人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定

人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定【摘要】目的利用PCR技術(shù)擴增hIL-8cDNA，將其連接于原核表達載體pKpL-3a（含PL啟動子）中,并在大腸桿菌中表達、鑒定。方法PCR技術(shù)擴增hIL-8cDNA獲取目的基因，將該基因重組到大腸桿菌表達載體pKpL3a質(zhì)粒中，重組DNA分子轉(zhuǎn)化到Pop2136大腸桿菌中，利用其所產(chǎn)生的溫度敏感性λ阻遏蛋白來調(diào)控外源基因表達，經(jīng)ELISA反應(yīng)檢測其表達水平。結(jié)果帶hIL-8基因的重組pKpL3a質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到Pop2136大腸桿菌中，經(jīng)誘導，表達了IL-8并經(jīng)ELISA反應(yīng)檢測了其表達水平。結(jié)論：hIL-8成功在大腸桿菌中表達。【關(guān)鍵詞】hIL-8PCR重組基因表達正文趨化因子（Chemokine）是一組具有趨化作用的細胞因子，能吸引免疫細胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。白細胞介素-8（Interleukin-8）屬于趨化因子家族成員，其分子中含有Cys-X-Cys的三聯(lián)氨基酸序列，因而屬于CXC趨化因子亞家族（α家族）。IL-8的重要生物學功能是對中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞具有區(qū)劃作用，并可促進中性粒細胞的活化，在炎癥反應(yīng)中是一種重要的炎癥因子。另外，IL-8還具有促進造血細胞增殖及新生血管生成作用，在傷口愈合和腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。由于天然來源的IL-8含量極低，難以大批量制備，因而只能利用基因工程技術(shù)進行表達和生產(chǎn)。其基本過程是：獲取目的基因；表達載體的選擇和構(gòu)建；目的基因與表達載體的拼接；重組DNA分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌；使其復(fù)制轉(zhuǎn)錄并合成重組的免疫分子。利用重組技術(shù),可使大腸桿菌成為生產(chǎn)IL-8的生物工廠。這種生物工廠一旦建造成功,只要供給大腸桿菌適當?shù)纳L條件,就可提供取之不盡的IL-8。1材料與方法1.1主要材料1.1.1菌株與載體Pop2136大腸桿菌和含pKpL-3a質(zhì)粒的大腸桿菌由本實驗室提供。1.1.2工具酶與試劑TaqDNA聚合酶及其buffer購于北聯(lián)生物醫(yī)學工程公司。dNTPmix購于Takara公司。Klenow酶購于北聯(lián)生物醫(yī)學工程公司。內(nèi)切酶StyⅠ、XbaⅠ購于Takara公司。T4DNA連接酶及其buffer購于Takara公司。1.1.3PCR引物的設(shè)計、合成上游5ˊ引物：agtgctaaagaacttagatgt；下游3ˊ引物：ccgtctagattatgaattataagccctct(內(nèi)含XbaⅠ酶切位點和TAA終止密碼)由Takara公司合成。1.1.4主要儀器PCR儀，微量加樣器（20μl、200μl、1000μl），高速臺式離心機，DYY-10型電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)，水浴搖床，孵箱，酶標儀，一次性酶標板等。1.2試驗方法1.2.1PCR技術(shù)擴增hIL-8cDNA在Eppendorf管中依次加入下列成份構(gòu)建總體積為50μl的反應(yīng)體系：ddH2O37μl、10×buffer5μl、dNTPmix5μl、上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA模板1μl、Taq酶1μl。調(diào)節(jié)PCR儀，設(shè)置95℃預(yù)變5分鐘。94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，反應(yīng)30個循環(huán)。最后72℃再延伸5分鐘。在設(shè)定好的PCR儀上進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取出10μl進行瓊脂糖凝膠電泳。向管中余下的40μl反應(yīng)體系中加入Klenow酶1μl，室溫30分鐘，以修平擴增片段的3ˊ末端。之后轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，加入50μl酚-氯仿-異戊醇并混勻，10000rpm，30秒離心。吸取上層清液轉(zhuǎn)至另一已加入5μl3MNaAc的1.5ml離心管中，加入150μl無水乙醇，-20℃放置1小時。10000rpm，10分鐘離心，棄上清，加入0.5ml70%乙醇，10000rpm，5分鐘離心，棄上清，空氣中干燥，溶于20μlTE。1.2.2DNA瓊脂糖凝膠電泳配置0.8%瓊脂糖凝膠板。充分凝固后從制膠槽中卸下凝膠板，放入電泳槽，加入TAE（×1），使其液面略高于瓊脂糖板，拔出樣品梳。DNA樣品10μl加5μlGEBS樣本液，在蠟面紙上混勻，全部加樣于瓊脂糖的樣品孔中。