第五章-沉淀分離分析課件

生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程1第五章沉淀分離5.1概述5.2鹽析法5.3有機溶劑沉淀法5.4非離子多聚物沉淀法5.5其他沉淀法第五章沉淀分離25.1概述沉淀的概念沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相的過程。在生物工業(yè)、有機化工工業(yè)、無機化工工業(yè)及實驗室分析中，沉淀都是分離與純化中最常用的方法之一。沉淀：溶質→固相5.1概述沉淀的概念35.1概述沉淀的作用有二：

一是濃縮，通過沉淀目的產(chǎn)物由液相變成固相，濃縮倍數(shù)可達幾十倍至數(shù)百倍；

二是純化，通過沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的產(chǎn)物是固相）或沉積在固相中（目的產(chǎn)物留在液相）的雜質。

5.1概述沉淀的作用有二：4沉淀法操作步驟：①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進粒子生長；③離心或過濾，收集沉淀物。

加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。沉淀法操作步驟：55.1概述沉淀分離的應用沉淀分離具有成本低、收率高、濃縮倍數(shù)大和操作簡單等優(yōu)點，因而廣泛應用于氨基酸、酶制劑、抗菌素等生物工業(yè)中。對于某些不需純度要求的生物產(chǎn)品（如工業(yè)用酶制劑），沉淀分離是一種常用提取方法。但對于某些純度要求很高的生物產(chǎn)品，在沉淀分離中，濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀分離通常作為初步分離的一種方法。

5.1概述沉淀分離的應用65.1概述沉淀劑的選擇沉淀劑的作用是降低溶質的溶解度使之析出，除考慮沉淀效果外還需考慮下列因素：（1）沉淀劑對目的產(chǎn)物的結構與活性是否有破壞作用；（2）沉淀劑是否容易除去（離子交換、蒸發(fā)、萃取等）；（3）沉淀劑是否有毒性。5.1概述沉淀劑的選擇75.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同，生物工業(yè)中常用的沉淀方法有如下幾種：①鹽析法：多用于蛋白質和酶的分離純化。

②有機溶劑法：多用于生物小分子、多糖及核酸類產(chǎn)品的分離與純化，有時也用于蛋白質和酶的沉淀。

③等電點沉淀法：用于氨基酸、蛋白質等兩性物質的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。5.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同85.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是發(fā)展很快的一種方法。⑤生成鹽類復合物沉淀法：用于多種化合物（其中主要是酸性或堿性化合物），其中小分子物質的沉淀應用較多。⑥選擇變性沉淀法：熱變性或酸堿變性沉淀法，常用于除去某些不耐熱及在一定pH值下易變性的雜蛋白。但應以在實驗條件下所分離物質的活性不受影響為前提。5.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生95.2鹽析法一般說來，所有固性溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程稱為鹽析。鹽析法具有如下特點：

（1）成本低，不需要什么特別昂貴的設備；（2）操作簡單、安全；（3）對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用；（4）存在產(chǎn)品與雜質的共沉作用，因而它只能作為初步純化。5.2鹽析法一般說來，所有固性溶質都可以在105.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理蛋白分子的表面同時含有帶電荷的親水基團和不帶電荷的疏水基團。蛋白質的溶解度差別——取決于蛋白質分子中極性基團與非極性基團的比例和這些基團的排列位置。

5.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理115.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：在水溶液中，蛋白質分子中的親水基團吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合作用。這些水分子在蛋白質分子的表面形成一層水化膜。由于水膜的存在，各蛋白質分子間彼此隔開，使蛋白質分子在水中呈溶解狀態(tài)。

5.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：125.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白質在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶，這是因為當向蛋白質溶液中加入少量中性鹽時，中性鹽離子對蛋白質分子表面親水基團（及水活度）的影響，增強了蛋白質分子與水分子的相互作用力，從而使蛋白質的溶解度增大。蛋白質溶液少量中性鹽

增加蛋白質分子與水分子的相互作用→蛋白質溶解度↑5.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白135.2.1.1鹽析原理蛋白質在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因為當中性鹽濃度增加至一定程度時，蛋白質表面電荷被大量中和（親水基團被大量中性鹽離子所包圍），水分子離開蛋白質的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質分子相互聚集而沉淀。

（3）鹽析作用（Salting-out)：

加入大量中性鹽↓

蛋白質溶液→親水基團被中性鹽包圍→疏水基團的相互作用→蛋白質相互聚集（溶解度下降）

5.2.1.1鹽析原理蛋白質在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因為當14lgS（溶解度）I（離子強度）

鹽溶鹽析β

圖5-1溶液離子強度與蛋白質濃度的關系lgS（溶解度）I（離子強度）鹽溶鹽析β圖5-1溶155.2.1.2Cohn方程式蛋白質鹽析時，蛋白質的溶解度與鹽濃度的關系可由Cohn經(jīng)驗公式來表示：（5-1）其中：（5-2）式中：S—蛋白質的溶解度（g/L）

