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文檔簡介

第七章克隆基因的表達外源基因在宿主細胞中表達外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中表達出蛋白質提取蛋白宿主細胞:原核細胞或真核細胞。克隆基因的表達:原核生物基因表達系統(tǒng)真核生物基因表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌表達系統(tǒng)鏈霉菌表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)絲狀真菌表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)植物生物反應器常見表達系統(tǒng)的類型用原核生物作宿主AdividingE.coli

第一節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子識別原核細胞的啟動子,催化所有的RNA合成。很多功能上相關的基因前后相連成串,由一個共同的控制區(qū)進行轉錄的控制。一、原核生物基因表達的特點2.以操縱子為單位1.只有一種RNA聚合酶3.轉錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。4.不含內含子,缺乏轉錄后的加工系統(tǒng)5.調控主要在轉錄水平上位于mRNA的起始密碼AUG的上游5~10個堿基處,同核糖體16SrRNA3’末端序列互補,幫助從起始AUG處開始翻譯。6.mRNA的核糖體結合位點上,含有SD序列Shine-Dalgarno(SD)sequence:1.外源基因不能帶有內含子2.一般用cDNA,不能直接用真核基因組DNA3.必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調控元件控制外源基因的表達4.利用宿主細胞的調控系統(tǒng),調節(jié)外源基因的表達,防止外源基因的表達對宿主菌的毒害為何?二、原核表達系統(tǒng)的注意事項三、原核生生物基因表表達的調控控大腸桿菌基基因表達載載體基本結結構特征是DNA上的能與RNA聚合酶結合合并能起始始mRNA合成的序列列。大腸桿菌的的所有啟動動子中都有有兩段一致致順序(consensussequence)。1.啟動子TTGACA

TATAAT

轉錄起始位點17bp5’

核糖體結合位點-35Box和-10Box2.核糖體結合合位點(RBS)Shine-Dalgarno(SD)sequence翻譯起始階階段,與核核糖體16sRNA的3’端相互作用用,正確定定位起始密密碼子SD5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCASD序列距離AUG的距離影響響翻譯3.轉錄終止子子在表達載體體克隆位點點的下游一一般設計一一段轉錄終終止子,mRNA轉錄錄終終止止信信號號。。四、、外外源源蛋蛋白白在在大大腸腸桿桿菌菌中中的的表表達達部部位位包涵涵體體((inclusionbody)是存存在在于于細細胞胞質質中中的的一一種種不溶溶性性蛋蛋白白質質聚集集折折疊疊而而成成的的晶晶體體結結構構物物。。1.細胞胞質質中中表表達達在大大腸腸桿桿菌菌細細胞胞內內表表達達人人生生長長激激素素((humangrowthhormone,hGH)。。例::使重重組組蛋蛋白白易易于于分分離離、、免免受受蛋蛋白白酶酶降降解解、、不不損損害害寄寄主主細細胞胞回收的蛋蛋白生物物活性差差。①優(yōu)點②缺點周質(periplasm)革蘭氏陰陰性菌位位于內膜膜和外膜膜之間的的細胞結結構部分分。優(yōu)點:2.周質中表表達容易被濃濃縮和純化、有利于于正確折折疊、被被降解的的少。由于需要要穿過兩兩層膜,,大腸桿桿菌只能能分泌極極少的蛋蛋白質到到培養(yǎng)基基中,效效果都不不太理想想。用溶血素基基因構建分泌泌性融合合蛋白使在大腸腸桿菌細細胞中表表達的外外源蛋白白分泌到細細胞外的培養(yǎng)基基中?;蚺c細菌素素釋放蛋蛋白共表達3.胞外表達達(1)一致順順序1.啟動子的的結構對對表達效效率的影影響五、影響響外源基基因表達達效率的的因素TTGACA

TATAAT

轉錄起始位點17bp5’