穩(wěn)壓電泳80v約2小時，是溴酚藍指示劑泳動到適當位置，1-5v/cm。取出凝膠板置溴化乙錠中染色20分鐘。在凝膠成像儀觀察結(jié)果。1.2.3質(zhì)粒提取從轉(zhuǎn)化平皿上接種一單菌落到LA培液體養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，待細菌濃度增至OD600=1.5時，收獲細菌。取菌液1ml轉(zhuǎn)至Eppendorf管中，8000rpm，2分鐘離心，棄上清。加入200μl緩沖液A，充分混勻。加200μl堿溶液裂解細菌，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次至溶液清亮，開蓋后能拉出絲狀粘稠液體。加200μl乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次混勻，冰浴10分鐘（寧短勿長）。10000rpm5分鐘離心，上清轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20℃放置1小時。10000rpm5分鐘離心，棄上清，加入70%乙醇0.5ml。10000rpm5分鐘離心，棄上清，干燥。加入50μlTE使質(zhì)粒溶解，酶切備用。1.2.4限制性內(nèi)切酶消化取兩個Eppendorf管分別標記A、B，依次加入下列物質(zhì)構(gòu)建兩個反應(yīng)體系。A管：ddH2O16μl、10×Hbuffer2μl、質(zhì)粒DNA1μl、StyⅠ1μl。B管：ddH2O14μl、10×Mbuffer2μl、0.1%BSA2μl、PCR產(chǎn)物1μl、XbaⅠ1μl。37℃水浴45分鐘。A管中加入1μlKlenow酶、2μldNTPmix，室溫30分鐘，加50μl酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，-20℃沉底1小時。10000rpm10分鐘離心，棄上清，100μl70%乙醇洗滌一次，干燥。加入2μl10×Mbuffer、2μl0.1%BSA、1μlXbaⅠ，37℃水浴45分鐘。加50μl酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，-20℃沉底1小時。10000rpm10分鐘離心，棄上清，100μl70%乙醇洗滌一次，干燥。加20μlTE進一步用于連接反應(yīng)。B管中加50μl酚-氯仿-異戊醇，混勻，10000rpm5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，-20℃沉底1小時。10000rpm10分鐘離心，棄上清，100μl70%乙醇洗滌一次，干燥。加20μlTE進一步用于連接反應(yīng)。1.2.5DNA連接在Eppendorf管中加入下列物質(zhì)構(gòu)建反應(yīng)體系進行連接反應(yīng)：H2O9.5μl、10×T4DNA連接酶buffer2.5μl、pKpL3α質(zhì)粒DNA7μl、IL-8PCR產(chǎn)物5μl、T4DNA連接酶1μl。置12-16℃水浴反應(yīng)過夜。65℃水浴15分鐘，滅活T4DNA連接酶，用于轉(zhuǎn)化。1.2.6轉(zhuǎn)化將無質(zhì)粒大腸桿菌pop2136接種于1mlLB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3-5小時。待OD600=0.4時轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，8000rpm2分鐘離心，棄上清。加200μl100mMCacl2混勻，冰浴30分鐘。加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘。加入1mlLB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)0.5小時。取出50μl涂于LA培養(yǎng)皿上（含氨芐青霉素），37℃倒置培養(yǎng)過夜，檢查轉(zhuǎn)化菌是否生成(只有轉(zhuǎn)化的細菌才能在平皿上生長)。1.2.7細胞因子的測定—ELISA雙抗體夾心法包被：將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100μl/孔，放置濕盒中，4℃24小時。洗滌：加入洗滌液洗滌1分鐘/次，共3次。加樣：加入待測樣品、陰性對照及倍比稀釋的標準品，100μl/孔，放置濕盒中，37℃30分鐘。洗滌：同前。加酶標抗體：100μl/孔，100μl/孔，放置濕盒中，37℃30分鐘。洗滌：同前。加顯色劑：A液（TMB，四甲基聯(lián)苯胺）1滴，B液（H2O2）1滴，室溫顯色5-10分鐘。終止反應(yīng)：加中止液（2mol/LH2SO4）。測OD值：酶標儀測450nm處OD值，以O(shè)D值為橫坐標，標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線。2結(jié)果2.1DNA瓊脂糖凝膠電泳見圖1。檢查擴增結(jié)果，9組都見一致的擴增區(qū)帶，PCR產(chǎn)物與設(shè)計的228bp相符，并無非特異性擴增，說明目的基因擴增成功。123456789圖1DNA瓊脂糖凝膠電泳分析注：PCRProducts:228bp2.2ELISA雙抗體夾心法檢測IL-8含量所測OD值和標準曲線見表1和圖2。