起始密碼AUG的上游5～10個(gè)堿基處，同核糖體16SrRNA3’末端序列互補(bǔ)，幫助從起始AUG處開(kāi)始翻譯。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有SD序列Shine-Dalgarno（SD）sequence:1.外源基因不能帶有內(nèi)含子2.一般用cDNA，不能直接用真核基因組DNA3.必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)4.利用宿主細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)對(duì)宿主菌的毒害為何？二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生生物基因表表達(dá)的調(diào)控控大腸桿菌基基因表達(dá)載載體基本結(jié)結(jié)構(gòu)特征是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合合并能起始始mRNA合成的序列列。大腸桿菌的的所有啟動(dòng)動(dòng)子中都有有兩段一致致順序（consensussequence）。1.啟動(dòng)子TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35Box和-10Box2.核糖體結(jié)合合位點(diǎn)（RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence翻譯起始階階段，與核核糖體16sRNA的3’端相互作用用，正確定定位起始密密碼子SD5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCASD序列距離AUG的距離影響響翻譯3.轉(zhuǎn)錄終止子子在表達(dá)載體體克隆位點(diǎn)點(diǎn)的下游一一般設(shè)計(jì)一一段轉(zhuǎn)錄終終止子，mRNA轉(zhuǎn)錄錄終終止止信信號(hào)號(hào)。。四、、外外源源蛋蛋白白在在大大腸腸桿桿菌菌中中的的表表達(dá)達(dá)部部位位包涵涵體體（（inclusionbody）是存存在在于于細(xì)細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)中中的的一一種種不溶溶性性蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)聚集集折折疊疊而而成成的的晶晶體體結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)物物。。1.細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)中中表表達(dá)達(dá)在大大腸腸桿桿菌菌細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)表表達(dá)達(dá)人人生生長(zhǎng)長(zhǎng)激激素素（（humangrowthhormone,hGH）。。例：：使重重組組蛋蛋白白易易于于分分離離、、免免受受蛋蛋白白酶酶降降解解、、不不損損害害寄寄主主細(xì)細(xì)胞胞回收的蛋蛋白生物物活性差差。①優(yōu)點(diǎn)②缺點(diǎn)周質(zhì)（periplasm）革蘭氏陰陰性菌位位于內(nèi)膜膜和外膜膜之間的的細(xì)胞結(jié)結(jié)構(gòu)部分分。優(yōu)點(diǎn)：2.周質(zhì)中表表達(dá)容易被濃濃縮和純化、有利于于正確折折疊、被被降解的的少。由于需要要穿過(guò)兩兩層膜，，大腸桿桿菌只能能分泌極極少的蛋蛋白質(zhì)到到培養(yǎng)基基中，效效果都不不太理想想。用溶血素基基因構(gòu)建分泌泌性融合合蛋白使在大腸腸桿菌細(xì)細(xì)胞中表表達(dá)的外外源蛋白白分泌到細(xì)細(xì)胞外的培養(yǎng)基基中。或與細(xì)菌素素釋放蛋蛋白共表達(dá)3.胞外表達(dá)達(dá)（1）一致順順序1.啟動(dòng)子的的結(jié)構(gòu)對(duì)對(duì)表達(dá)效效率的影影響五、影響響外源基基因表達(dá)達(dá)效率的的因素TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35Box和-10Box（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)動(dòng)子最強(qiáng)強(qiáng)。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基基順序越接近一一致順序序，啟動(dòng)動(dòng)子越強(qiáng)強(qiáng)。5’-TTGACATATAAT一致順序序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box（1）SD序列2.