I—離子強度

mi—i離子的摩爾濃度（mol/L）

Zi—i離子所帶的電荷數(shù)（即離子的價數(shù)）

β—鹽析常數(shù)，與鹽的種類無關

KS—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無關5.2.1.2Cohn方程式蛋白質鹽析時，蛋白質的溶解度16關于β值：（1）β值與鹽的種類無關，在式（5-1）中，令I=0，則：

β=lg

S0（5-3）

S0表示在純溶劑中（即I=0）蛋白質的溶解度，由此可見β是一個與鹽的種類無關的常數(shù)。β值的大小主要決定于蛋白質的性質。（2）β值不可能直接測定

β值是假定離子強度I=0時，用外推法求出的。事實上由于鹽溶作用的存在，I=0時的溶解度比低鹽溶液要低。（3）β值隨溫度和pH而變

關于β值：17關于KS——主要取決于蛋白質和鹽的種類，而與溫度和pH無關。（1）KS與蛋白質種類的關系對于不同的蛋白質，KS值的變化不是很大，大多不超過1倍。一般地：組成相同的蛋白質，分子量越大，KS較大，沉淀所需用鹽量越少；蛋白質分子不對稱性越大，KS值較大，越容易沉淀。如表5-2所示為采用硫酸銨鹽析時不同蛋白質的鹽析常數(shù)。表5-2硫酸銨對不同蛋白質的鹽析常數(shù)

蛋白質馬血紅蛋白馬肌紅蛋白卵青蛋白纖維蛋白原

KS0.710.941.221.46關于KS——主要取決于蛋白質和鹽的種類，而與溫度和pH無關。18（2）KS與鹽種類的關系不同種類的鹽，對KS的影響較大。KS值較大，就意味著該鹽的鹽析效果好，其中陰離子的影響較顯著，而陽離子的影響是第二位的。對于陰離子，含高價陰離子的鹽，效果比低價的好。常用陰離子的鹽析效果排列如下：檸檬酸鹽＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-對于陽離子，一般地高價陽離子（如Mg2+、Ca2+）不如低價陽離子，常用一價陽離子的鹽析效果排列如下：

NH4+＞K+＞Na+而常用鹽析劑鹽析效果的排列順序為：

NaH2PO4＞(NH4)2SO4＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl（2）KS與鹽種類的關系19表5-1不同鹽類對碳氧血紅蛋白的KS值和β值

用不同鹽類采用外推法求β值時，因溫度和pH等條件不同，β值會有所變動。如表5-1所示，各種鹽類對碳氧血紅蛋白的β值在3.0左右。鹽種類磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂β3.012.533.092.603.23

KS

1.000.760.710.690.33表5-1不同鹽類對碳氧血紅蛋白的KS值和β值鹽205.2.1.3分段鹽析法

（1）KS分段鹽析法——改變離子強度對于蛋白質混合物，不同蛋白質在不同離子強度下的溶解度不同，發(fā)生鹽析時所需的離子強度也就不同。根據(jù)這一原理，采用不同離子強度分步鹽析的方法，即可從蛋白質混合物中分離各種不同的組份。如：

硫酸銨飽和度開始析出的蛋白質種類20%纖維蛋白原28~33%血紅蛋白33~35%擬球蛋白50%清蛋白80%肌紅蛋白這種改變離子強度的分段鹽析法稱為KS分段鹽析法，常用于粗蛋白質和酶的分段分離。5.2.1.3分段鹽析法（1）KS分段鹽析法——改變離21204060800100總蛋白目標蛋白質最適飽和度是30%，55%204060800100總蛋白目標蛋白質最適飽和度是30%，225.2.1.3分段鹽析法

（2）β分段鹽析法——改變pH和溫度不同蛋白質在不同溫度和pH值下的溶解度不同，因此在一定離子強度下改變混合液pH和溫度亦可實現(xiàn)分段鹽析的目的。由于這種方法是通過改β值的大小來實現(xiàn)的，因而叫做β分段鹽析法。此法常用于蛋白質的進一步純化和結晶時使用。

5.2.1.3分段鹽析法（2）β分段鹽析法——改變pH和235.2.2影響鹽析的若干因素

5.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系從Cohn式可知，當?shù)鞍踪|濃度較低時，發(fā)生鹽析時需要較高的離子濃度。如用硫酸銨鹽析碳氧肌紅蛋白（COMb）時：5.2.2影響鹽析的若干因素5.2.2.1蛋白質的濃度24蛋白質起始濃度COMb開始沉淀時硫酸銨的飽和度90%的COMb沉淀析出時硫酸銨的飽和度30g/L58%65%3g/L66%73%

由此可見，在不同濃度的蛋白質溶液中進行鹽析，使用硫酸銨的飽和度是不相同的。

蛋白質起始濃度COMb開始沉淀時硫酸銨的飽和度90%的C255.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系

