第五章-沉淀分離分析課件

生物分離過(guò)程的一般流程生物分離過(guò)程的一般流程1第五章沉淀分離5.1概述5.2鹽析法5.3有機(jī)溶劑沉淀法5.4非離子多聚物沉淀法5.5其他沉淀法第五章沉淀分離25.1概述沉淀的概念沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相的過(guò)程。在生物工業(yè)、有機(jī)化工工業(yè)、無(wú)機(jī)化工工業(yè)及實(shí)驗(yàn)室分析中，沉淀都是分離與純化中最常用的方法之一。沉淀：溶質(zhì)→固相5.1概述沉淀的概念35.1概述沉淀的作用有二：

一是濃縮，通過(guò)沉淀目的產(chǎn)物由液相變成固相，濃縮倍數(shù)可達(dá)幾十倍至數(shù)百倍；

二是純化，通過(guò)沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的產(chǎn)物是固相）或沉積在固相中（目的產(chǎn)物留在液相）的雜質(zhì)。

5.1概述沉淀的作用有二：4沉淀法操作步驟：①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；③離心或過(guò)濾，收集沉淀物。

加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。沉淀法操作步驟：55.1概述沉淀分離的應(yīng)用沉淀分離具有成本低、收率高、濃縮倍數(shù)大和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于氨基酸、酶制劑、抗菌素等生物工業(yè)中。對(duì)于某些不需純度要求的生物產(chǎn)品（如工業(yè)用酶制劑），沉淀分離是一種常用提取方法。但對(duì)于某些純度要求很高的生物產(chǎn)品，在沉淀分離中，濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀分離通常作為初步分離的一種方法。

5.1概述沉淀分離的應(yīng)用65.1概述沉淀劑的選擇沉淀劑的作用是降低溶質(zhì)的溶解度使之析出，除考慮沉淀效果外還需考慮下列因素：（1）沉淀劑對(duì)目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與活性是否有破壞作用；（2）沉淀劑是否容易除去（離子交換、蒸發(fā)、萃取等）；（3）沉淀劑是否有毒性。5.1概述沉淀劑的選擇75.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同，生物工業(yè)中常用的沉淀方法有如下幾種：①鹽析法：多用于蛋白質(zhì)和酶的分離純化。

②有機(jī)溶劑法：多用于生物小分子、多糖及核酸類產(chǎn)品的分離與純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)和酶的沉淀。

③等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。5.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同85.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是發(fā)展很快的一種方法。⑤生成鹽類復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物（其中主要是酸性或堿性化合物），其中小分子物質(zhì)的沉淀應(yīng)用較多。⑥選擇變性沉淀法：熱變性或酸堿變性沉淀法，常用于除去某些不耐熱及在一定pH值下易變性的雜蛋白。但應(yīng)以在實(shí)驗(yàn)條件下所分離物質(zhì)的活性不受影響為前提。5.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生95.2鹽析法一般說(shuō)來(lái)，所有固性溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程稱為鹽析。鹽析法具有如下特點(diǎn)：

（1）成本低，不需要什么特別昂貴的設(shè)備；（2）操作簡(jiǎn)單、安全；（3）對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；（4）存在產(chǎn)品與雜質(zhì)的共沉作用，因而它只能作為初步純化。5.2鹽析法一般說(shuō)來(lái)，所有固性溶質(zhì)都可以在105.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理蛋白分子的表面同時(shí)含有帶電荷的親水基團(tuán)和不帶電荷的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)的溶解度差別——取決于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)的比例和這些基團(tuán)的排列位置。

5.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理115.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：在水溶液中，蛋白質(zhì)分子中的親水基團(tuán)吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合作用。這些水分子在蛋白質(zhì)分子的表面形成一層水化膜。由于水膜的存在，各蛋白質(zhì)分子間彼此隔開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子在水中呈溶解狀態(tài)。

5.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：125.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶，這是因?yàn)楫?dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入少量中性鹽時(shí)，中性鹽離子對(duì)蛋白質(zhì)分子表面親水基團(tuán)（及水活度）的影響，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用力，從而使蛋白質(zhì)的溶解度增大。蛋白質(zhì)溶液少量中性鹽

增加蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用→蛋白質(zhì)溶解度↑5.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白135.2.1.1鹽析原理蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)中性鹽濃度增加至一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和（親水基團(tuán)被大量中性鹽離子所包圍），水分子離開(kāi)蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。

（3）鹽析作用（Salting-out)：

加入大量中性鹽↓

蛋白質(zhì)溶液→親水基團(tuán)被中性鹽包圍→疏水基團(tuán)的相互作用→蛋白質(zhì)相互聚集（溶解度下降）

5.2.1.1鹽析原理蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)14lgS（溶解度）I（離子強(qiáng)度）

鹽溶鹽析β

圖5-1溶液離子強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系lgS（溶解度）I（離子強(qiáng)度）鹽溶鹽析β圖5-1溶155.2.1.2Cohn方程式蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度的關(guān)系可由Cohn經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)表示：（5-1）其中：（5-2）式中：S—蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）

I—離子強(qiáng)度

mi—i離子的摩爾濃度（mol/L）

Zi—i離子所帶的電荷數(shù)（即離子的價(jià)數(shù)）

β—鹽析常數(shù)，與鹽的種類無(wú)關(guān)