翻譯起始始序列對(duì)對(duì)表達(dá)效效率的影影響翻譯起始階階段，與核核糖體16sRNA的3’端相互作用用，正確定定位起始密密碼子SD5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCA①SD序列距離AUG的距離影響響翻譯5’-UAAGGAGG-3’如果是A（T），翻譯效率最最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。②mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短短影響基因的的翻譯5’-AGGAGGU-3’？？？？5’-AAGGA-3’’>③SD序列后面的4個(gè)堿基AUG左側(cè)的三個(gè)堿堿基也有影響響（2）起始密碼AUGAUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效效；AUG右側(cè)的三個(gè)堿堿基也有影響響。-半乳糖苷酶的的mRNA中：是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。3.啟動(dòng)子與外源源基因之間的的距離轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的的存在保證載載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必必須基因，不必浪費(fèi)資資源和能量、、不會(huì)干擾正正常表達(dá)。增加載體的拷拷貝數(shù)會(huì)增加加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目，增加表表達(dá)效率。4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)對(duì)表達(dá)效率的的影響5.載體拷貝數(shù)及及穩(wěn)定性對(duì)表表達(dá)效率的影影響6.外源蛋白在菌菌體中的穩(wěn)定定性對(duì)表達(dá)效效率的影響但過(guò)度的外源源基因的表達(dá)達(dá)會(huì)影響宿主主的正常生長(zhǎng)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)優(yōu)化（1）使用強(qiáng)啟動(dòng)動(dòng)子或誘導(dǎo)型型啟動(dòng)子（2）強(qiáng)終止子，，或?qū)蓚€(gè)終終止子串聯(lián)（3）提高mRNA的穩(wěn)定性如：在外源基基因的下游插插入“重復(fù)性性基因外回文文序列六、提高表達(dá)達(dá)水平常用的的方法2.翻譯水平的優(yōu)優(yōu)化（1）優(yōu)化翻譯起起始區(qū)①起始密碼碼子ATG②mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短短，SD序列距離AUG的距離，及堿堿基種類③翻譯增強(qiáng)強(qiáng)子（2）翻譯的終止止①三個(gè)終止止密碼子，防防止核糖體跳跳躍②終止密碼碼子后的核苷苷酸類型，如如UAAU為大腸桿菌最最有效的翻譯譯終止序列。。（3）密碼子的選選擇①受體菌中中共表達(dá)稀有有密碼子tRNA基因②將稀有密密碼子改為偏偏愛(ài)密碼子（1）表達(dá)分泌蛋蛋白細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細(xì)細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)內(nèi)外膜到培養(yǎng)養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)質(zhì)從細(xì)胞胞質(zhì)跨過(guò)過(guò)內(nèi)膜到到周間質(zhì)質(zhì)中。3.提高目的的產(chǎn)物穩(wěn)穩(wěn)定性防止被宿宿主的酶酶降解。。①使用次黃黃嘌呤核核苷（lon）缺陷型型菌株，，減少宿宿主菌的的蛋白酶酶合成。。②大腸腸桿菌的的htpR基因突變變也減少少蛋白酶酶的降解解作用。。③T4噬菌體的的pin基因產(chǎn)物物能抑制制細(xì)菌的的蛋白酶酶?？砂寻裵in增加到載載體上。。（2）使用突變變菌株，，保護(hù)外外源蛋白白不被降降解減少宿主菌菌本身的蛋蛋白酶的表表達(dá)。（1）強(qiáng)啟動(dòng)子提提高轉(zhuǎn)錄效效率；（2）使用高拷拷貝表達(dá)載載體。4.質(zhì)粒的拷貝貝數(shù)增加mRNA數(shù)量，提高核糖體體與mRNA的結(jié)合速度度宿主大量生長(zhǎng)后，誘導(dǎo)載體質(zhì)粒復(fù)制，增加拷貝數(shù)宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制可調(diào)控的誘導(dǎo)型復(fù)制子（1）培養(yǎng)基（2）環(huán)境因素素（3）誘導(dǎo)時(shí)間間和劑量5.