LINKExcel.Sheet.8F:\\課件\\免疫試驗\\實驗結(jié)果.xlsSheet1!R54C1:R62C14\a\f5\h表1450nm處OD值LINKExcel.Sheet.8F:\\課件\\免疫試驗\\實驗結(jié)果.xlsSheet1!R52C1:R62C13\a\f5\h4組Measurementcount:1Filter:450123456789101112AB0.810.4850.9141.6540.4450.6141.70.2411.5030.155C0.7350.6330.9391.7020.4490.3641.4150.3831.4120.754D0.8360.6180.9211.2370.3660.3841.3390.3521.4810.261E0.8610.7471.1691.840.3580.5750.3430.5420.2260.11F0.3211.1981.512.1360.7040.8820.7041.1080.550.192G0.3771.5652.1981.8760.4480.6540.6120.9490.9150.408H圖2ELISA雙抗體夾心法標準品OD值標準曲線根據(jù)標準品的濃度和試驗所測OD值，計算出待測樣本的hlL-18濃度為10.4ng/ml。3討論本實驗首先通過PCR技術(shù)擴增hlL-18cDNA，反應(yīng)結(jié)束后取出少量做瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)圖1的結(jié)果可以看出，引物的設(shè)計和PCR反應(yīng)條件的設(shè)計是很成功的。而在PCR反應(yīng)中，引物的設(shè)計尤為重要。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)ZML聚合反應(yīng)（即錯配）。具體實現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素。引物的長度一般為15~30bp，常用的是18~27bp，但不應(yīng)大于27bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)[1]；引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有較高相似性片段，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配[1]；末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A；引物序列的GC含量一般為40%~60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大［2］;引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2(（A+T）;引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。而本試驗酶切位點設(shè)計在下游3’引物上，并且增加了ccg三個堿基來保護酶切位點，是酶切更高效[3]。把PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒DNA進行限制性內(nèi)切酶消化，然后進行DNA的連接。將hlL-8cDNA片段插入pKpL3α質(zhì)粒中，有三種方法可選。一是兩個平端連接；二是兩個粘端連接；三是一個平端和一個粘端連接。分析這三種連接方法，第一種方法優(yōu)點是設(shè)計簡單，但是缺點也很明顯，連接反應(yīng)慢、片段位置易倒置、容易形成多個重復(fù)序列等。第二種方法優(yōu)點是連接緊密，特異性高，但酶切位點設(shè)計比較復(fù)雜。所以綜合以上情況，本實驗采用第三種辦法。3’端用Klenow酶補齊，5’端用XbaⅠ進行酶切，使之產(chǎn)生互補粘端。經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理后，小批量誘導hlL-8表達，經(jīng)純化后，進行ELISA雙抗體夾心法檢測，由圖2可以大致估算出hlL-8的濃度[4]。另外，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在LA平皿上進行培養(yǎng)，長出的大腸桿菌說明其細胞均內(nèi)含有質(zhì)粒，但不能說明其質(zhì)粒中都含有目的基因片段。所以要對培養(yǎng)出的大腸桿菌做進一步的鑒定。由于本實驗沒有做這一步，所以有必要在這里討論一下。挑單個菌落接種于1mlLA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)后可進一步提取質(zhì)粒進行DNA電泳；或者用限制性內(nèi)切酶酶切后進行DNA電泳，看是否含有目的基因片段。還可以小批量誘導重組IL-8表達，然后進行SDS電泳，鑒定重組蛋白的分子量。本試驗成功地構(gòu)建了hlL-18重組原核表達質(zhì)粒，利用大腸桿菌成功地表達了重組蛋白，為進一步研究hIL-18的功能及應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。參考文獻[1]張成崗，賀福初.生物信息學方法與實踐[M].北京：科學出版社，2002,64,-66.[2]賀林.解碼生命-人類基因組計劃和后基因組計劃[M].北京：科學出版社，2000,346-348.[3]張新宇，高燕寧.生物信息學[J].2004(04):16-19.[4]分子免疫學實驗指導.內(nèi)容總結(jié)