KS—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無(wú)關(guān)5.2.1.2Cohn方程式蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度16關(guān)于β值：（1）β值與鹽的種類無(wú)關(guān)，在式（5-1）中，令I(lǐng)=0，則：

β=lg

S0（5-3）

S0表示在純?nèi)軇┲校碔=0）蛋白質(zhì)的溶解度，由此可見(jiàn)β是一個(gè)與鹽的種類無(wú)關(guān)的常數(shù)。β值的大小主要決定于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。（2）β值不可能直接測(cè)定

β值是假定離子強(qiáng)度I=0時(shí)，用外推法求出的。事實(shí)上由于鹽溶作用的存在，I=0時(shí)的溶解度比低鹽溶液要低。（3）β值隨溫度和pH而變

關(guān)于β值：17關(guān)于KS——主要取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，而與溫度和pH無(wú)關(guān)。（1）KS與蛋白質(zhì)種類的關(guān)系對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，KS值的變化不是很大，大多不超過(guò)1倍。一般地：組成相同的蛋白質(zhì)，分子量越大，KS較大，沉淀所需用鹽量越少；蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱性越大，KS值較大，越容易沉淀。如表5-2所示為采用硫酸銨鹽析時(shí)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)。表5-2硫酸銨對(duì)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)

蛋白質(zhì)馬血紅蛋白馬肌紅蛋白卵青蛋白纖維蛋白原

KS0.710.941.221.46關(guān)于KS——主要取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，而與溫度和pH無(wú)關(guān)。18（2）KS與鹽種類的關(guān)系不同種類的鹽，對(duì)KS的影響較大。KS值較大，就意味著該鹽的鹽析效果好，其中陰離子的影響較顯著，而陽(yáng)離子的影響是第二位的。對(duì)于陰離子，含高價(jià)陰離子的鹽，效果比低價(jià)的好。常用陰離子的鹽析效果排列如下：檸檬酸鹽＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-對(duì)于陽(yáng)離子，一般地高價(jià)陽(yáng)離子（如Mg2+、Ca2+）不如低價(jià)陽(yáng)離子，常用一價(jià)陽(yáng)離子的鹽析效果排列如下：

NH4+＞K+＞Na+而常用鹽析劑鹽析效果的排列順序?yàn)椋?/p>

NaH2PO4＞(NH4)2SO4＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl（2）KS與鹽種類的關(guān)系19表5-1不同鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的KS值和β值

用不同鹽類采用外推法求β值時(shí)，因溫度和pH等條件不同，β值會(huì)有所變動(dòng)。如表5-1所示，各種鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的β值在3.0左右。鹽種類磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂β3.012.533.092.603.23

KS

1.000.760.710.690.33表5-1不同鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的KS值和β值鹽205.2.1.3分段鹽析法

（1）KS分段鹽析法——改變離子強(qiáng)度對(duì)于蛋白質(zhì)混合物，不同蛋白質(zhì)在不同離子強(qiáng)度下的溶解度不同，發(fā)生鹽析時(shí)所需的離子強(qiáng)度也就不同。根據(jù)這一原理，采用不同離子強(qiáng)度分步鹽析的方法，即可從蛋白質(zhì)混合物中分離各種不同的組份。如：

硫酸銨飽和度開(kāi)始析出的蛋白質(zhì)種類20%纖維蛋白原28~33%血紅蛋白33~35%擬球蛋白50%清蛋白80%肌紅蛋白這種改變離子強(qiáng)度的分段鹽析法稱為KS分段鹽析法，常用于粗蛋白質(zhì)和酶的分段分離。5.2.1.3分段鹽析法（1）KS分段鹽析法——改變離21204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)最適飽和度是30%，55%204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)最適飽和度是30%，225.2.1.3分段鹽析法

（2）β分段鹽析法——改變pH和溫度不同蛋白質(zhì)在不同溫度和pH值下的溶解度不同，因此在一定離子強(qiáng)度下改變混合液pH和溫度亦可實(shí)現(xiàn)分段鹽析的目的。由于這種方法是通過(guò)改β值的大小來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因而叫做β分段鹽析法。此法常用于蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化和結(jié)晶時(shí)使用。

5.2.1.3分段鹽析法（2）β分段鹽析法——改變pH和235.2.2影響鹽析的若干因素

5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系從Cohn式可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時(shí)，發(fā)生鹽析時(shí)需要較高的離子濃度。如用硫酸銨鹽析碳氧肌紅蛋白（COMb）時(shí)：5.2.2影響鹽析的若干因素5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度24蛋白質(zhì)起始濃度COMb開(kāi)始沉淀時(shí)硫酸銨的飽和度90%的COMb沉淀析出時(shí)硫酸銨的飽和度30g/L58%65%3g/L66%73%

由此可見(jiàn)，在不同濃度的蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行鹽析，使用硫酸銨的飽和度是不相同的。

蛋白質(zhì)起始濃度COMb開(kāi)始沉淀時(shí)硫酸銨的飽和度90%的C255.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系