③用于分步分離提純時，一般采用較稀的蛋白質溶液，多加一些中性鹽，使共沉作用減少至最低限度，一般采用的蛋白質濃度為2.5~3.0%。

①

蛋白質起始濃度高②蛋白質起始濃度低5.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系③用于分步分離提純265.2.2.2pH對鹽析的影響蛋白質凈電荷越多→它的溶解度越大→β值(lgS0)就越高。改變溶液的pH→即可改變蛋白質分子所帶凈電荷的數(shù)量→從而改變β值的大小。當pH值為蛋白質的等電點（pI）時，蛋白質分子上的凈電荷數(shù)為零，溶解度最小，β值最低。因此在鹽析時常選擇溶液pH在該蛋白質的等電點附近。5.2.2.2pH對鹽析的影響蛋白質凈電荷越多→它的溶解度27pH兩種蛋白質的相對溶解度會隨pH而變化很大；β隨pH變化（1）對數(shù)關系（2）等電點附近有極小值βpH兩種蛋白質的相對溶解度會隨pH而變化很大；β285.2.2.2pH對鹽析的影響（1）pH值對鹽析的影響較大：由于β=lgS0，當β值增加1時，溶解度（S）就增加10倍。對某些蛋白質，在一定鹽濃度下，不同的pH下的β值相差達3倍以上，也即蛋白質溶解度的變化達1000倍以上。因此，鹽析過程中pH的控制是非常嚴格的。（2）關于pI值：在水中或稀鹽溶液中測得的蛋白質等電點（pI），與高鹽濃度下所測的結果不一定相同。因此需根據(jù)實際情況調整pH值至蛋白質溶解度最低處，才能獲得更好的效果。

5.2.2.2pH對鹽析的影響（1）pH值對鹽析的影響較大295.2.2.3溫度對鹽析的影響

一般說來，溫度升高，溶質的溶解度增大。（1）在低鹽溶液或純水中，生物大分子的溶解度大多數(shù)在一定范圍內隨溫度的升高而增加；（2）在高鹽溶液中，生物大分子的溶解度隨溫度的升高而減少，這是因為較高的溫度會使蛋白質分子失水，因而利于沉淀。（3）盡管較高的溫度有利于鹽析沉淀，但較高溫度易使蛋白質變性和發(fā)生共沉作用，因此蛋白質鹽析過程通常在室溫下進行（25℃左右），對某些溫度比較敏感的酶，則需要在低溫下（0~4℃）操作。

5.2.2.3溫度對鹽析的影響一般說來，溫度升高，溶質的30第五章-沉淀分離分析課件315.2.3硫酸銨鹽析法

常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉和硫氰化鉀等。硫酸銨：溶解度大，但緩沖能力弱，此外因含有NH4+，對蛋白質的分析會帶來一定影響。硫酸鈉：不含氮，不影響蛋白質的定量測定；但溶解度較低，一般要在30℃以上操作效果較好。5.2.3硫酸銨鹽析法常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂325.2.3硫酸銨鹽析法

表5-3不同溫度下硫酸銨和硫酸鈉的溶解度溫度（℃）

010202530硫酸銨

(g/kg水)706.96730.73757.16769.05780.95(mol/kg水)5.355.535.735.825.91硫酸鈉

（g/L）13.818.424.828.232.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.2305.2.3硫酸銨鹽析法表5-3不同溫度下硫酸銨和33硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：345.2.3.1硫酸銨的預處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：（1）重結晶；（2）H2S處理—除重金屬（對巰基敏感）pH調整：（1）當?shù)鞍踪|的pI<5.0時，用硫酸或磷酸（2）當?shù)鞍踪|的pI>5.0時，用氨水5.2.3.1硫酸銨的預處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：355.2.3.2硫酸銨飽和度的調整（分段鹽析）（1）加入固體鹽法：適合于飽和度較高的場合。每升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨的克數(shù)可用下式計算：（2）加入飽和溶液法：適合于飽和度不高的場合。V1升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨飽和溶液的體積為：5.2.3.2硫酸銨飽和度的調整（分段鹽析）（1）加入固365.3有機溶劑沉淀法

5.3.1有機溶劑法沉淀原理

一般水溶液加入有機溶劑水溶液的介電常數(shù)↓→溶質分子（蛋白質）之間靜電引力↑→溶質的溶解度↓。對于具有表面水化層的生物大分子：生物大分子溶液有機溶劑與水作用表面水化層被壓縮→生物大分子脫水→聚集析出。5.3有機溶劑沉淀法5.3.1有機溶劑法沉淀原理37有機溶劑沉淀法具有如下特點：①不同溶質的沉淀所要求的有機溶劑濃度不同，這是有機溶劑分步沉淀的基礎。其分辨能力比鹽析法高。②溶劑容易蒸發(fā)除去，因此適合于制備食品用蛋白質。③有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，過濾和離心分離都較容易。④容易使某些生物大分子變性失活。⑤有機溶劑易燃易爆，操作常需在低溫下進行。