核糖體結合位點-35Box和-10Box(2)-35區(qū)與-10區(qū)之間的的距離間隔為17bp時,啟動動子最強強。(3)-35區(qū)和-10區(qū)的堿基基順序越接近一一致順序序,啟動動子越強強。5’-TTGACATATAAT一致順序序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box(1)SD序列2.翻譯起始始序列對對表達效效率的影影響翻譯起始階階段,與核核糖體16sRNA的3’端相互作用用,正確定定位起始密密碼子SD5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCA①SD序列距離AUG的距離影響響翻譯5’-UAAGGAGG-3’如果是A(T),翻譯效率最最高;如果是G(C),效率只有50%或25%。②mRNA-rRNA互補區(qū)域長短短影響基因的的翻譯5’-AGGAGGU-3’????5’-AAGGA-3’’>③SD序列后面的4個堿基AUG左側的三個堿堿基也有影響響(2)起始密碼AUGAUG左側如果是UAU或CUU時,最為有效效;AUG右側的三個堿堿基也有影響響。-半乳糖苷酶的的mRNA中:是UUC、UCA或AGG時下降20倍。3.啟動子與外源源基因之間的的距離轉錄終止區(qū)的的存在保證載載體不會轉錄非必必須基因,不必浪費資資源和能量、、不會干擾正正常表達。增加載體的拷拷貝數會增加加轉錄出的mRNA數目,增加表表達效率。4.轉錄終止區(qū)對對表達效率的的影響5.載體拷貝數及及穩(wěn)定性對表表達效率的影影響6.外源蛋白在菌菌體中的穩(wěn)定定性對表達效效率的影響但過度的外源源基因的表達達會影響宿主主的正常生長長轉錄水平的優(yōu)優(yōu)化(1)使用強啟動動子或誘導型型啟動子(2)強終止子,,或將兩個終終止子串聯(lián)(3)提高mRNA的穩(wěn)定性如:在外源基基因的下游插插入“重復性性基因外回文文序列六、提高表達達水平常用的的方法2.翻譯水平的優(yōu)優(yōu)化(1)優(yōu)化翻譯起起始區(qū)①起始密碼碼子ATG②mRNA-rRNA互補區(qū)域長短短,SD序列距離AUG的距離,及堿堿基種類③翻譯增強強子(2)翻譯的終止止①三個終止止密碼子,防防止核糖體跳跳躍②終止密碼碼子后的核苷苷酸類型,如如UAAU為大腸桿菌最最有效的翻譯譯終止序列。。(3)密碼子的選選擇①受體菌中中共表達稀有有密碼子tRNA基因②將稀有密密碼子改為偏偏愛密碼子(1)表達分泌蛋蛋白細胞質外膜內膜周間質質粒染色體“外排”:蛋白質從細細胞質跨過內內外膜到培養(yǎng)養(yǎng)液中。“分泌”:蛋白質質從細胞胞質跨過過內膜到到周間質質中。3.提高目的的產物穩(wěn)穩(wěn)定性防止被宿宿主的酶酶降解。。①使用次黃黃嘌呤核核苷(lon)缺陷型型菌株,,減少宿宿主菌的的蛋白酶酶合成。。②大腸腸桿菌的的htpR基因突變變也減少少蛋白酶酶的降解解作用。。③T4噬菌體的的pin基因產物物能抑制制細菌的的蛋白酶酶??砂寻裵in增加到載載體上。。(2)使用突變變菌株,,保護外外源蛋白白不被降降解減少宿主菌菌本身的蛋蛋白酶的表表達。(1)強啟動子提提高轉錄效效率;(2)使用高拷拷貝表達載載體。4.質粒的拷貝貝數增加mRNA數量,提高核糖體體與mRNA的結合速度度宿主大量生長后,誘導載體質粒復制,增加拷貝數宿主大量生長時,抑制載體質粒的復制可調控的誘導型復制子(1)培養(yǎng)基(2)環(huán)境因素素(3)誘導時間間和劑量5.