③用于分步分離提純時(shí)，一般采用較稀的蛋白質(zhì)溶液，多加一些中性鹽，使共沉作用減少至最低限度，一般采用的蛋白質(zhì)濃度為2.5~3.0%。

①

蛋白質(zhì)起始濃度高②蛋白質(zhì)起始濃度低5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系③用于分步分離提純265.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響蛋白質(zhì)凈電荷越多→它的溶解度越大→β值(lgS0)就越高。改變?nèi)芤旱膒H→即可改變蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷的數(shù)量→從而改變?chǔ)轮档拇笮?。?dāng)pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）時(shí)，蛋白質(zhì)分子上的凈電荷數(shù)為零，溶解度最小，β值最低。因此在鹽析時(shí)常選擇溶液pH在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。5.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響蛋白質(zhì)凈電荷越多→它的溶解度27pH兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨pH而變化很大；β隨pH變化（1）對(duì)數(shù)關(guān)系（2）等電點(diǎn)附近有極小值βpH兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨pH而變化很大；β285.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響（1）pH值對(duì)鹽析的影響較大：由于β=lgS0，當(dāng)β值增加1時(shí)，溶解度（S）就增加10倍。對(duì)某些蛋白質(zhì)，在一定鹽濃度下，不同的pH下的β值相差達(dá)3倍以上，也即蛋白質(zhì)溶解度的變化達(dá)1000倍以上。因此，鹽析過(guò)程中pH的控制是非常嚴(yán)格的。（2）關(guān)于pI值：在水中或稀鹽溶液中測(cè)得的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI），與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果不一定相同。因此需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整pH值至蛋白質(zhì)溶解度最低處，才能獲得更好的效果。

5.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響（1）pH值對(duì)鹽析的影響較大295.2.2.3溫度對(duì)鹽析的影響

一般說(shuō)來(lái)，溫度升高，溶質(zhì)的溶解度增大。（1）在低鹽溶液或純水中，生物大分子的溶解度大多數(shù)在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加；（2）在高鹽溶液中，生物大分子的溶解度隨溫度的升高而減少，這是因?yàn)檩^高的溫度會(huì)使蛋白質(zhì)分子失水，因而利于沉淀。（3）盡管較高的溫度有利于鹽析沉淀，但較高溫度易使蛋白質(zhì)變性和發(fā)生共沉作用，因此蛋白質(zhì)鹽析過(guò)程通常在室溫下進(jìn)行（25℃左右），對(duì)某些溫度比較敏感的酶，則需要在低溫下（0~4℃）操作。

5.2.2.3溫度對(duì)鹽析的影響一般說(shuō)來(lái)，溫度升高，溶質(zhì)的30第五章-沉淀分離分析課件315.2.3硫酸銨鹽析法

常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉和硫氰化鉀等。硫酸銨：溶解度大，但緩沖能力弱，此外因含有NH4+，對(duì)蛋白質(zhì)的分析會(huì)帶來(lái)一定影響。硫酸鈉：不含氮，不影響蛋白質(zhì)的定量測(cè)定；但溶解度較低，一般要在30℃以上操作效果較好。5.2.3硫酸銨鹽析法常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂325.2.3硫酸銨鹽析法

表5-3不同溫度下硫酸銨和硫酸鈉的溶解度溫度（℃）

010202530硫酸銨

(g/kg水)706.96730.73757.16769.05780.95(mol/kg水)5.355.535.735.825.91硫酸鈉

（g/L）13.818.424.828.232.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.2305.2.3硫酸銨鹽析法表5-3不同溫度下硫酸銨和33硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況；它可防止局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：345.2.3.1硫酸銨的預(yù)處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：（1）重結(jié)晶；（2）H2S處理—除重金屬（對(duì)巰基敏感）pH調(diào)整：（1）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI<5.0時(shí)，用硫酸或磷酸（2）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI>5.0時(shí)，用氨水5.2.3.1硫酸銨的預(yù)處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：355.2.3.2硫酸銨飽和度的調(diào)整（分段鹽析）（1）加入固體鹽法：適合于飽和度較高的場(chǎng)合。每升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨的克數(shù)可用下式計(jì)算：（2）加入飽和溶液法：適合于飽和度不高的場(chǎng)合。V1升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨飽和溶液的體積為：5.2.3.2硫酸銨飽和度的調(diào)整（分段鹽析）（1）加入固365.3有機(jī)溶劑沉淀法

5.3.1有機(jī)溶劑法沉淀原理

一般水溶液加入有機(jī)溶劑水溶液的介電常數(shù)↓→溶質(zhì)分子（蛋白質(zhì)）之間靜電引力↑→溶質(zhì)的溶解度↓。對(duì)于具有表面水化層的生物大分子：生物大分子溶液有機(jī)溶劑與水作用表面水化層被壓縮→生物大分子脫水→聚集析出。5.3有機(jī)溶劑沉淀法5.3.1有機(jī)溶劑法沉淀原理37有機(jī)溶劑沉淀法具有如下特點(diǎn)：①不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑濃度不同，這是有機(jī)溶劑分步沉淀的基礎(chǔ)。其分辨能力比鹽析法高。②溶劑容易蒸發(fā)除去，因此適合于制備食品用蛋白質(zhì)。③有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，過(guò)濾和離心分離都較容易。④容易使某些生物大分子變性失活。⑤有機(jī)溶劑易燃易爆，操作常需在低溫下進(jìn)行。

有機(jī)溶劑沉淀法具有如下特點(diǎn)：①不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑385.3.2有機(jī)溶劑的選擇

