肉豆蔻種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018肉豆蔻種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肉豆蔻（MyristicafragransHoutt.）種子液氮超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉豆蔻種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。肉豆蔻Myristica

fragrans

Houtt.為肉豆蔻科（Myristicaceae）肉豆蔻屬（MyristicaGronov.）植物，是熱帶著名的香料和藥用植物。種子含固體油，可做工業(yè)用油，其余供藥用，治虛瀉冷痢、脘腹冷痛、嘔吐等；外用可作寄生蟲驅(qū)除劑，治療風(fēng)濕痛。收載于《中國藥典（2015）》。肉豆蔻果實(shí)MyristicafragransHoutt.fruits肉豆蔻果通常單生，具短柄，有時(shí)具殘存的花被片，成熟時(shí)果實(shí)自然開裂。肉豆蔻種子Myristica

fragransHoutt.seeds肉豆蔻的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子卵珠形或橢圓形，長2~3cm，直徑1.5~2.5cm；表面灰棕色或灰黃色，有時(shí)外被白粉（石灰粉末）；種皮外有淺色縱行溝紋和不規(guī)則網(wǎng)狀溝紋。種臍位于寬端，呈淺色圓形突起，合點(diǎn)呈暗凹陷。種脊呈縱溝狀，連接兩端。質(zhì)堅(jiān)，斷面顯棕黃色相雜的XX孖花紋，寬端可見胚，富油性。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的肉豆蔻種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收9月下旬至10月上旬，當(dāng)果皮為蠟黃色、果肉自然開裂，假種皮全部深紅色、種皮變硬呈黑褐色時(shí)，即可采收，去除果皮和紅色假種皮，取出種子。種子選擇挑選表面灰褐色或黑褐色、較光滑油亮、個(gè)大飽滿、質(zhì)地堅(jiān)硬、健康的種子，置于10℃種子低溫低濕儲(chǔ)藏柜中保存?zhèn)溆茫ú怀^15天）。種子前處理生活力檢測參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測種子生活力。隨機(jī)抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒種子，室溫（25℃）避光放置5h后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的肉豆蔻種子生活力應(yīng)≥90%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹肉豆蔻種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為150:1，室溫條件下干燥處理10~30h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由35%~45%降至26%~28%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量肉豆蔻種子保存量不少于300粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式肉豆蔻種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的肉豆蔻種子放入15mL凍存管（每管2粒種子）中，迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出10個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍5min。凍后種子生活力檢測取出5管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥55%時(shí)視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將剩下5管解凍后的肉豆蔻種子，播種到帶有無菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度28℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。肉豆蔻出芽周期大概10d～30d。附錄TTC的配置和保存方法精密稱取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶內(nèi)4℃冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1L無菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氫鈉溶于1L無菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）參考文獻(xiàn)中國植物志委員會(huì).《中國植物志》第30（2）卷[M].科學(xué)出版社.2004（1979）:194[2]LiPing-tao.ThomasK.Wilson.Myristicaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2008.7:99.[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].XX，中國醫(yī)藥科技出版社，2015：136[4]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學(xué)[M].中國科學(xué)文化出版社，2004:1[5]ReedBM.PlantCryopres