有機溶劑沉淀法具有如下特點：①不同溶質的沉淀所要求的有機溶劑385.3.2有機溶劑的選擇

選擇依據(jù)：①

能和水混溶；②

用量少；③

生物物質活性的損失少；④最好無毒性。

?常用溶劑：糖類、氨基酸、核苷酸——最常用的是乙醇核酸——常用的有乙醇、異丙酮、α-二氧基乙醇蛋白質、酶——乙醇、甲醇、丙酮5.3.2有機溶劑的選擇選擇依據(jù)：395.3.3有機溶劑沉淀的影響因素

（1）溫度溫度↓→

→采用低溫沉淀

（2）pH

?接近等電點時，引起沉淀所需的有機溶劑濃度較少，利于提高沉淀效果。?選擇適宜的pH可提高分離的分辨能力，利于提高分離效果。

5.3.3有機溶劑沉淀的影響因素（1）溫度溫度↓→→采40（3）樣品濃度

濃度高時→

濃度低時→

（3）樣品濃度濃度高時→濃度低時→41（4）金屬離子的影響

某些高價陽離子的存在→生物物質的溶解度↓→沉淀效果↑如：Zn2+和Ca2+在一定pH值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質形成復合物，使溶解度大大下降。0.005M至0.02M的Zn2+可以使原來沉淀蛋白質的有機溶劑用量減少1/3至1/2。高價陽離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀→蛋白質分離提純效果↓

所以使用高價陽離子時需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等雜質，以免產(chǎn)生共沉作用。（4）金屬離子的影響某些高價陽離子的存在→生物物質的溶解度42（5）離子強度的影響

中性鹽濃度較高時（0.2mol/L以上），會增加蛋白質或酶在有機溶劑中的溶解度，使有機溶劑的用量增大。因而鹽濃度太高時，需要采用透析等方法使鹽含量降低。對于蛋白質和多糖，離子強度為0.01-0.05mol/L比較合適，少量鹽的存在還對蛋白質的活性有保護作用。

（5）離子強度的影響中性鹽濃度較高時（0.2mol/L以435.4非離子多聚物沉淀法

——最早用于提純免疫球蛋白5.4.1原理沉淀作用是多聚物與大分子發(fā)生共沉作用的結果。與有機溶劑相似，使大分子的水化度降低，促使大分子沉淀。多聚物與大分子之間以氫鍵相結合形成復合物。5.4非離子多聚物沉淀法

——最早445.4.2常用非離子多聚物聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯乙烯化氧（NPEO）、右旋糖酐硫酸鈉等。PEG—親水性強、無毒、不可燃性，且對蛋白質活性有保護作用，是應用最廣的非離子聚合物沉淀劑。5.4.2常用非離子多聚物聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、壬苯455.4.3影響PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀劑濃度，蛋白質溶解度與PEG濃度之間的關系類似于鹽析作用：lgS=lgS0-Ks[PEG]（2）離子濃度：在固定pH值下，鹽濃度越高，PEG用量越少。（3）pH：在pI時，PEG用量最小。（4）PEG分子量：在一定范圍內，高分子量PEG沉淀的效果較好，但粘度高，操作與分離困難。4000左右最為常用。5.4.3影響PEG沉淀法的主要因素（1）沉淀劑濃度，蛋白465.4.4PEG沉淀法特點（1）操作條件溫和，變性失活少。（2）具有極高的沉淀效果，用量較少，PEG濃度一般為10%左右。（3）產(chǎn)物顆粒大，容易收集。5.4.4PEG沉淀法特點（1）操作條件溫和，變性失活少。475.5其他沉淀法等電點沉淀法生成鹽類復合物沉淀法選擇變性沉淀法5.5其他沉淀法等電點沉淀法485.5.1等電點沉淀法兩性物質—氨基酸、核苷酸、蛋白質、酶、核酸等。等電點沉淀法主要是利用兩性物質分子在電中性時的溶解度最低，而各種兩性物質具有不同的等電點而進行分離的一種方法。