選擇依據(jù)：①

能和水混溶；②

用量少；③

生物物質(zhì)活性的損失少；④最好無(wú)毒性。

?常用溶劑：糖類、氨基酸、核苷酸——最常用的是乙醇核酸——常用的有乙醇、異丙酮、α-二氧基乙醇蛋白質(zhì)、酶——乙醇、甲醇、丙酮5.3.2有機(jī)溶劑的選擇選擇依據(jù)：395.3.3有機(jī)溶劑沉淀的影響因素

（1）溫度溫度↓→

→采用低溫沉淀

（2）pH

?接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需的有機(jī)溶劑濃度較少，利于提高沉淀效果。?選擇適宜的pH可提高分離的分辨能力，利于提高分離效果。

5.3.3有機(jī)溶劑沉淀的影響因素（1）溫度溫度↓→→采40（3）樣品濃度

濃度高時(shí)→

濃度低時(shí)→

（3）樣品濃度濃度高時(shí)→濃度低時(shí)→41（4）金屬離子的影響

某些高價(jià)陽(yáng)離子的存在→生物物質(zhì)的溶解度↓→沉淀效果↑如：Zn2+和Ca2+在一定pH值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使溶解度大大下降。0.005M至0.02M的Zn2+可以使原來(lái)沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑用量減少1/3至1/2。高價(jià)陽(yáng)離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀→蛋白質(zhì)分離提純效果↓

所以使用高價(jià)陽(yáng)離子時(shí)需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等雜質(zhì)，以免產(chǎn)生共沉作用。（4）金屬離子的影響某些高價(jià)陽(yáng)離子的存在→生物物質(zhì)的溶解度42（5）離子強(qiáng)度的影響

中性鹽濃度較高時(shí)（0.2mol/L以上），會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度，使有機(jī)溶劑的用量增大。因而鹽濃度太高時(shí)，需要采用透析等方法使鹽含量降低。對(duì)于蛋白質(zhì)和多糖，離子強(qiáng)度為0.01-0.05mol/L比較合適，少量鹽的存在還對(duì)蛋白質(zhì)的活性有保護(hù)作用。

（5）離子強(qiáng)度的影響中性鹽濃度較高時(shí)（0.2mol/L以435.4非離子多聚物沉淀法

——最早用于提純免疫球蛋白5.4.1原理沉淀作用是多聚物與大分子發(fā)生共沉作用的結(jié)果。與有機(jī)溶劑相似，使大分子的水化度降低，促使大分子沉淀。多聚物與大分子之間以氫鍵相結(jié)合形成復(fù)合物。5.4非離子多聚物沉淀法

——最早445.4.2常用非離子多聚物聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯乙烯化氧（NPEO）、右旋糖酐硫酸鈉等。PEG—親水性強(qiáng)、無(wú)毒、不可燃性，且對(duì)蛋白質(zhì)活性有保護(hù)作用，是應(yīng)用最廣的非離子聚合物沉淀劑。5.4.2常用非離子多聚物聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯455.4.3影響PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀劑濃度，蛋白質(zhì)溶解度與PEG濃度之間的關(guān)系類似于鹽析作用：lgS=lgS0-Ks[PEG]（2）離子濃度：在固定pH值下，鹽濃度越高，PEG用量越少。（3）pH：在pI時(shí)，PEG用量最小。（4）PEG分子量：在一定范圍內(nèi)，高分子量PEG沉淀的效果較好，但粘度高，操作與分離困難。4000左右最為常用。5.4.3影響PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀劑濃度，蛋白465.4.4PEG沉淀法特點(diǎn)（1）操作條件溫和，變性失活少。（2）具有極高的沉淀效果，用量較少，PEG濃度一般為10%左右。（3）產(chǎn)物顆粒大，容易收集。5.4.4PEG沉淀法特點(diǎn)（1）操作條件溫和，變性失活少。475.5其他沉淀法等電點(diǎn)沉淀法生成鹽類復(fù)合物沉淀法選擇變性沉淀法5.5其他沉淀法等電點(diǎn)沉淀法485.5.1等電點(diǎn)沉淀法兩性物質(zhì)—氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、酶、核酸等。等電點(diǎn)沉淀法主要是利用兩性物質(zhì)分子在電中性時(shí)的溶解度最低，而各種兩性物質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)而進(jìn)行分離的一種方法。