（1）人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定

【摘要】目的利用PCR技術(shù)擴增hIL-8cDNA，將其連接于原核表達載體pKpL-3a（含PL啟動子）中,并在大腸桿菌中表達、鑒定

（2）10000rpm，10分鐘離心，棄上清，加入0.5ml70%乙醇，10000rpm，5分鐘離心，棄上清，空氣中干燥，溶于20μlTE

（3）加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘

附錄資料:不需要的可以自行刪除中西藥養(yǎng)護技術(shù)與方法藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的概念

藥品養(yǎng)護是運用現(xiàn)代科學技術(shù)與方法，研究藥品儲存養(yǎng)護技術(shù)和儲存藥品質(zhì)量變化規(guī)律，防止藥品變質(zhì)，保證藥品質(zhì)量，確保用藥安全、有效的一門實用性技術(shù)科學。

藥品養(yǎng)護-藥品養(yǎng)護的基本要求

各種藥品的功能是由藥物本身性質(zhì)所決定的，每種藥物的內(nèi)在成分與其他物質(zhì)一樣，時刻在不斷運動和變化，這就構(gòu)成了它在貯藏期間引起變化的內(nèi)在因素，加上自然條件的影響，必然發(fā)生物理、化學以及生物學等變化。而這些相互影響又互為關(guān)聯(lián)的變化，要求人們不僅要了解掌握藥品內(nèi)在質(zhì)變的形式。同時還需要了解自然條件（如溫度、濕度、空氣等）變化的規(guī)律。

藥品養(yǎng)護的各項工作內(nèi)容都應(yīng)圍繞保證藥品儲存質(zhì)量為目標。其主要工作內(nèi)容有：檢查控制在庫藥品的儲存條件，對藥品進行定期質(zhì)量檢查，對發(fā)現(xiàn)的問題及時采取有效的處理措施。

藥品養(yǎng)護是一項涉及到質(zhì)量管理、倉儲保管、業(yè)務(wù)經(jīng)營等方面的綜合性工作，按照工作性質(zhì)及崗位職責的不同，要求各相關(guān)崗位必須相互協(xié)調(diào)與配合，保證藥品養(yǎng)護工作的有效開展。

質(zhì)量管理人員負責對藥品養(yǎng)護人員進行業(yè)務(wù)指導，審定藥品養(yǎng)護工作計劃，確定重點養(yǎng)護品種，對藥品養(yǎng)護人員上報的質(zhì)量問題進行分析并確定處理措施，對養(yǎng)護工作的開展情況實施監(jiān)督考核。

養(yǎng)護人員負責指導保管人員對藥品進行合理儲存，定期檢查在庫藥品儲存條件及庫存藥品質(zhì)量，針對藥品的儲存特性采取科學有效的養(yǎng)護方法，定期匯總、分析和上報藥品養(yǎng)護質(zhì)量信息，負責驗收養(yǎng)護儲存儀器設(shè)備的管理工作，建立藥品養(yǎng)護檔案。

藥品的儲存質(zhì)量是受儲存環(huán)境和藥品性狀的制約和影響。在實際工作中，應(yīng)根據(jù)經(jīng)營藥品的品種結(jié)構(gòu)、藥品儲存條件的要求、自然環(huán)境的變化、監(jiān)督管理的要求，在確保日常養(yǎng)護工作有效開展的基礎(chǔ)上，將部分藥品確定為重點養(yǎng)護品種，采取有針對性的養(yǎng)護方法。

重點養(yǎng)護品種范圍一般包括：主營品種、首營品種、質(zhì)量性狀不穩(wěn)定的品種、有特殊儲存要求的品種、儲存時間較長的品種、近期內(nèi)發(fā)生過質(zhì)量問題的品種及藥監(jiān)部門重點監(jiān)控的品種。

養(yǎng)護員按照“三三四”原則，每月對在庫藥品質(zhì)量（藥店陳列藥品）進行巡回檢查，并做好養(yǎng)護檢查記錄。

（三三四原則全稱應(yīng)該叫做：三三四藥品質(zhì)量循環(huán)檢查法。方法是將在庫藥品分為A、B、C3類，每類分別占總庫存的30%、30%、40%左右，然后每個月檢查一類，3個月就可將在庫藥品檢查完一遍，總計1年檢查4遍。）

中藥的采購與貯藏與養(yǎng)護

第一節(jié)中藥飲片的采購和驗收

驗收藥品應(yīng)當做好驗收記錄，包括藥品的通用名稱、劑型、規(guī)格、批準文號、批號、生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)廠商、供貨單位、到貨數(shù)量、到貨日期、驗收合格數(shù)量、驗收結(jié)果等內(nèi)容。驗收人員應(yīng)當在驗收記錄上簽署姓名和驗收日期。

中藥材驗收記錄應(yīng)當包括品名、產(chǎn)地、供貨單位、到貨數(shù)量、驗收合格數(shù)量等內(nèi)容。中藥飲片驗收記錄應(yīng)當包括品名、規(guī)格、批號、產(chǎn)地、生產(chǎn)日期、生產(chǎn)廠商、供貨單位、到貨數(shù)量、驗收合格數(shù)量等內(nèi)容，實施批準文號管理的中藥飲片還應(yīng)當記錄批準文號。

第二節(jié)中藥的質(zhì)量變異現(xiàn)象

一、飲片貯存中常見的質(zhì)量變異現(xiàn)象

1.蟲蛀：含淀粉、糖、脂肪、蛋白質(zhì)