宿主菌的選選擇表達(dá)載體與與宿主相互互匹配6.培養(yǎng)條件優(yōu)優(yōu)化1、缺乏翻譯譯后蛋白質(zhì)質(zhì)的加工修修飾系統(tǒng)，，如糖基化化、氨基酸酸修飾等。。2、原核表達(dá)達(dá)外源蛋白白常以包涵涵體形式存存在，必須須經(jīng)過(guò)變性性、復(fù)性處處理才能獲獲得有生物物活性的蛋蛋白，并且且其表達(dá)量量非常低。。七、原核細(xì)細(xì)胞表達(dá)的的缺陷4、原核細(xì)胞胞沒(méi)有轉(zhuǎn)錄錄后加工系系統(tǒng)，無(wú)法法識(shí)別內(nèi)含含子，故原原核細(xì)胞無(wú)無(wú)法表達(dá)沒(méi)沒(méi)有加工過(guò)過(guò)的真核基基因組。5、重組原核核細(xì)胞在培培養(yǎng)過(guò)程中中產(chǎn)生的毒毒素難以排排除，污染染表達(dá)產(chǎn)物物，影響產(chǎn)產(chǎn)品純度。。3、原核細(xì)胞胞中表達(dá)的的真核蛋白白不穩(wěn)定，，容易被細(xì)細(xì)菌蛋白酶酶降解。七、原核細(xì)細(xì)胞表達(dá)的的缺陷1.胰島素的結(jié)構(gòu)構(gòu)及其生物合合成2.人胰島素的生生產(chǎn)方法3.重組人胰島素素的大腸桿菌菌工程菌的構(gòu)構(gòu)建七、利用重組組大腸桿菌生生產(chǎn)人胰島素素1.胰島素的結(jié)構(gòu)構(gòu)及其生物合合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的的特異性肽酶酶NC信號(hào)肽B肽C肽A肽信號(hào)肽酶2.人胰島素的生生產(chǎn)方法（1）直接提取法法制人胰島素素迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：早期人的胰島島素是從人的的胰臟中直接接分離純化的的，由于原料料供應(yīng)的限制制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足足日益增多的的糖尿病人的的臨床需求。。（2）化學(xué)合成法法制人胰島素素根據(jù)人胰島素素A鏈和B鏈的序列，由由單個(gè)氨基酸酸從頭合成。。這條化學(xué)全全合成的路線線從技術(shù)上來(lái)來(lái)說(shuō)是能夠做做到的，但其其生產(chǎn)成本奇奇高，從而也也限制了產(chǎn)品品的廣泛應(yīng)用用。2.人胰島素的生生產(chǎn)方法迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法法制人胰島素素豬的胰島素可可從原料豐富富的豬胰臟中中提取獲得，，而且豬胰島島素與人胰島島素只在B鏈的C末端有一個(gè)氨氨基酸的差異異，豬的為Ala，人的為T(mén)hr，因此將豬胰胰島素在體外外酶促轉(zhuǎn)化為為人胰島素不不失為一種選選擇。2.人胰島素的生生產(chǎn)方法迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：2.人胰島素的生生產(chǎn)方法迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：上述思路的技技術(shù)路線是：：在pH為6-7的有機(jī)相中使使胰蛋白酶催化化其逆反應(yīng)，該該酶在過(guò)量的的蘇氨酸叔丁丁酯的存在下下，將豬胰島島素B鏈C末端的丙氨酸酸交換下來(lái)，，所形成的人人胰島素叔丁丁酯再用三氯氯乙酸脫去叔叔丁酯基團(tuán)，，最終獲得人人胰島素。該該過(guò)程的總轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率為60%，但工藝路線線耗時(shí)，分離離純化操作復(fù)復(fù)雜，產(chǎn)品的的價(jià)格不菲。。（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法法制人胰島素素2.人胰島素的生生產(chǎn)方法迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：1982年，美國(guó)ElyLiLi公司首先使用用重組大腸桿桿菌生產(chǎn)人胰胰島素，成為為世界上第一一個(gè)上市的基基因工程藥物物。1987年，Novo公司又推出了了利用重組酵酵母菌生產(chǎn)人人胰島素的新新工藝。（4）基因工程法法制人胰島素素上述由基因工工程菌合成的的重組人胰島島素在體外胰島素受體結(jié)合性能能、淋巴細(xì)胞和成成纖維細(xì)胞的的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力力學(xué)等指標(biāo)上均與與天然胰島素素沒(méi)有任何區(qū)區(qū)別，而且還還具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速速等優(yōu)點(diǎn)，充分展展示了基因工工程在生物醫(yī)醫(yī)藥領(lǐng)域中的的巨大潛力。。