pH=pI5.5.1等電點沉淀法兩性物質—氨基酸、核苷酸、蛋白質、酶495.5.1等電點沉淀法（1）等電點法的優(yōu)點是，使用的試劑是酸堿，易中和除去，無毒性，適應于食品類生物物質的處理。缺點是在酸性條件下易使蛋白質失活。（2）等電點法較適合于在水中溶解度較低（或憎水性較強）的兩性物質。如谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪蛋白等；對一些親水性強的蛋白質，如明膠等則不適應。（3）單獨使用等電點法時提取率較低，為了提高提取率，等電點法常和鹽析法、有機溶劑法等其它方法一起使用。5.5.1等電點沉淀法（1）等電點法的優(yōu)點是，使用的試劑是505.5.2生成鹽類復合物沉淀法按使用鹽類不同，分為兩類：與酸性功能團作用的金屬離子沉淀法與堿性功能團作用的有機酸沉淀法特點：（1）鹽類復合物溶解度低，極易沉淀析出，但共沉作用明顯；（2）要考慮金屬離子或酸根離子的除去問題；（3）要防止目的產(chǎn)物發(fā)生不可逆沉淀。5.5.2生成鹽類復合物沉淀法按使用鹽類不同，分為兩類：515.5.2.1金屬離子沉淀法在堿性溶液中，許多生物物質都能與金屬離子形成沉淀，按其作用基團不同分為三類：（1）與羧酸、胺、雜環(huán)化合物結合—Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+。（2）與羧酸結合，但不與含N化合物結合—Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+。（3）與巰基相結合—Ag+、Hg2+、Pb2+。5.5.2.1金屬離子沉淀法在堿性溶液中，許多生物物質都能525.5.2.1金屬離子沉淀法常用金屬離子：Zn2+—肽、蛋白質；Ca2+—有機酸、蛋白質、核酸；Ba2+—蛋白質Mg2+—DNA及其它核酸5.5.2.1金屬離子沉淀法常用金屬離子：535.5.2.2有機酸沉淀法常用有機酸—苦味酸、苦酮酸、鞣酸、三氯乙酸（1）有機酸與蛋白質結合時，易發(fā)生不可逆沉淀。用此法制備蛋白質時，一般需加入穩(wěn)定劑，且條件要溫和。（2）有機酸根離子的除去：先加無機酸替換，后用乙醚萃取。5.5.2.2有機酸沉淀法常用有機酸—苦味酸、苦酮酸、鞣酸545.5.3選擇變性沉淀法—多用于去除雜蛋白，常用方法有：表面活性劑法有機溶劑法加熱變性法選擇性酸堿變性法5.5.3選擇變性沉淀法—多用于去除雜蛋白，常用方法有：55練習題某蛋白質混合物A、B、C，已知蛋白A的等電點為8.3，蛋白B的等電點為4.8，蛋白C的等電點為4.6。用硫酸銨鹽析（在各自等電點pH值下）時，開始析出時的硫酸銨飽和度，蛋白A為54%，蛋白B為32%，蛋白C為55%。試設計用硫酸銨分段鹽析法分離蛋白質混合物A、B、C的工藝路線。練習題某蛋白質混合物A、B、C，已知蛋白A的等電點為8.3，56生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程57第五章沉淀分離5.1概述5.2鹽析法5.3有機溶劑沉淀法5.4非離子多聚物沉淀法5.5其他沉淀法第五章沉淀分離585.1概述沉淀的概念沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相的過程。在生物工業(yè)、有機化工工業(yè)、無機化工工業(yè)及實驗室分析中，沉淀都是分離與純化中最常用的方法之一。沉淀：溶質→固相5.1概述沉淀的概念595.1概述沉淀的作用有二：

一是濃縮，通過沉淀目的產(chǎn)物由液相變成固相，濃縮倍數(shù)可達幾十倍至數(shù)百倍；

二是純化，通過沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的產(chǎn)物是固相）或沉積在固相中（目的產(chǎn)物留在液相）的雜質。

5.1概述沉淀的作用有二：60沉淀法操作步驟：①首先加入沉淀劑；②沉淀劑的陳化，促進粒子生長；③離心或過濾，收集沉淀物。

加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。沉淀法操作步驟：615.1概述沉淀分離的應用沉淀分離具有成本低、收率高、濃縮倍數(shù)大和操作簡單等優(yōu)點，因而廣泛應用于氨基酸、酶制劑、抗菌素等生物工業(yè)中。對于某些不需純度要求的生物產(chǎn)品（如工業(yè)用酶制劑），沉淀分離是一種常用提取方法。但對于某些純度要求很高的生物產(chǎn)品，在沉淀分離中，濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀分離通常作為初步分離的一種方法。

5.1概述沉淀分離的應用625.1概述沉淀劑的選擇沉淀劑的作用是降低溶質的溶解度使之析出，除考慮沉淀效果外還需考慮下列因素：（1）沉淀劑對目的產(chǎn)物的結構與活性是否有破壞作用；（2）沉淀劑是否容易除去（離子交換、蒸發(fā)、萃取等）；（3）沉淀劑是否有毒性。5.1概述沉淀劑的選擇635.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同，生物工業(yè)中常用的沉淀方法有如下幾種：①鹽析法：多用于蛋白質和酶的分離純化。

②有機溶劑法：多用于生物小分子、多糖及核酸類產(chǎn)品的分離與純化，有時也用于蛋白質和酶的沉淀。

③等電點沉淀法：用于氨基酸、蛋白質等兩性物質的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。5.1概述沉淀的分類：沉淀法有許多種，根據(jù)所用沉淀劑的不同645.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生物大分子，是發(fā)展很快的一種方法。⑤生成鹽類復合物沉淀法：用于多種化合物（其中主要是酸性或堿性化合物），其中小分子物質的沉淀應用較多。⑥選擇變性沉淀法：熱變性或酸堿變性沉淀法，常用于除去某些不耐熱及在一定pH值下易變性的雜蛋白。但應以在實驗條件下所分離物質的活性不受影響為前提。5.1概述④非離子型聚合物沉淀法：用于生655.2鹽析法一般說來，所有固性溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程稱為鹽析。鹽析法具有如下特點：