pH=pI5.5.1等電點(diǎn)沉淀法兩性物質(zhì)—氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、酶495.5.1等電點(diǎn)沉淀法（1）等電點(diǎn)法的優(yōu)點(diǎn)是，使用的試劑是酸堿，易中和除去，無(wú)毒性，適應(yīng)于食品類生物物質(zhì)的處理。缺點(diǎn)是在酸性條件下易使蛋白質(zhì)失活。（2）等電點(diǎn)法較適合于在水中溶解度較低（或憎水性較強(qiáng)）的兩性物質(zhì)。如谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪蛋白等；對(duì)一些親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，如明膠等則不適應(yīng)。（3）單獨(dú)使用等電點(diǎn)法時(shí)提取率較低，為了提高提取率，等電點(diǎn)法常和鹽析法、有機(jī)溶劑法等其它方法一起使用。5.5.1等電點(diǎn)沉淀法（1）等電點(diǎn)法的優(yōu)點(diǎn)是，使用的試劑是505.5.2生成鹽類復(fù)合物沉淀法按使用鹽類不同，分為兩類：與酸性功能團(tuán)作用的金屬離子沉淀法與堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)酸沉淀法特點(diǎn)：（1）鹽類復(fù)合物溶解度低，極易沉淀析出，但共沉作用明顯；（2）要考慮金屬離子或酸根離子的除去問(wèn)題；（3）要防止目的產(chǎn)物發(fā)生不可逆沉淀。5.5.2生成鹽類復(fù)合物沉淀法按使用鹽類不同，分為兩類：515.5.2.1金屬離子沉淀法在堿性溶液中，許多生物物質(zhì)都能與金屬離子形成沉淀，按其作用基團(tuán)不同分為三類：（1）與羧酸、胺、雜環(huán)化合物結(jié)合—Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+。（2）與羧酸結(jié)合，但不與含N化合物結(jié)合—Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+。（3）與巰基相結(jié)合—Ag+、Hg2+、Pb2+。5.5.2.1金屬離子沉淀法在堿性溶液中，許多生物物質(zhì)都能525.5.2.1金屬離子沉淀法常用金屬離子：Zn2+—肽、蛋白質(zhì)；Ca2+—有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、核酸；Ba2+—蛋白質(zhì)Mg2+—DNA及其它核酸5.5.2.1金屬離子沉淀法常用金屬離子：535.5.2.2有機(jī)酸沉淀法常用有機(jī)酸—苦味酸、苦酮酸、鞣酸、三氯乙酸（1）有機(jī)酸與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，易發(fā)生不可逆沉淀。用此法制備蛋白質(zhì)時(shí)，一般需加入穩(wěn)定劑，且條件要溫和。（2）有機(jī)酸根離子的除去：先加無(wú)機(jī)酸替換，后用乙醚萃取。5.5.2.2有機(jī)酸沉淀法常用有機(jī)酸—苦味酸、苦酮酸、鞣酸545.5.3選擇變性沉淀法—多用于去除雜蛋白，常用方法有：表面活性劑法有機(jī)溶劑法加熱變性法選擇性酸堿變性法5.5.3選擇變性沉淀法—多用于去除雜蛋白，常用方法有：55練習(xí)題某蛋白質(zhì)混合物A、B、C，已知蛋白A的等電點(diǎn)為8.3，蛋白B的等電點(diǎn)為4.8，蛋白C的等電點(diǎn)為4.6。用硫酸銨鹽析（在各自等電點(diǎn)pH值下）時(shí)，開(kāi)始析出時(shí)的硫酸銨飽和度，蛋白A為54%，蛋白B為32%，蛋白C為55%。試設(shè)計(jì)用硫酸銨分段鹽析法分離蛋白質(zhì)混合物A、B、C的工藝路線。練習(xí)題某蛋白質(zhì)混合物A、B、C，已知蛋白A的等電點(diǎn)為8.3，56生物分離過(guò)程的一般流程生物分離過(guò)程的一般流程57第五章沉淀分離5.1概述5.2鹽析法5.3有機(jī)溶劑沉淀法5.4非離子多聚物沉淀法5.5其他沉淀法第五章沉淀分離585.1概述沉淀的概念沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相的過(guò)程。在生物工業(yè)、有機(jī)化工工業(yè)、無(wú)機(jī)化工工業(yè)及實(shí)驗(yàn)室分析中，沉淀都是分離與純化中最常用的方法之一。沉淀：溶質(zhì)→固相5.1概述沉淀的概念595.1概述沉淀的作用有二：

一是濃縮，通過(guò)沉淀目的產(chǎn)物由液相變成固相，濃縮倍數(shù)可達(dá)幾十倍至數(shù)百倍；

二是純化，通過(guò)沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的產(chǎn)物是固相）或沉積在固相中（目的產(chǎn)物留在液相）的雜質(zhì)。

5.1概述沉淀的作用有二：60沉淀法操作步驟：①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；③離心或過(guò)濾，收集沉淀物。

加沉淀劑的方式和陳化條件對(duì)產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。沉淀法操作步驟：615.1概述沉淀分離的應(yīng)用沉淀分離具有成本低、收率高、濃縮倍數(shù)大和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于氨基酸、酶制劑、抗菌素等生物工業(yè)中。對(duì)于某些不需純度要求的生物產(chǎn)品（如工業(yè)用酶制劑），沉淀分離是一種常用提取方法。但對(duì)于某些純度要求很高的生物產(chǎn)品，在沉淀分離中，濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀分離通常作為初步分離的一種方法。

5.1概述沉淀分離的應(yīng)用625.1概述沉淀劑的選擇沉淀劑的作用是降低溶質(zhì)的溶解度使之析出，除考慮沉淀效果外還需考慮下列因素：（1）沉淀劑對(duì)目的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與活性是否有破壞作用；（2）沉淀劑是否容易除去（離子交換、蒸發(fā)、萃取等）；（3）沉淀劑是否有毒性。5.1概述沉淀劑的選擇635.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同，生物工業(yè)中常用的沉淀方法有如下幾種：①鹽析法：多用于蛋白質(zhì)和酶的分離純化。

②有機(jī)溶劑法：多用于生物小分子、多糖及核酸類產(chǎn)品的分離與純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)和酶的沉淀。