大黃、白芷、桑螵蛸、北沙參、娑羅子、前胡

蟲蛀大白紙，桑蛸殺娑湖

2.泛油：含揮發(fā)油：當歸、丁香

含脂肪油：柏子仁、桃仁、杏仁

含糖：牛膝、麥冬、天冬、熟地、黃精

白（柏）杏歸香桃，二冬贖（熟）精牛

3.霉變：陳皮、獨活、前胡、佛手

4.變色

由淺變深：澤瀉、白芷、山藥、天花粉

由深變淺：黃芪、黃柏

由鮮艷變暗淡：紅花、菊花、金銀花、臘梅花

5.氣味散失：肉桂、沉香、豆蔻、砂仁

6.風化：膽礬、硼砂、芒硝

7.潮解：青鹽、咸秋石、芒硝

8.粘連：蘆薈、沒藥、乳香、阿魏、鹿角膠、龜甲膠

9.腐爛：鮮類藥

二、中成藥貯存中常見質(zhì)量變異現(xiàn)象

蟲蛀：蜜丸、水丸、散劑、茶曲劑

霉變：蜜丸、膏滋、片劑

酸?。汉蟿?、酒劑、煎膏劑、糖漿劑、軟膏劑

揮發(fā)：芳香水劑、酊劑

沉淀：藥酒、口服液、針劑

第三節(jié)引起中藥質(zhì)量變異的因素

一、自身因素（6個）

1.水分高：蟲蛀、霉爛、潮解、軟化、粘連

低：風化、走味、泛油、干裂、脆化

2.淀粉蟲蛀、霉變

3.黏液質(zhì)發(fā)霉、生蟲

4.油脂產(chǎn)生異味：桃仁、杏仁

引起酸敗現(xiàn)象：刺猬皮、狗腎

5.揮發(fā)油氣味散失：白芷、當歸、荊芥、薄荷、肉桂、樟腦、姜黃、山奈

6.色素發(fā)霉變色：月季花、玫瑰花

二、環(huán)境因素（8個）

1.溫度生蟲、發(fā)霉；水分蒸發(fā)；氣味散失；成分變化；酸敗泛油；黏結(jié)成塊

2.濕度貯存?zhèn)}庫的相對濕度最好控制在70%以下

高：吸潮變質(zhì)；低：風化

3.日光變色、氣味散失、揮發(fā)、風化、泛油

4.空氣泛油、蟲蛀、霉變

5.霉菌霉變、腐爛變質(zhì)

6.害蟲蟲蛀

7.包裝容器

8.貯存時間

第四節(jié)中藥的貯存與養(yǎng)護

一、中藥材和飲片的貯藏

■飲片庫房室溫控制在25℃以下，相對濕度75%以下

■陰涼干燥處：含揮發(fā)油類（薄荷、當歸、川芎、荊芥）

■涼爽處：礦物類（硼砂、芒硝）

■石灰保存：牛黃、人參

■易燃物品：硫黃、火硝、樟腦

■毒性藥品：單獨存放

■密封保存：動物類、礦物類

二、中藥材和飲片的養(yǎng)護

1.傳統(tǒng)養(yǎng)護技術(shù)（6個）

清潔養(yǎng)護法、除濕養(yǎng)護法、密封（密閉）養(yǎng)護法、低溫養(yǎng)護法、對抗同貯法、高溫養(yǎng)護法

■清潔養(yǎng)護法：清潔衛(wèi)生是防止倉蟲入侵的最基本和最有效的方法

■除濕養(yǎng)護法：

1.通風法

2.吸濕防潮法：生石灰塊、無水氯化鈣

■密封（密閉）養(yǎng)護法：是貯藏的基本方法

■低溫養(yǎng)護法：2～10℃，具有防霉、防蟲、防變色、防走油，主要用于貴重藥材保存，如哈蟆油、銀耳、人參、菊花、陳皮、山藥、枸杞子（＜-4℃可使害蟲致死）

■高溫同貯法：可有效防治蟲害的侵襲。高于40℃害蟲停止發(fā)育，高于50℃，害蟲將在短時間死亡。含揮發(fā)油的飲片烘烤溫度不宜超過60℃

對抗同貯法

2.現(xiàn)代養(yǎng)護技術(shù)（8個）

干燥養(yǎng)護技術(shù)

氣調(diào)養(yǎng)護技術(shù)

60Co-γ射線輻射殺蟲滅菌養(yǎng)護技術(shù)

包裝防霉養(yǎng)護法

氣幕防潮養(yǎng)護技術(shù)

蒸氣加熱養(yǎng)護技術(shù)

氣體滅菌養(yǎng)護技術(shù)