（1）成本低，不需要什么特別昂貴的設備；（2）操作簡單、安全；（3）對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用；（4）存在產(chǎn)品與雜質的共沉作用，因而它只能作為初步純化。5.2鹽析法一般說來，所有固性溶質都可以在665.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理蛋白分子的表面同時含有帶電荷的親水基團和不帶電荷的疏水基團。蛋白質的溶解度差別——取決于蛋白質分子中極性基團與非極性基團的比例和這些基團的排列位置。

5.2.1基本原理5.2.1.1鹽析原理675.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：在水溶液中，蛋白質分子中的親水基團吸聚著許多水分子，這種作用稱為水合作用。這些水分子在蛋白質分子的表面形成一層水化膜。由于水膜的存在，各蛋白質分子間彼此隔開，使蛋白質分子在水中呈溶解狀態(tài)。

5.2.1.1鹽析原理（1）水合作用：685.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白質在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶，這是因為當向蛋白質溶液中加入少量中性鹽時，中性鹽離子對蛋白質分子表面親水基團（及水活度）的影響，增強了蛋白質分子與水分子的相互作用力，從而使蛋白質的溶解度增大。蛋白質溶液少量中性鹽

增加蛋白質分子與水分子的相互作用→蛋白質溶解度↑5.2.1.1鹽析原理（2）鹽溶作用(Salt-in)：蛋白695.2.1.1鹽析原理蛋白質在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因為當中性鹽濃度增加至一定程度時，蛋白質表面電荷被大量中和（親水基團被大量中性鹽離子所包圍），水分子離開蛋白質的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質分子相互聚集而沉淀。

（3）鹽析作用（Salting-out)：

加入大量中性鹽↓

蛋白質溶液→親水基團被中性鹽包圍→疏水基團的相互作用→蛋白質相互聚集（溶解度下降）

5.2.1.1鹽析原理蛋白質在高鹽濃度下發(fā)生鹽析，這是因為當70lgS（溶解度）I（離子強度）

鹽溶鹽析β

圖5-1溶液離子強度與蛋白質濃度的關系lgS（溶解度）I（離子強度）鹽溶鹽析β圖5-1溶715.2.1.2Cohn方程式蛋白質鹽析時，蛋白質的溶解度與鹽濃度的關系可由Cohn經(jīng)驗公式來表示：（5-1）其中：（5-2）式中：S—蛋白質的溶解度（g/L）

I—離子強度

mi—i離子的摩爾濃度（mol/L）

Zi—i離子所帶的電荷數(shù)（即離子的價數(shù)）

β—鹽析常數(shù)，與鹽的種類無關

KS—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無關5.2.1.2Cohn方程式蛋白質鹽析時，蛋白質的溶解度72關于β值：（1）β值與鹽的種類無關，在式（5-1）中，令I=0，則：

β=lg

S0（5-3）

S0表示在純溶劑中（即I=0）蛋白質的溶解度，由此可見β是一個與鹽的種類無關的常數(shù)。β值的大小主要決定于蛋白質的性質。（2）β值不可能直接測定

β值是假定離子強度I=0時，用外推法求出的。事實上由于鹽溶作用的存在，I=0時的溶解度比低鹽溶液要低。（3）β值隨溫度和pH而變

關于β值：73關于KS——主要取決于蛋白質和鹽的種類，而與溫度和pH無關。（1）KS與蛋白質種類的關系對于不同的蛋白質，KS值的變化不是很大，大多不超過1倍。一般地：組成相同的蛋白質，分子量越大，KS較大，沉淀所需用鹽量越少；蛋白質分子不對稱性越大，KS值較大，越容易沉淀。如表5-2所示為采用硫酸銨鹽析時不同蛋白質的鹽析常數(shù)。表5-2硫酸銨對不同蛋白質的鹽析常數(shù)

蛋白質馬血紅蛋白馬肌紅蛋白卵青蛋白纖維蛋白原

KS0.710.941.221.46關于KS——主要取決于蛋白質和鹽的種類，而與溫度和pH無關。74（2）KS與鹽種類的關系不同種類的鹽，對KS的影響較大。KS值較大，就意味著該鹽的鹽析效果好，其中陰離子的影響較顯著，而陽離子的影響是第二位的。對于陰離子，含高價陰離子的鹽，效果比低價的好。常用陰離子的鹽析效果排列如下：檸檬酸鹽＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-對于陽離子，一般地高價陽離子（如Mg2+、Ca2+）不如低價陽離子，常用一價陽離子的鹽析效果排列如下：