2.人胰島素的生生產(chǎn)方法迄今為止，有有四種大規(guī)模模生產(chǎn)人胰島島素的方法：：（4）基因工程法法制人胰島素素3.重組人胰島素素的大腸桿菌菌工程菌的構(gòu)構(gòu)建（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法法化學(xué)合成:A、B鏈的編碼序列列表達(dá)產(chǎn)物的后后處理路線：：（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法法生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)評(píng)價(jià)：由于A鏈和B鏈上共存在六六個(gè)半胱氨酸酸殘基，體外外二硫鍵的正正確配對(duì)率較較低，通常只只有10%-20%，因此采采用這條條工藝路路線生產(chǎn)產(chǎn)的重組組人胰島島素每克克成本高高達(dá)100美元以上。為了進(jìn)一一步降低低生產(chǎn)成成本，美美國(guó)ElyLiLi公司隨后后又建立立了第二二條生產(chǎn)產(chǎn)重組人人胰島素素的工藝藝路線。。（1）A鏈和B鏈分別表表達(dá)法（2）人胰島島素原表表達(dá)法3.重組人胰胰島素的的大腸桿桿菌工程程菌的構(gòu)構(gòu)建（2）人胰島島素原表表達(dá)法表達(dá)產(chǎn)物物的后處處理路線線：二硫鍵的的正確配配對(duì)率相相應(yīng)提高高，折疊疊率高達(dá)達(dá)80%以上。雖雖然這條條工藝路路線并不不比AB鏈分別表表達(dá)法更更為簡(jiǎn)捷捷，而且且還要使使用兩種種高純度度的酶制制劑，但但理想的的折疊率率在很大大程度上上彌補(bǔ)了了工藝繁繁瑣的缺缺陷，使使得每克克最終產(chǎn)產(chǎn)品的成成本僅50美元。目前美國(guó)國(guó)ElyLiLi公司采用用此工藝藝年產(chǎn)十幾噸的重組人人胰島素素。（2）人胰島島素原表表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)術(shù)的評(píng)價(jià)價(jià)：（3）A鏈和B鏈同時(shí)表表達(dá)法3.重組人胰胰島素的的大腸桿桿菌工程程菌的構(gòu)構(gòu)建（4）分泌型型重組人人胰島素素表達(dá)法法上述三種種重組大大腸桿菌菌的構(gòu)建建路線均均采用胰胰島素或或胰島素素原編碼碼序列與與大腸桿桿菌b-半乳糖苷苷酶基因拼接接的方法法，所產(chǎn)產(chǎn)生的融融合型重重組蛋白白表達(dá)率率高、穩(wěn)穩(wěn)定性強(qiáng)強(qiáng)，但不不能分泌泌，只要要以包涵涵體的形形式存在在于胞質(zhì)質(zhì)中。3.重組人胰島島素的大腸腸桿菌工程程菌的構(gòu)建建一種能促進(jìn)進(jìn)融合蛋白白分泌的工工程菌構(gòu)建建策略，是是將胰島素素或胰島素素原編碼序序列與b-內(nèi)酰胺酶基因拼接，，b-內(nèi)酰胺酶通通常能被大大腸桿菌分分泌到胞外外。由此獲獲得的工程程菌同時(shí)具具備了穩(wěn)定定高效表達(dá)達(dá)可分泌型型融合蛋白白的優(yōu)良特特性，為胰胰島素的后后續(xù)分離純純化工序減減輕了負(fù)擔(dān)擔(dān)。（4）分泌型重重組人胰島島素表達(dá)法法3.重組人胰島島素的大腸腸桿菌工程程菌的構(gòu)建建第二節(jié)外源基因在在真核細(xì)胞胞中的表達(dá)達(dá)酵母菌、植植物原生質(zhì)質(zhì)體、動(dòng)物物培養(yǎng)細(xì)胞胞等。真核或病毒毒啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因一、真核生生物表達(dá)的的優(yōu)越性和和必要性1、真核生物物具有轉(zhuǎn)錄錄后加工系系統(tǒng)，可識(shí)識(shí)別并刪除除基因中的的內(nèi)含子，，剪切加工工為成熟mRNA2、具備完善善的翻譯后后加工系統(tǒng)統(tǒng)，可進(jìn)行行糖基化、、乙?；鹊刃揎?，使使蛋白形成成正確的天天然構(gòu)型，，因而真核核生物表達(dá)達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生生的蛋白更更接近天然然狀態(tài)，有有利于其功功能、生物物活性的研研究。3、某些真核核細(xì)胞可將將基因表達(dá)達(dá)產(chǎn)物分泌泌到細(xì)胞培培養(yǎng)液中，，簡(jiǎn)化了純純化工藝，，降低了生生產(chǎn)成本。。4、另外，真真核生物表表達(dá)的調(diào)控控方式非常常復(fù)雜，有有助于我們們深入了解解基因調(diào)控控機(jī)制。