③等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。5.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同645.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是發(fā)展很快的一種方法。⑤生成鹽類復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物（其中主要是酸性或堿性化合物），其中小分子物質(zhì)的沉淀應(yīng)用較多。⑥選擇變性沉淀法：熱變性或酸堿變性沉淀法，常用于除去某些不耐熱及在一定pH值下易變性的雜蛋白。但應(yīng)以在實(shí)驗(yàn)條件下所分離物質(zhì)的活性不受影響為前提。5.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生655.2鹽析法一般說(shuō)來(lái)，所有固性溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程稱為鹽析。鹽析法具有如下特點(diǎn)：

（1）成本低，不需要什么特別昂貴的設(shè)備；（2）操作簡(jiǎn)單、安全；（3）對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用；（4）存在產(chǎn)品與雜質(zhì)的共沉作用，因而它只能作為初步純化。5.2鹽析法一般說(shuō)來(lái)，所有固性溶質(zhì)都可以在665.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理蛋白分子的表面同時(shí)含有帶電荷的親水基團(tuán)和不帶電荷的疏水基團(tuán)。蛋白質(zhì)的溶解度差別——取決于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)的比例和這些基團(tuán)的排列位置。

5.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理675.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：在水溶液中，蛋白質(zhì)分子中的親水基團(tuán)吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合作用。這些水分子在蛋白質(zhì)分子的表面形成一層水化膜。由于水膜的存在，各蛋白質(zhì)分子間彼此隔開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子在水中呈溶解狀態(tài)。

5.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：685.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶，這是因?yàn)楫?dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入少量中性鹽時(shí)，中性鹽離子對(duì)蛋白質(zhì)分子表面親水基團(tuán)（及水活度）的影響，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用力，從而使蛋白質(zhì)的溶解度增大。蛋白質(zhì)溶液少量中性鹽

增加蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用→蛋白質(zhì)溶解度↑5.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白695.2.1.1鹽析原理蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)中性鹽濃度增加至一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和（親水基團(tuán)被大量中性鹽離子所包圍），水分子離開(kāi)蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。

（3）鹽析作用（Salting-out)：

加入大量中性鹽↓

蛋白質(zhì)溶液→親水基團(tuán)被中性鹽包圍→疏水基團(tuán)的相互作用→蛋白質(zhì)相互聚集（溶解度下降）

5.2.1.1鹽析原理蛋白質(zhì)在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因?yàn)楫?dāng)70lgS（溶解度）I（離子強(qiáng)度）

鹽溶鹽析β

圖5-1溶液離子強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系lgS（溶解度）I（離子強(qiáng)度）鹽溶鹽析β圖5-1溶715.2.1.2Cohn方程式蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度的關(guān)系可由Cohn經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)表示：（5-1）其中：（5-2）式中：S—蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）

I—離子強(qiáng)度

mi—i離子的摩爾濃度（mol/L）

Zi—i離子所帶的電荷數(shù)（即離子的價(jià)數(shù)）

β—鹽析常數(shù)，與鹽的種類無(wú)關(guān)

KS—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無(wú)關(guān)5.2.1.2Cohn方程式蛋白質(zhì)鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度72關(guān)于β值：（1）β值與鹽的種類無(wú)關(guān)，在式（5-1）中，令I(lǐng)=0，則：

β=lg

S0（5-3）

S0表示在純?nèi)軇┲校碔=0）蛋白質(zhì)的溶解度，由此可見(jiàn)β是一個(gè)與鹽的種類無(wú)關(guān)的常數(shù)。β值的大小主要決定于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。（2）β值不可能直接測(cè)定

β值是假定離子強(qiáng)度I=0時(shí)，用外推法求出的。事實(shí)上由于鹽溶作用的存在，I=0時(shí)的溶解度比低鹽溶液要低。（3）β值隨溫度和pH而變

關(guān)于β值：73關(guān)于KS——主要取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，而與溫度和pH無(wú)關(guān)。（1）KS與蛋白質(zhì)種類的關(guān)系對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，KS值的變化不是很大，大多不超過(guò)1倍。一般地：組成相同的蛋白質(zhì)，分子量越大，KS較大，沉淀所需用鹽量越少；蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱性越大，KS值較大，越容易沉淀。如表5-2所示為采用硫酸銨鹽析時(shí)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)。表5-2硫酸銨對(duì)不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)

蛋白質(zhì)馬血紅蛋白馬肌紅蛋白卵青蛋白纖維蛋白原

KS0.710.941.221.46關(guān)于KS——主要取決于蛋白質(zhì)和鹽的種類，而與溫度和pH無(wú)關(guān)。74（2）KS與鹽種類的關(guān)系不同種類的鹽，對(duì)KS的影響較大。KS值較大，就意味著該鹽的鹽析效果好，其中陰離子的影響較顯著，而陽(yáng)離子的影響是第二位的。對(duì)于陰離子，含高價(jià)陰離子的鹽，效果比低價(jià)的好。常用陰離子的鹽析效果排列如下：檸檬酸鹽＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-對(duì)于陽(yáng)離子，一般地高價(jià)陽(yáng)離子（如Mg2+、Ca2+）不如低價(jià)陽(yáng)離子，常用一價(jià)陽(yáng)離子的鹽析效果排列如下：

NH4+＞K+＞Na+而常用鹽析劑鹽析效果的排列順序?yàn)椋?/p>

NaH2PO4＞(NH4)2SO4＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl（2）KS與鹽種類的關(guān)系75表5-1不同鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的KS值和β值