NH4+＞K+＞Na+而常用鹽析劑鹽析效果的排列順序為：

NaH2PO4＞(NH4)2SO4＞Na2SO4＞MgSO4＞NaCl（2）KS與鹽種類的關系75表5-1不同鹽類對碳氧血紅蛋白的KS值和β值

用不同鹽類采用外推法求β值時，因溫度和pH等條件不同，β值會有所變動。如表5-1所示，各種鹽類對碳氧血紅蛋白的β值在3.0左右。鹽種類磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂β3.012.533.092.603.23

KS

1.000.760.710.690.33表5-1不同鹽類對碳氧血紅蛋白的KS值和β值鹽765.2.1.3分段鹽析法

（1）KS分段鹽析法——改變離子強度對于蛋白質混合物，不同蛋白質在不同離子強度下的溶解度不同，發(fā)生鹽析時所需的離子強度也就不同。根據(jù)這一原理，采用不同離子強度分步鹽析的方法，即可從蛋白質混合物中分離各種不同的組份。如：

硫酸銨飽和度開始析出的蛋白質種類20%纖維蛋白原28~33%血紅蛋白33~35%擬球蛋白50%清蛋白80%肌紅蛋白這種改變離子強度的分段鹽析法稱為KS分段鹽析法，常用于粗蛋白質和酶的分段分離。5.2.1.3分段鹽析法（1）KS分段鹽析法——改變離77204060800100總蛋白目標蛋白質最適飽和度是30%，55%204060800100總蛋白目標蛋白質最適飽和度是30%，785.2.1.3分段鹽析法

（2）β分段鹽析法——改變pH和溫度不同蛋白質在不同溫度和pH值下的溶解度不同，因此在一定離子強度下改變混合液pH和溫度亦可實現(xiàn)分段鹽析的目的。由于這種方法是通過改β值的大小來實現(xiàn)的，因而叫做β分段鹽析法。此法常用于蛋白質的進一步純化和結晶時使用。

5.2.1.3分段鹽析法（2）β分段鹽析法——改變pH和795.2.2影響鹽析的若干因素

5.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系從Cohn式可知，當?shù)鞍踪|濃度較低時，發(fā)生鹽析時需要較高的離子濃度。如用硫酸銨鹽析碳氧肌紅蛋白（COMb）時：5.2.2影響鹽析的若干因素5.2.2.1蛋白質的濃度80蛋白質起始濃度COMb開始沉淀時硫酸銨的飽和度90%的COMb沉淀析出時硫酸銨的飽和度30g/L58%65%3g/L66%73%

由此可見，在不同濃度的蛋白質溶液中進行鹽析，使用硫酸銨的飽和度是不相同的。

蛋白質起始濃度COMb開始沉淀時硫酸銨的飽和度90%的C815.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系

③用于分步分離提純時，一般采用較稀的蛋白質溶液，多加一些中性鹽，使共沉作用減少至最低限度，一般采用的蛋白質濃度為2.5~3.0%。

①

蛋白質起始濃度高②蛋白質起始濃度低5.2.2.1蛋白質的濃度與鹽析的關系③用于分步分離提純825.2.2.2pH對鹽析的影響蛋白質凈電荷越多→它的溶解度越大→β值(lgS0)就越高。改變溶液的pH→即可改變蛋白質分子所帶凈電荷的數(shù)量→從而改變β值的大小。當pH值為蛋白質的等電點（pI）時，蛋白質分子上的凈電荷數(shù)為零，溶解度最小，β值最低。因此在鹽析時常選擇溶液pH在該蛋白質的等電點附近。5.2.2.2pH對鹽析的影響蛋白質凈電荷越多→它的溶解度83pH兩種蛋白質的相對溶解度會隨pH而變化很大；β隨pH變化（1）對數(shù)關系（2）等電點附近有極小值βpH兩種蛋白質的相對溶解度會隨pH而變化很大；β845.2.2.2pH對鹽析的影響（1）pH值對鹽析的影響較大：由于β=lgS0，當β值增加1時，溶解度（S）就增加10倍。對某些蛋白質，在一定鹽濃度下，不同的pH下的β值相差達3倍以上，也即蛋白質溶解度的變化達1000倍以上。因此，鹽析過程中pH的控制是非常嚴格的。（2）關于pI值：在水中或稀鹽溶液中測得的蛋白質等電點（pI），與高鹽濃度下所測的結果不一定相同。因此需根據(jù)實際情況調整pH值至蛋白質溶解度最低處，才能獲得更好的效果。

5.2.2.2pH對鹽析的影響（1）pH值對鹽析的影響較大855.2.2.3溫度對鹽析的影響

一般說來，溫度升高，溶質的溶解度增大。（1）在低鹽溶液或純水中，生物大分子的溶解度大多數(shù)在一定范圍內隨溫度的升高而增加；（2）在高鹽溶液中，生物大分子的溶解度隨溫度的升高而減少，這是因為較高的溫度會使蛋白質分子失水，因而利于沉淀。（3）盡管較高的溫度有利于鹽析沉淀，但較高溫度易使蛋白質變性和發(fā)生共沉作用，因此蛋白質鹽析過程通常在室溫下進行（25℃左右），對某些溫度比較敏感的酶，則需要在低溫下（0~4℃）操作。