宿主菌的選選擇表達載體與與宿主相互互匹配6.培養(yǎng)條件優(yōu)優(yōu)化1、缺乏翻譯譯后蛋白質質的加工修修飾系統(tǒng),,如糖基化化、氨基酸酸修飾等。。2、原核表達達外源蛋白白常以包涵涵體形式存存在,必須須經過變性性、復性處處理才能獲獲得有生物物活性的蛋蛋白,并且且其表達量量非常低。。七、原核細細胞表達的的缺陷4、原核細胞胞沒有轉錄錄后加工系系統(tǒng),無法法識別內含含子,故原原核細胞無無法表達沒沒有加工過過的真核基基因組。5、重組原核核細胞在培培養(yǎng)過程中中產生的毒毒素難以排排除,污染染表達產物物,影響產產品純度。。3、原核細胞胞中表達的的真核蛋白白不穩(wěn)定,,容易被細細菌蛋白酶酶降解。七、原核細細胞表達的的缺陷1.胰島素的結構構及其生物合合成2.人胰島素的生生產方法3.重組人胰島素素的大腸桿菌菌工程菌的構構建七、利用重組組大腸桿菌生生產人胰島素素1.胰島素的結構構及其生物合合成SSSSCNSSB肽(30)C肽(31)A肽(21)RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內的的特異性肽酶酶NC信號肽B肽C肽A肽信號肽酶2.人胰島素的生生產方法(1)直接提取法法制人胰島素素迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::早期人的胰島島素是從人的的胰臟中直接接分離純化的的,由于原料料供應的限制制,其產量遠遠遠不能滿足足日益增多的的糖尿病人的的臨床需求。。(2)化學合成法法制人胰島素素根據人胰島素素A鏈和B鏈的序列,由由單個氨基酸酸從頭合成。。這條化學全全合成的路線線從技術上來來說是能夠做做到的,但其其生產成本奇奇高,從而也也限制了產品品的廣泛應用用。2.人胰島素的生生產方法迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::(3)化學轉型法法制人胰島素素豬的胰島素可可從原料豐富富的豬胰臟中中提取獲得,,而且豬胰島島素與人胰島島素只在B鏈的C末端有一個氨氨基酸的差異異,豬的為Ala,人的為Thr,因此將豬胰胰島素在體外外酶促轉化為為人胰島素不不失為一種選選擇。2.人胰島素的生生產方法迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::2.人胰島素的生生產方法迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::上述思路的技技術路線是::在pH為6-7的有機相中使使胰蛋白酶催化化其逆反應,該該酶在過量的的蘇氨酸叔丁丁酯的存在下下,將豬胰島島素B鏈C末端的丙氨酸酸交換下來,,所形成的人人胰島素叔丁丁酯再用三氯氯乙酸脫去叔叔丁酯基團,,最終獲得人人胰島素。該該過程的總轉轉化率為60%,但工藝路線線耗時,分離離純化操作復復雜,產品的的價格不菲。。(3)化學轉型法法制人胰島素素2.人胰島素的生生產方法迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::1982年,美國ElyLiLi公司首先使用用重組大腸桿桿菌生產人胰胰島素,成為為世界上第一一個上市的基基因工程藥物物。1987年,Novo公司又推出了了利用重組酵酵母菌生產人人胰島素的新新工藝。