中藥揮發(fā)油熏蒸防霉技術(shù)

三、中成藥的養(yǎng)護

應(yīng)密閉貯存：散劑、膠劑、膏藥、軟膏、鼻用制劑、栓劑、凝膠劑

應(yīng)密封貯存：丸劑、片劑、煎膏劑、合劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑、酒劑、露劑

溫度低于30℃的劑型：膠囊劑、栓劑

遮光：軟膏劑、注射劑、酊劑、流浸膏與浸膏劑、凝膠劑、眼用制劑

四、中國藥典凡例

遮光：用不透光的容器包裝

密閉：防止塵土及異物進入

密封：防止風化、吸潮、揮發(fā)或異物進入

熔封或嚴封：防止空氣和水分侵入，防止污染

陰涼處：不超過20℃

涼暗處：避光并不超過20℃

冷處：2～10℃

常溫：10～30℃

檢查日期、藥品名稱、劑型、規(guī)格、單位、數(shù)量、生產(chǎn)廠家、批號、批準文號、有效期、質(zhì)量狀況、養(yǎng)護措施、處理結(jié)果。

養(yǎng)護員：

表格中除：檢查日期、質(zhì)量狀況、養(yǎng)護措施、處理結(jié)果、養(yǎng)護員欄要手工填寫外，其余電腦自動可生成。

檢查日期：從打印時間開始填寫至下月幾號為止，看有多少頁平均后連續(xù)填寫時間也可，但不能填寫一樣的時間；

質(zhì)量狀況：填寫“無異?！?；

養(yǎng)護措施：可填寫“效期催銷”、“翻垛”、“通風”等，視具體需要養(yǎng)護情況而定；

處理結(jié)果：“繼續(xù)銷售”；

養(yǎng)護員：要簽完整名字。

二）養(yǎng)護工作的具體實施

1、養(yǎng)護儲存的合理性

藥品養(yǎng)護員在日常管理過程中，應(yīng)對在庫藥品的分類儲存、貨垛碼放、垛位間距、色標管理等工作內(nèi)容進行巡查，及時糾正發(fā)現(xiàn)的問題，確保藥品按規(guī)定的要求合理儲存。

2、倉儲條件監(jiān)測與控制

藥品倉儲條件的監(jiān)測與控制內(nèi)容主要包括：庫內(nèi)溫濕度、藥品儲存設(shè)備的適宜性，藥品避光和防鼠等措施的有效性、安全措施的運行狀態(tài)。

為保證各類庫房的溫、濕度符合規(guī)定的要求，倉庫保管人員要在養(yǎng)護員的指導下，有效地對庫房溫、濕度條件進行動態(tài)監(jiān)測和管理，發(fā)現(xiàn)庫房溫濕度超出規(guī)定范圍或接近臨界值時，或接近臨界值時，應(yīng)及時采取通風、降溫、除濕、保溫等措施進行有效調(diào)控，并予以記錄。對庫房的溫、濕度條件應(yīng)定時進行觀察記錄，一般每日上、下午各一次。

為確保倉庫溫濕度條件的全天候監(jiān)控，藥品控制企業(yè)在節(jié)假日也應(yīng)安排值班人員，對倉庫的儲存條件進行監(jiān)控。

3、庫存藥品質(zhì)量的循環(huán)檢查

養(yǎng)護員應(yīng)按照規(guī)定的方法和要求，定期對庫存藥品的質(zhì)量狀況進行循環(huán)檢查，循環(huán)養(yǎng)護檢查一般按季度進行。購進藥品應(yīng)在入庫后三個月起進行第一次庫存藥品檢查。養(yǎng)護時應(yīng)做好養(yǎng)護記錄，對養(yǎng)護中的藥品質(zhì)量狀況進行準確的記錄。

當氣候條件出現(xiàn)異常變化，遇高溫、嚴寒、雨季或發(fā)現(xiàn)藥品有質(zhì)量變化跡象時，應(yīng)由質(zhì)量管理部組織有關(guān)人員或全面檢查；為避免漏查，應(yīng)嚴格規(guī)定檢查順序，如：按每個貨架、貨垛順時針檢查等；主要檢查內(nèi)容包括包裝情況、外觀性狀，對易變質(zhì)藥品、儲存期較長、近效期不足一年的藥品或其它應(yīng)檢查的藥品，應(yīng)按規(guī)定的程序和要求進行有效的管理。

4、養(yǎng)護中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題的處理

藥品養(yǎng)護中發(fā)現(xiàn)的問題一般包括技術(shù)操作、設(shè)施設(shè)備、藥品質(zhì)量等方面的內(nèi)容，養(yǎng)護員應(yīng)對發(fā)現(xiàn)的問題進行認真的分析，及時上報質(zhì)量管理部核實、處理，按照質(zhì)量管理部的要求，采取措施對質(zhì)量管理過程實施改進，從而有效地控制藥品儲存質(zhì)量。