一、真核生生物表達(dá)的的優(yōu)越性和和必要性（一）外外源基因在在酵母中表表達(dá)（二）植物物細(xì)胞表達(dá)達(dá)系統(tǒng)（三）昆蟲(chóng)蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞胞表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)（四）哺哺乳動(dòng)物細(xì)細(xì)胞表達(dá)系系統(tǒng)二、真核生生物表達(dá)系系統(tǒng)（一）外源源基因在酵酵母中表達(dá)達(dá)１．酵母菌菌表達(dá)外源源基因的優(yōu)優(yōu)勢(shì)２．酵母轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化和表達(dá)達(dá)的一般過(guò)過(guò)程３．在啤酒酒酵母中表表達(dá)的重組組蛋白４．廣泛用于外外源基因表表達(dá)的酵母母宿主菌５．利用重重組酵母生生產(chǎn)乙肝疫疫苗1.酵母菌表達(dá)達(dá)外源基因因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)測(cè)序，基因因表達(dá)調(diào)控控機(jī)理比較較清楚，遺遺傳操作簡(jiǎn)簡(jiǎn)便；具有原核細(xì)細(xì)菌無(wú)法比比擬的真核核蛋白翻譯譯后加工系系統(tǒng)；已經(jīng)分離出出很強(qiáng)的啟啟動(dòng)子；能將外源基基因表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物分泌至至培養(yǎng)基中中；生長(zhǎng)迅速、、大規(guī)模發(fā)發(fā)酵歷史悠悠久、技術(shù)術(shù)成熟、工工藝簡(jiǎn)單、、成本低廉廉；不含有特異性的病病毒、不產(chǎn)產(chǎn)內(nèi)毒素,美國(guó)FDA認(rèn)定為安全全的基因工工程受體系系統(tǒng)。酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2PEG整合到染色色體上或獨(dú)立在酵酵母細(xì)胞內(nèi)內(nèi)轉(zhuǎn)化Ura3+營(yíng)養(yǎng)缺陷陷型培培養(yǎng)基篩篩選轉(zhuǎn)化子克克隆生長(zhǎng)長(zhǎng)帶有目的的基因的的重組載載體鑒定克隆隆發(fā)酵表達(dá)達(dá)外源基因因產(chǎn)物分離、純純化2.酵母轉(zhuǎn)化化和表達(dá)達(dá)的一般般過(guò)程將目的基基因克隆隆至載體體1.基因及載載體分別別用限制制酶切割割；2.回收切割割的基因因和載體體，然后后用T4DNA連接酶連連接；3.將構(gòu)建的的重組質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化至大腸腸桿菌受受體菌；；4.提取重組組質(zhì)粒DNA，酶切鑒鑒定重組組質(zhì)粒，，篩選出出陽(yáng)性重重組菌株株。HIV-1抗原丙肝病毒蛋白診斷試劑HIV-1外殼蛋白瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名稱種類凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶集落刺激因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子胰島素前體血小板源生長(zhǎng)因子類胰島素生長(zhǎng)因子胰島素上皮生長(zhǎng)因子人類治療用蛋白藥物3.在啤酒酵酵母中表表達(dá)的重重組蛋白白4.廣泛用于于外源基基因表達(dá)達(dá)的酵母母宿主菌菌酵母屬如如釀釀酒酵母母克魯維酵酵母屬如如乳乳酸克魯魯維酵母母畢赤酵母母屬如如巴巴斯德畢畢赤酵母母裂殖酵母母屬如如非非洲酒裂裂殖酵母母漢遜酵母母屬如如多多態(tài)漢遜遜酵母其中釀酒酵母母的遺傳學(xué)學(xué)和分子子生物學(xué)學(xué)研究最最為詳盡盡，但巴斯德畢畢赤酵母母表達(dá)外源源基因最最理想。。5.利用重組組酵母生生產(chǎn)乙肝肝疫苗（1）乙型肝肝炎病毒毒的結(jié)構(gòu)構(gòu)蛋白包裹裹的雙鏈DNA病毒，具有感感染力的的病毒顆顆粒呈球面狀，直徑徑為42nm，基因組組僅為3.2kb。病毒顆顆粒的主主要結(jié)構(gòu)構(gòu)蛋白是是病毒的的表面抗原原多肽（HBsAg）或S多肽。顆顆粒內(nèi)的的蛋白成成份包括括核心抗原原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒毒蛋白。（1）乙型肝肝炎病毒毒的結(jié)構(gòu)構(gòu)除此之外外，被乙乙肝病毒毒感染的的人的肝肝臟還能能合成并并釋放大大量的22nm的空殼亞病病毒顆粒粒，其免疫疫原性是是未裝配配的各種種包裝蛋蛋白組份份的1000倍。包裝蛋蛋白共有有三種轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜糖蛋蛋白：S、M、L多肽。5.利用重組組酵母生生產(chǎn)乙肝肝疫苗（2）乙型肝肝炎病毒毒的包裝裝蛋白編編碼基因因5.