(4)基因工程法法制人胰島素素上述由基因工工程菌合成的的重組人胰島島素在體外胰島素受體結合性能能、淋巴細胞和成成纖維細胞的的應答能力、降血糖作用、血漿藥代動力力學等指標上均與與天然胰島素素沒有任何區(qū)區(qū)別,而且還還具有無免疫原性、注射吸收迅速速等優(yōu)點,充分展展示了基因工工程在生物醫(yī)醫(yī)藥領域中的的巨大潛力。。2.人胰島素的生生產方法迄今為止,有有四種大規(guī)模模生產人胰島島素的方法::(4)基因工程法法制人胰島素素3.重組人胰島素素的大腸桿菌菌工程菌的構構建(1)A鏈和B鏈分別表達法法化學合成:A、B鏈的編碼序列列表達產物的后后處理路線::(1)A鏈和B鏈分別表達法法生產技術的評評價:由于A鏈和B鏈上共存在六六個半胱氨酸酸殘基,體外外二硫鍵的正正確配對率較較低,通常只只有10%-20%,因此采采用這條條工藝路路線生產產的重組組人胰島島素每克克成本高高達100美元以上。為了進一一步降低低生產成成本,美美國ElyLiLi公司隨后后又建立立了第二二條生產產重組人人胰島素素的工藝藝路線。。(1)A鏈和B鏈分別表表達法(2)人胰島島素原表表達法3.重組人胰胰島素的的大腸桿桿菌工程程菌的構構建(2)人胰島島素原表表達法表達產物物的后處處理路線線:二硫鍵的的正確配配對率相相應提高高,折疊疊率高達達80%以上。雖雖然這條條工藝路路線并不不比AB鏈分別表表達法更更為簡捷捷,而且且還要使使用兩種種高純度度的酶制制劑,但但理想的的折疊率率在很大大程度上上彌補了了工藝繁繁瑣的缺缺陷,使使得每克克最終產產品的成成本僅50美元。目前美國國ElyLiLi公司采用用此工藝藝年產十幾噸的重組人人胰島素素。(2)人胰島島素原表表達法生產技術術的評價價:(3)A鏈和B鏈同時表表達法3.重組人胰胰島素的的大腸桿桿菌工程程菌的構構建(4)分泌型型重組人人胰島素素表達法法上述三種種重組大大腸桿菌菌的構建建路線均均采用胰胰島素或或胰島素素原編碼碼序列與與大腸桿桿菌b-半乳糖苷苷酶基因拼接接的方法法,所產產生的融融合型重重組蛋白白表達率率高、穩(wěn)穩(wěn)定性強強,但不不能分泌泌,只要要以包涵涵體的形形式存在在于胞質質中。3.重組人胰島島素的大腸腸桿菌工程程菌的構建建一種能促進進融合蛋白白分泌的工工程菌構建建策略,是是將胰島素素或胰島素素原編碼序序列與b-內酰胺酶基因拼接,,b-內酰胺酶通通常能被大大腸桿菌分分泌到胞外外。由此獲獲得的工程程菌同時具具備了穩(wěn)定定高效表達達可分泌型型融合蛋白白的優(yōu)良特特性,為胰胰島素的后后續(xù)分離純純化工序減減輕了負擔擔。(4)分泌型重重組人胰島島素表達法法3.重組人胰島島素的大腸腸桿菌工程程菌的構建建第二節(jié)外源基因在在真核細胞胞中的表達達酵母菌、植植物原生質質體、動物物培養(yǎng)細胞胞等。真核或病毒毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因一、真核生生物表達的的優(yōu)越性和和必要性1、真核生物物具有轉錄錄后加工系系統(tǒng),可識識別并刪除除基因中的的內含子,,剪切加工工為成熟mRNA2、具備完善善的翻譯后后加工系統(tǒng)統(tǒng),可進行行糖基化、、乙?;鹊刃揎棧故沟鞍仔纬沙烧_的天天然構型,,因而真核核生物表達達系統(tǒng)產生生的蛋白更更接近天然然狀態(tài),有有利于其功功能、生物物活性的研研究。3、某些真核核細胞可將將基因表達達產物分泌泌到細胞培培養(yǎng)液中,,簡化了純純化工藝,,降低了生生產成本。。4、另外,真真核生物表表達的調控控方式非常常復雜,有有助于我們們深入了解解基因調控控機制。