養(yǎng)護員對養(yǎng)護過程中發(fā)現(xiàn)的藥品質(zhì)量問題，應(yīng)懸掛醒目的黃色標牌，并暫停發(fā)貨，上報質(zhì)量管理機構(gòu)進行處理。

（三）藥品養(yǎng)護檔案與信息

為給藥品養(yǎng)護工作提供系統(tǒng)、全面的管理依據(jù)，不斷提高藥品養(yǎng)護的技術(shù)水平，企業(yè)應(yīng)針對重點養(yǎng)護品種建立藥品養(yǎng)護檔案，收集、分析、傳遞養(yǎng)護過程中的信息資料，從而保證藥品養(yǎng)護質(zhì)量系統(tǒng)的有效運行。

1、藥品養(yǎng)護檔案

企業(yè)應(yīng)結(jié)合倉儲管理的實際，本著"以保證藥品質(zhì)量為前提，以服務(wù)業(yè)務(wù)經(jīng)營需要為目標"的原則，針對重點養(yǎng)護品種建立藥品重點養(yǎng)護品種建立藥品養(yǎng)護檔案。藥品養(yǎng)護檔案是在一定的經(jīng)營周期內(nèi)，對藥品儲存質(zhì)量的穩(wěn)定性進行連續(xù)觀察與監(jiān)控，總結(jié)養(yǎng)護經(jīng)驗，改進養(yǎng)護方法，積累技術(shù)資料的管理手段。其內(nèi)容包括藥品的基本質(zhì)量信息、觀察周期內(nèi)對藥品儲存質(zhì)量的追蹤記錄、有關(guān)問題的處理情況等。藥品養(yǎng)護檔案的品種應(yīng)根據(jù)業(yè)務(wù)經(jīng)營活動的變化，及時調(diào)整，一般應(yīng)按年度調(diào)整確定。

2、養(yǎng)護質(zhì)量信息

按照GSP規(guī)定，藥品養(yǎng)護人員應(yīng)定期匯總、分析和上報養(yǎng)護檢查、近效期或長時間儲存的藥品的質(zhì)量信息。以便質(zhì)量管理部門和業(yè)務(wù)部門及時、全面地掌握儲存藥品質(zhì)量信息，合理調(diào)節(jié)庫存藥品的數(shù)量，保證經(jīng)營藥品符合質(zhì)量要求，其報告內(nèi)容應(yīng)匯總該經(jīng)營周期內(nèi)經(jīng)營品種的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、批次等項目，統(tǒng)計并分析儲存養(yǎng)護工程中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題的相關(guān)指標，如質(zhì)量問題產(chǎn)生的原因、比率，進而提出養(yǎng)護工作改進的措施及目標。

（四）、影響藥品質(zhì)量的因素

1、影響藥品質(zhì)量的內(nèi)在因素

a、易水解的藥品當藥品的化學結(jié)構(gòu)中含有酯、酰胺、酰肼、醚、苷鍵時，易發(fā)生水解反應(yīng)。如青霉素的分子中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，在酸性、中性或堿性溶液中易發(fā)生分解反應(yīng)和分子重排反應(yīng)，其分解產(chǎn)物與分子重排物均無抗菌作用。故青霉素只能制成粉末，嚴封于容器中貯藏。

b、易被氧化的藥品當藥品的化學結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、巰基、香胺、不飽和碳鍵、醇、醚、醛、吡唑酮、吩噻嗪等基團時，易發(fā)生氧化反應(yīng)。如氯丙嗪屬于吩噻嗪類化合物，在日光、空氣、濕氣的作用下易變質(zhì)失效，故應(yīng)遮光，密封保存。

2、藥品的物理性質(zhì)與質(zhì)量的關(guān)系

a、揮發(fā)性系指液態(tài)藥品能變?yōu)闅鈶B(tài)擴散到空氣中的性質(zhì)。具有揮發(fā)性的藥品如果包裝不嚴或貯存時的溫度過高，可造成揮發(fā)減量，如乙醇、薄荷等在常溫下即有強烈的揮發(fā)性，還可以引起燃燒和爆炸。

b、吸濕性系指藥品自外界空氣中不同程度地吸附水蒸氣的性質(zhì)。藥品的吸濕性并不限于水溶性藥品，某些高分子藥品和水不溶性藥品同樣可以吸濕,但當含有少量的氯化鎂等雜質(zhì)時，則表現(xiàn)出顯著的吸濕性。