利用重組組酵母生生產(chǎn)乙肝肝疫苗乙肝病毒毒在體外外細(xì)胞培培養(yǎng)基中中并不能能繁殖，，因此第第一代的的乙肝疫疫苗是從從病毒攜攜帶者的的肝細(xì)胞胞質(zhì)膜上上提取出出來(lái)的。。雖然這這種質(zhì)膜膜來(lái)源的的疫苗具具有較高高的免疫疫原性，，但由于于原材料料的限制制難以大大規(guī)模產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化。。（3）傳傳統(tǒng)統(tǒng)乙乙肝肝疫疫苗苗的的制制備備5.利用用重重組組酵酵母母生生產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝疫疫苗苗（4）產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組釀釀酒酒酵酵母母20世紀(jì)紀(jì)80年代代開(kāi)開(kāi)始始選選擇擇釀釀酒酒酵酵母母表表達(dá)達(dá)重重組組HBsAg，將將S多肽肽的的編編碼碼置置于于ADH1啟動(dòng)動(dòng)子子控控制制下下，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化子子能能表表達(dá)達(dá)出出具具有有免疫疫活活性性的的重重組組蛋蛋白白，它它在在細(xì)細(xì)胞胞提提取取物物中中以以球球形形脂脂蛋蛋白白顆顆粒粒的的形形式式存存在在，，平平均均顆顆粒粒直直徑徑為為22nm，其結(jié)構(gòu)和和形態(tài)態(tài)均與與慢性性乙肝肝病毒毒攜帶帶者血血清中中的病病毒顆顆粒相相同。5.利用重重組酵酵母生生產(chǎn)乙乙肝疫疫苗目前，，由釀釀酒酵酵母生生產(chǎn)的的重組組HBsAg顆粒已已作為為乙肝肝疫苗苗商品品化，，重組組產(chǎn)物物的最最終產(chǎn)產(chǎn)量可可達(dá)細(xì)細(xì)胞總總蛋白白量的的1%~2%。進(jìn)一一步的的研究究表明明，M多肽和和L多肽對(duì)對(duì)S型疫苗苗具有有顯著著的增增效作作用，由三三者（（或兩兩者））構(gòu)成成的復(fù)合合型型乙乙肝肝疫疫苗苗還可可以以誘誘導(dǎo)導(dǎo)那那些些對(duì)對(duì)S抗原原缺缺乏乏響響應(yīng)應(yīng)的的人人群群的的免免疫疫反反應(yīng)應(yīng)。。（4）產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組釀釀酒酒酵酵母母5.利用用重重組組酵酵母母生生產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝疫疫苗苗（5）產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母重組組菌菌經(jīng)經(jīng)甲甲醇醇誘誘導(dǎo)導(dǎo)表表達(dá)達(dá)HBsAg，最最終終S蛋白白的的產(chǎn)產(chǎn)量量可可達(dá)達(dá)細(xì)細(xì)胞胞可可溶溶性性蛋蛋白白總總量量的的2~3%，在在大大規(guī)規(guī)模模的的生生產(chǎn)產(chǎn)過(guò)過(guò)程程中中，，巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母工工程程菌菌在在一一個(gè)個(gè)240L的發(fā)發(fā)酵酵罐罐中中培培養(yǎng)養(yǎng)，，最最終終可可獲獲得得90克22nm的HBsAg顆粒粒，，足足夠夠制制成成900萬(wàn)份份乙肝肝疫疫苗苗。。（5）產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母5.利用用重重組組酵酵母母生生產(chǎn)產(chǎn)乙乙肝肝疫疫苗苗（二二））植植物物細(xì)細(xì)胞胞表表達(dá)達(dá)系系統(tǒng)統(tǒng)1.植物物受受體體系系統(tǒng)統(tǒng)的的特特點(diǎn)點(diǎn)（1）細(xì)細(xì)胞胞具具有有全全能能性性（2）光光合合作作用用，，培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單，，生生產(chǎn)產(chǎn)成成本本低低（3）表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物具具有有免免疫疫原原性性和和生生物物活活性性（4）靈靈活活性性及及實(shí)實(shí)用用性性強(qiáng)強(qiáng)（5）穩(wěn)穩(wěn)定定的的外外植植體體來(lái)來(lái)源源2.在植植物物品品種種改改良良中中的的應(yīng)應(yīng)用用（1）控制果實(shí)成熟

乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。（2）抗病蟲(chóng)害的轉(zhuǎn)基因植物

蘇云金芽孢桿菌的BT基因、蛋白酶抑制劑