一、真核生生物表達的的優(yōu)越性和和必要性(一)外外源基因在在酵母中表表達(二)植物物細胞表達達系統(tǒng)(三)昆蟲蟲培養(yǎng)細胞胞表達系統(tǒng)統(tǒng)(四)哺哺乳動物細細胞表達系系統(tǒng)二、真核生生物表達系系統(tǒng)(一)外源源基因在酵酵母中表達達1.酵母菌菌表達外源源基因的優(yōu)優(yōu)勢2.酵母轉轉化和表達達的一般過過程3.在啤酒酒酵母中表表達的重組組蛋白4.廣泛用于外外源基因表表達的酵母母宿主菌5.利用重重組酵母生生產乙肝疫疫苗1.酵母菌表達達外源基因因的優(yōu)勢全基因組測測序,基因因表達調控控機理比較較清楚,遺遺傳操作簡簡便;具有原核細細菌無法比比擬的真核核蛋白翻譯譯后加工系系統(tǒng);已經分離出出很強的啟啟動子;能將外源基基因表達產產物分泌至至培養(yǎng)基中中;生長迅速、、大規(guī)模發(fā)發(fā)酵歷史悠悠久、技術術成熟、工工藝簡單、、成本低廉廉;不含有特異性的病病毒、不產產內毒素,美國FDA認定為安全全的基因工工程受體系系統(tǒng)。酵母原生質體感受態(tài)酶去壁CaCl2PEG整合到染色色體上或獨立在酵酵母細胞內內轉化Ura3+營養(yǎng)缺陷陷型培培養(yǎng)基篩篩選轉化子克克隆生長長帶有目的的基因的的重組載載體鑒定克隆隆發(fā)酵表達達外源基因因產物分離、純純化2.酵母轉化化和表達達的一般般過程將目的基基因克隆隆至載體體1.基因及載載體分別別用限制制酶切割割;2.回收切割割的基因因和載體體,然后后用T4DNA連接酶連連接;3.將構建的的重組質質粒轉化化至大腸腸桿菌受受體菌;;4.提取重組組質粒DNA,酶切鑒鑒定重組組質粒,,篩選出出陽性重重組菌株株。HIV-1抗原丙肝病毒蛋白診斷試劑HIV-1外殼蛋白瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名稱種類凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶集落刺激因子成纖維細胞生長因子胰島素前體血小板源生長因子類胰島素生長因子胰島素上皮生長因子人類治療用蛋白藥物3.在啤酒酵酵母中表表達的重重組蛋白白4.廣泛用于于外源基基因表達達的酵母母宿主菌菌酵母屬如如釀釀酒酵母母克魯維酵酵母屬如如乳乳酸克魯魯維酵母母畢赤酵母母屬如如巴巴斯德畢畢赤酵母母裂殖酵母母屬如如非非洲酒裂裂殖酵母母漢遜酵母母屬如如多多態(tài)漢遜遜酵母其中釀酒酵母母的遺傳學學和分子子生物學學研究最最為詳盡盡,但巴斯德畢畢赤酵母母表達外源源基因最最理想。。5.利用重組組酵母生生產乙肝肝疫苗(1)乙型肝肝炎病毒毒的結構構蛋白包裹裹的雙鏈DNA病毒,具有感感染力的的病毒顆顆粒呈球面狀,直徑徑為42nm,基因組組僅為3.2kb。病毒顆顆粒的主主要結構構蛋白是是病毒的的表面抗原原多肽(HBsAg)或S多肽。顆顆粒內的的蛋白成成份包括括核心抗原原(HBcAg)、病毒DNA聚合酶、微量病毒毒蛋白。(1)乙型肝肝炎病毒毒的結構構除此之外外,被乙乙肝病毒毒感染的的人的肝肝臟還能能合成并并釋放大大量的22nm的空殼亞病病毒顆粒粒,其免疫疫原性是是未裝配配的各種種包裝蛋蛋白組份份的1000倍。包裝蛋蛋白共有有三種轉轉膜糖蛋蛋白:S、M、L多肽。5.利用重組組酵母生生產乙肝肝疫苗(2)乙型肝肝炎病毒毒的包裝裝蛋白編編碼基因因5.利用重組組酵母生生產乙肝肝疫苗乙肝病毒毒在體外外細胞培培養(yǎng)基中中并不能能繁殖,,因此第第一代的的乙肝疫疫苗是從從病毒攜攜帶者的的肝細胞胞質膜上上提取出出來的。。