用不同鹽類采用外推法求β值時(shí)，因溫度和pH等條件不同，β值會(huì)有所變動(dòng)。如表5-1所示，各種鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的β值在3.0左右。鹽種類磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂β3.012.533.092.603.23

KS

1.000.760.710.690.33表5-1不同鹽類對(duì)碳氧血紅蛋白的KS值和β值鹽765.2.1.3分段鹽析法

（1）KS分段鹽析法——改變離子強(qiáng)度對(duì)于蛋白質(zhì)混合物，不同蛋白質(zhì)在不同離子強(qiáng)度下的溶解度不同，發(fā)生鹽析時(shí)所需的離子強(qiáng)度也就不同。根據(jù)這一原理，采用不同離子強(qiáng)度分步鹽析的方法，即可從蛋白質(zhì)混合物中分離各種不同的組份。如：

硫酸銨飽和度開(kāi)始析出的蛋白質(zhì)種類20%纖維蛋白原28~33%血紅蛋白33~35%擬球蛋白50%清蛋白80%肌紅蛋白這種改變離子強(qiáng)度的分段鹽析法稱為KS分段鹽析法，常用于粗蛋白質(zhì)和酶的分段分離。5.2.1.3分段鹽析法（1）KS分段鹽析法——改變離77204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)最適飽和度是30%，55%204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)最適飽和度是30%，785.2.1.3分段鹽析法

（2）β分段鹽析法——改變pH和溫度不同蛋白質(zhì)在不同溫度和pH值下的溶解度不同，因此在一定離子強(qiáng)度下改變混合液pH和溫度亦可實(shí)現(xiàn)分段鹽析的目的。由于這種方法是通過(guò)改β值的大小來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因而叫做β分段鹽析法。此法常用于蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化和結(jié)晶時(shí)使用。

5.2.1.3分段鹽析法（2）β分段鹽析法——改變pH和795.2.2影響鹽析的若干因素

5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系從Cohn式可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時(shí)，發(fā)生鹽析時(shí)需要較高的離子濃度。如用硫酸銨鹽析碳氧肌紅蛋白（COMb）時(shí)：5.2.2影響鹽析的若干因素5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度80蛋白質(zhì)起始濃度COMb開(kāi)始沉淀時(shí)硫酸銨的飽和度90%的COMb沉淀析出時(shí)硫酸銨的飽和度30g/L58%65%3g/L66%73%

由此可見(jiàn)，在不同濃度的蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行鹽析，使用硫酸銨的飽和度是不相同的。

蛋白質(zhì)起始濃度COMb開(kāi)始沉淀時(shí)硫酸銨的飽和度90%的C815.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系

③用于分步分離提純時(shí)，一般采用較稀的蛋白質(zhì)溶液，多加一些中性鹽，使共沉作用減少至最低限度，一般采用的蛋白質(zhì)濃度為2.5~3.0%。

①

蛋白質(zhì)起始濃度高②蛋白質(zhì)起始濃度低5.2.2.1蛋白質(zhì)的濃度與鹽析的關(guān)系③用于分步分離提純825.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響蛋白質(zhì)凈電荷越多→它的溶解度越大→β值(lgS0)就越高。改變?nèi)芤旱膒H→即可改變蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷的數(shù)量→從而改變?chǔ)轮档拇笮　．?dāng)pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）時(shí)，蛋白質(zhì)分子上的凈電荷數(shù)為零，溶解度最小，β值最低。因此在鹽析時(shí)常選擇溶液pH在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。5.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響蛋白質(zhì)凈電荷越多→它的溶解度83pH兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨pH而變化很大；β隨pH變化（1）對(duì)數(shù)關(guān)系（2）等電點(diǎn)附近有極小值βpH兩種蛋白質(zhì)的相對(duì)溶解度會(huì)隨pH而變化很大；β845.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響（1）pH值對(duì)鹽析的影響較大：由于β=lgS0，當(dāng)β值增加1時(shí)，溶解度（S）就增加10倍。對(duì)某些蛋白質(zhì)，在一定鹽濃度下，不同的pH下的β值相差達(dá)3倍以上，也即蛋白質(zhì)溶解度的變化達(dá)1000倍以上。因此，鹽析過(guò)程中pH的控制是非常嚴(yán)格的。（2）關(guān)于pI值：在水中或稀鹽溶液中測(cè)得的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI），與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果不一定相同。因此需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整pH值至蛋白質(zhì)溶解度最低處，才能獲得更好的效果。

5.2.2.2pH對(duì)鹽析的影響（1）pH值對(duì)鹽析的影響較大855.2.2.3溫度對(duì)鹽析的影響

一般說(shuō)來(lái)，溫度升高，溶質(zhì)的溶解度增大。（1）在低鹽溶液或純水中，生物大分子的溶解度大多數(shù)在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增加；（2）在高鹽溶液中，生物大分子的溶解度隨溫度的升高而減少，這是因?yàn)檩^高的溫度會(huì)使蛋白質(zhì)分子失水，因而利于沉淀。（3）盡管較高的溫度有利于鹽析沉淀，但較高溫度易使蛋白質(zhì)變性和發(fā)生共沉作用，因此蛋白質(zhì)鹽析過(guò)程通常在室溫下進(jìn)行（25℃左右），對(duì)某些溫度比較敏感的酶，則需要在低溫下（0~4℃）操作。