5.2.2.3溫度對鹽析的影響一般說來，溫度升高，溶質的86第五章-沉淀分離分析課件875.2.3硫酸銨鹽析法

常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉和硫氰化鉀等。硫酸銨：溶解度大，但緩沖能力弱，此外因含有NH4+，對蛋白質的分析會帶來一定影響。硫酸鈉：不含氮，不影響蛋白質的定量測定；但溶解度較低，一般要在30℃以上操作效果較好。5.2.3硫酸銨鹽析法常用鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂885.2.3硫酸銨鹽析法

表5-3不同溫度下硫酸銨和硫酸鈉的溶解度溫度（℃）

010202530硫酸銨

(g/kg水)706.96730.73757.16769.05780.95(mol/kg水)5.355.535.735.825.91硫酸鈉

（g/L）13.818.424.828.232.6(mol/L)0.0970.1300.1750.1990.2305.2.3硫酸銨鹽析法表5-3不同溫度下硫酸銨和89硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3）透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。硫酸銨的加入有以下幾種方法：905.2.3.1硫酸銨的預處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：（1）重結晶；（2）H2S處理—除重金屬（對巰基敏感）pH調整：（1）當?shù)鞍踪|的pI<5.0時，用硫酸或磷酸（2）當?shù)鞍踪|的pI>5.0時，用氨水5.2.3.1硫酸銨的預處理重金屬離子的處理（醫(yī)用）：915.2.3.2硫酸銨飽和度的調整（分段鹽析）（1）加入固體鹽法：適合于飽和度較高的場合。每升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨的克數(shù)可用下式計算：（2）加入飽和溶液法：適合于飽和度不高的場合。V1升硫酸銨溶液從飽和度S1增至S2所需加入硫酸銨飽和溶液的體積為：5.2.3.2硫酸銨飽和度的調整（分段鹽析）（1）加入固925.3有機溶劑沉淀法

5.3.1有機溶劑法沉淀原理

一般水溶液加入有機溶劑水溶液的介電常數(shù)↓→溶質分子（蛋白質）之間靜電引力↑→溶質的溶解度↓。對于具有表面水化層的生物大分子：生物大分子溶液有機溶劑與水作用表面水化層被壓縮→生物大分子脫水→聚集析出。5.3有機溶劑沉淀法5.3.1有機溶劑法沉淀原理93有機溶劑沉淀法具有如下特點：①不同溶質的沉淀所要求的有機溶劑濃度不同，這是有機溶劑分步沉淀的基礎。其分辨能力比鹽析法高。②溶劑容易蒸發(fā)除去，因此適合于制備食品用蛋白質。③有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，過濾和離心分離都較容易。④容易使某些生物大分子變性失活。⑤有機溶劑易燃易爆，操作常需在低溫下進行。

有機溶劑沉淀法具有如下特點：①不同溶質的沉淀所要求的有機溶劑945.3.2有機溶劑的選擇

選擇依據(jù)：①

能和水混溶；②

用量少；③

生物物質活性的損失少；④最好無毒性。

?常用溶劑：糖類、氨基酸、核苷酸——最常用的是乙醇核酸——常用的有乙醇、異丙酮、α-二氧基乙醇蛋白質、酶——乙醇、甲醇、丙酮5.3.2有機溶劑的選擇選擇依據(jù)：955.3.3有機溶劑沉淀的影響因素

（1）溫度溫度↓→

→采用低溫沉淀

（2）pH

?接近等電點時，引起沉淀所需的有機溶劑濃度較少，利于提高沉淀效果。?選擇適宜的pH可提高分離的分辨能力，利于提高分離效果。

5.3.3有機溶劑沉淀的影響因素（1）溫度溫度↓→→采96（3）樣品濃度

濃度高時→

濃度低時→

（3）樣品濃度濃度高時→濃度低時→97（4）金屬離子的影響

某些高價陽離子的存在→生物物質的溶解度↓→沉淀效果↑如：Zn2+和Ca2+在一定pH值下與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質形成復合物，使溶解度大大下降。0.005M至0.02M的Zn2+可以使原來沉淀蛋白質的有機溶劑用量減少1/3至1/2。高價陽離子與雜蛋白和弱酸鹽形成沉淀→蛋白質分離提純效果↓

所以使用高價陽離子時需事先除去雜蛋白及磷酸鹽等雜質，以免產(chǎn)生共沉作用。（4）金屬離子的影響某些高價陽離子的存在→生物物質的溶解度98（5）離子強度的影響

中性鹽濃度較高時（0.2mol/L以上），會增加蛋白質或酶在有機溶劑中的溶解度，使有機溶劑的用量增大。因而鹽濃度太高時，需要采用透析等方法使鹽含量降低。對于蛋白質和多糖，離子強度為0.01-0.05mol/L比較合適，少量鹽的存在還