雖然這這種質膜膜來源的的疫苗具具有較高高的免疫疫原性,,但由于于原材料料的限制制難以大大規(guī)模產產業(yè)化。。(3)傳傳統(tǒng)統(tǒng)乙乙肝肝疫疫苗苗的的制制備備5.利用用重重組組酵酵母母生生產產乙乙肝肝疫疫苗苗(4)產產乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組釀釀酒酒酵酵母母20世紀紀80年代代開開始始選選擇擇釀釀酒酒酵酵母母表表達達重重組組HBsAg,將將S多肽肽的的編編碼碼置置于于ADH1啟動動子子控控制制下下,,轉轉化化子子能能表表達達出出具具有有免疫疫活活性性的的重重組組蛋蛋白白,它它在在細細胞胞提提取取物物中中以以球球形形脂脂蛋蛋白白顆顆粒粒的的形形式式存存在在,,平平均均顆顆粒粒直直徑徑為為22nm,其結構和和形態(tài)態(tài)均與與慢性性乙肝肝病毒毒攜帶帶者血血清中中的病病毒顆顆粒相相同。5.利用重重組酵酵母生生產乙乙肝疫疫苗目前,,由釀釀酒酵酵母生生產的的重組組HBsAg顆粒已已作為為乙肝肝疫苗苗商品品化,,重組組產物物的最最終產產量可可達細細胞總總蛋白白量的的1%~2%。進一一步的的研究究表明明,M多肽和和L多肽對對S型疫苗苗具有有顯著著的增增效作作用,由三三者((或兩兩者))構成成的復合合型型乙乙肝肝疫疫苗苗還可可以以誘誘導導那那些些對對S抗原原缺缺乏乏響響應應的的人人群群的的免免疫疫反反應應。。(4)產產乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組釀釀酒酒酵酵母母5.利用用重重組組酵酵母母生生產產乙乙肝肝疫疫苗苗(5)產產乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母重組組菌菌經經甲甲醇醇誘誘導導表表達達HBsAg,最最終終S蛋白白的的產產量量可可達達細細胞胞可可溶溶性性蛋蛋白白總總量量的的2~3%,在在大大規(guī)規(guī)模模的的生生產產過過程程中中,,巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母工工程程菌菌在在一一個個240L的發(fā)發(fā)酵酵罐罐中中培培養(yǎng)養(yǎng),,最最終終可可獲獲得得90克22nm的HBsAg顆粒粒,,足足夠夠制制成成900萬份份乙肝肝疫疫苗苗。。(5)產產乙乙肝肝表表面面抗抗原原的的重重組組巴巴斯斯德德畢畢赤赤酵酵母母5.利用用重重組組酵酵母母生生產產乙乙肝肝疫疫苗苗(二二))植植物物細細胞胞表表達達系系統(tǒng)統(tǒng)1.植物物受受體體系系統(tǒng)統(tǒng)的的特特點點(1)細細胞胞具具有有全全能能性性(2)光光合合作作用用,,培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件簡簡單單,,生生產產成成本本低低(3)表表達達產產物物具具有有免免疫疫原原性性和和生生物物活活性性(4)靈靈活活性性及及實實用用性性強強(5)穩(wěn)穩(wěn)定定的的外外植植體體來來源源2.在植植物物品品種種改改良良中中的的應應用用(1)控制果實成熟

乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。(2)抗病蟲害的轉基因植物

蘇云金芽孢桿菌的BT基因、蛋白酶抑制劑

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