c、吸附性藥品能夠吸收空氣中的有害氣體或特殊臭氣的性質(zhì)被稱為藥品的吸附性。例如淀粉、藥用碳、滑石粉等因表面積大而具有顯著的吸附作用從而使本身具有被吸附氣體的氣味，亦稱"串味"。

d、凍結(jié)性以水或乙醇作溶劑的一些液體藥品遇冷可凝結(jié)成固體，這種固體會導致藥品的體積膨脹而引起容器破裂。

e、風化性有些含結(jié)晶水的藥品在干燥空氣中易失去全部或部分結(jié)晶水，變成白色不透明的晶體或粉末，稱為"風化"。風化后的藥品的藥效雖然未變，但影響使用的準確性,尤其是一些毒性較大的藥品可因此而超過劑量，造成醫(yī)療事故。

f、色、嗅、味藥品色、嗅、味是藥品重要的外觀性狀，也是藥品的物理性質(zhì)之一，當色、嗅、味發(fā)生變化時，經(jīng)常意味著藥品性質(zhì)發(fā)生了變化，所以它們是保管人員實施感官檢查的重要根據(jù)。如維生素C片由白變黃，是由于發(fā)生了氧化反應(yīng)；阿司匹林片出現(xiàn)針狀結(jié)晶或濃厚的醋酸味，是由于因吸濕而發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生了水楊酸和乙酸；某些藥品的異臭、異味可能是微生物所引起發(fā)酵、腐敗等。

此外，藥品的熔化性、溶解性等均是影響藥品質(zhì)量的內(nèi)在因素。

2、影響藥品質(zhì)量的外在因素

影響藥品質(zhì)量的外在因素很多，這些因素對藥品的影響往往是幾種因素同時進行或交叉進行，互相促進、互相作用而加速藥品的變質(zhì)和失效。因此，我們所采取的保管措施也應(yīng)是綜合性的。

（1）、空氣

空氣是不同氣體的混合物，主要成分是氮、氧、二氧化碳以及氬、氖、氪、氙等稀有元素。此外，空氣中還含有水蒸氣、二氧化碳和塵埃等。在被污染的空氣中還混雜有二氧化硫、硫化氫、氨、氯化氫等有害氣體。與藥品的質(zhì)量有關(guān)的主要是氧、二氧化碳。

a、氧

許多具有還原性藥品，可被空氣中的氧所氧化，發(fā)生分解、變色、變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒性。如異丙腎上腺素被氧化后，可由白色變?yōu)榉奂t色，此時即不可供藥用。

b、二氧化碳

空氣中的二氧化碳可使某些藥品因發(fā)生碳酸化而變質(zhì)。如某些氫氧化物和氧化物易吸收二氧化碳而生成碳酸鹽；磺胺類鈉鹽與二氧化碳作用后，可生成難溶于水的游離磺胺而結(jié)晶析出。

（2）、溫度

溫度在藥品的保管養(yǎng)護中是重要條件之一，它與濕度有密切的關(guān)系，干燥的固體藥品受溫度影響的程度遠比吸潮或呈液體狀態(tài)的藥品小的多。

a、溫度升高可加速藥品的變質(zhì)如生物制品、血液制品在室溫下保管容易失效，需要低溫冷藏（2~10℃）；可加速藥品的揮發(fā)與風化如咖啡因可失去分子中的結(jié)晶水；可破壞藥品的劑型如可使栓劑、膠囊劑軟化變形，使糖衣片粘連，使軟膏劑熔化分層等。

b、溫度過低可使一些生物制品、含蛋白制劑、乳劑及膠體制劑析出沉淀或變性分層，如甲醛溶液在9℃以下易聚合成為多聚甲醛而使溶液呈現(xiàn)混濁或析出白色沉淀；可使許多液體制劑析出結(jié)晶，其中一些藥品因結(jié)晶而失效，如葡萄糖酸鈣注射液等飽和溶液久置冷處易析出結(jié)晶不再溶解，而不能藥用；可致容器因藥液體積增加而破裂等。

（3）、濕度

濕度是藥品養(yǎng)護的重要條件之一，濕度過高或過低均引起許多藥品發(fā)生變性。

a、潮解

如鈉鹽吸濕性較大，最易發(fā)生潮解；一些不溶于水的藥品如活性碳及干燥氫氧化鋁等也可因物理吸附作用而潮解；胃蛋白酶、胰酶等易于吸濕結(jié)成團塊。

b、稀釋

一些具有吸水性的液體藥品如甘油、乳酸等再潮濕環(huán)境匯總易吸收水分而被稀釋，從而使?jié)舛冉档?，影響藥效?/p>

c、水解

有些藥品因吸潮而分解變質(zhì)，如阿司匹林易吸濕而水解生成乙酸和水楊酸，不但毒性增加，