5.2.2.3溫度對(duì)鹽析的影響一般說(shuō)來(lái)，溫度升高，溶質(zhì)的86第五章-沉淀分離分析課件875.2.3硫酸銨鹽析法

常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉和硫氰化鉀等。硫酸銨：溶解度大，但緩沖能力弱，此外因含有NH4+，對(duì)蛋白質(zhì)的分析會(huì)帶來(lái)一定影響。硫酸鈉：不含氮，不影響蛋白質(zhì)的定量測(cè)定；但溶解度較低，一般要在30℃以上操作效果較好。5.2.3硫酸銨鹽析法常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂885.2.3硫酸銨鹽析法

表5-3不同溫度下硫酸銨和硫酸鈉的溶解度溫度（℃）

010202530硫酸銨

(g/kg水)706.96730.73757.16769.05780.95(mol/kg水)5.355.535.735.825.91硫酸鈉

（g/L）13.818.424.828.232.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.2305.2.3硫酸銨鹽析法表5-3不同溫度下硫酸銨和89硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況；它可防止局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，袋內(nèi)飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結(jié)晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：905.2.3.1硫酸銨的預(yù)處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：（1）重結(jié)晶；（2）H2S處理—除重金屬（對(duì)巰基敏感）pH調(diào)整：（1）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI<5.0時(shí)，用硫酸或磷酸（2）當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI>5.0時(shí)，用氨水5.2.3.1硫酸銨的預(yù)處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：915.2.3.2硫酸銨飽和度的調(diào)整（分段鹽析）（1）加入固體鹽法：適合于飽和度較高的場(chǎng)合。每升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨的克數(shù)可用下式計(jì)算：（2）加入飽和溶液法：適合于飽和度不高的場(chǎng)合。V1升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨飽和溶液的體積為：5.2.3.2硫酸銨飽和度的調(diào)整（分段鹽析）（1）加入固925.3有機(jī)溶劑沉淀法

5.3.1有機(jī)溶劑法沉淀原理

一般水溶液加入有機(jī)溶劑水溶液的介電常數(shù)↓→溶質(zhì)分子（蛋白質(zhì)）之間靜電引力↑→溶質(zhì)的溶解度↓。對(duì)于具有表面水化層的生物大分子：生物大分子溶液有機(jī)溶劑與水作用表面水化層被壓縮→生物大分子脫水→聚集析出。5.3有機(jī)溶劑沉淀法5.3.1有機(jī)溶劑法沉淀原理93有機(jī)溶劑沉淀法具有如下特點(diǎn)：①不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑濃度不同，這是有機(jī)溶劑分步沉淀的基礎(chǔ)。其分辨能力比鹽析法高。②溶劑容易蒸發(fā)除去，因此適合于制備食品用蛋白質(zhì)。③有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，過(guò)濾和離心分離都較容易。④容易使某些生物大分子變性失活。⑤有機(jī)溶劑易燃易爆，操作常需在低溫下進(jìn)行。

有機(jī)溶劑沉淀法具有如下特點(diǎn)：①不同溶質(zhì)的沉淀所要求的有機(jī)溶劑945.3.2有機(jī)溶劑的選擇

選擇依據(jù)：①

能和水混溶；②

用量少；③

生物物質(zhì)活性的損失少；④最好無(wú)毒性。

?常用溶劑：糖類、氨基酸、核苷酸——最常用的是乙醇核酸——常用的有乙醇、異丙酮、α-二氧基乙醇蛋白質(zhì)、酶——乙醇、甲醇、丙酮5.3.2有機(jī)溶劑的選擇選擇依據(jù)：955.3.3有機(jī)溶劑沉淀的影響因素

（1）溫度溫度↓→

→采用低溫沉淀

（2）pH

?接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需的有機(jī)溶劑濃度較少，利于提高沉淀效果。?選擇適宜的pH可提高分離的分辨能力，利于提高分離效果。

5.3.3有機(jī)溶劑沉淀的影響因素（1）溫度溫度↓→→采96（3）樣品濃度

濃度高時(shí)→

濃度低時(shí)→

（3）樣品濃度濃度高時(shí)→濃度低時(shí)→97（4）金屬離子的影響

某些高價(jià)陽(yáng)離子的存在→生物物質(zhì)的溶解度↓→沉淀效果↑如：Zn2+和Ca2+在一定pH值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使溶解度大大下降。0.005M至0.02M的Zn2+可以使原來(lái)沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑用量減少1/3至1/2。高價(jià)陽(yáng)離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀→蛋白質(zhì)分離提純效果↓

所以使用高價(jià)陽(yáng)離子時(shí)需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等雜質(zhì)，以免產(chǎn)生共沉作用。（4）金屬離子的影響某些高價(jià)陽(yáng)離子的存在→生物物質(zhì)的溶解度98（5）離子強(qiáng)度的影響

中性鹽濃度較高時(shí)（0.2mol/L以上），會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度，使有機(jī)溶劑的用量增大。因而鹽濃度太高時(shí)，需要采用透析等方法使鹽含量降低。對(duì)于蛋白質(zhì)和多糖，離子強(qiáng)度為0.01-0.05mol/L比較合適，少量鹽的存在還