蛋白質(zhì)鹽析課件

一、鹽析

鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程向某些蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機(jī)鹽溶液后，可以降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，是物理變化，可復(fù)原。一、鹽析鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解1

（一）基本原理蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。（一）基本原理2

蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，表面：大部分是親水基團(tuán)內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀3

當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽--鹽析(高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨4H+OH-+++++++++++pH<pI,帶正電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_________pH>pI,帶負(fù)電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+++++____pH=pI時(shí),有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+++++++++++中性鹽破壞水膜_+++++____中性鹽破壞水膜_________中性鹽中和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)沉淀H+OH-+++++++++++pH<pI,帶正電，有水膜，5

蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。通常用離子強(qiáng)度表示對鹽析的影響。蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子61234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5碳氧血紅蛋白的lgS與(NH4)2SO4離子強(qiáng)度μ的關(guān)系S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析鹽溶鹽析區(qū):lgS=β

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Ksμ蛋白質(zhì)溶解度常數(shù)鹽析常數(shù)鹽離子強(qiáng)度蛋白質(zhì)溶解度起始蛋白濃度1234561.02.527

（二）無機(jī)鹽的選擇

在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。(NH4)2SO4原因廉價(jià)在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度對大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無損害（二）無機(jī)鹽的選擇在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有8020406080100中性鹽溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.675.481.088.095.31034.918.948.345.343.342.2--34.544.454.663.670.81.67.854.182.693.8101常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）02040609鹽析效果：陰離子>陽離子尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。常見陰離子的鹽析作用順序：PO43->SO42->CH3COO>Cl>NO3>ClO4>I>SCN陽離子對鹽析效果的影響：Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+鹽析效果：陰離子>陽離子常見陰離子的鹽析作用順序：陽離子10無機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)2SO4粉末—工業(yè)生產(chǎn)

(分批加入，充分?jǐn)嚢?加入(NH4)2SO4飽和溶液—實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)

(防止溶液局部過濃，但加量較多時(shí)溶液會被稀釋)無機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)2SO411

（三）影響鹽析的各種因素

無機(jī)鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度pH操作方式（三）影響鹽析的各種因素?zé)o機(jī)鹽的加入量121.無機(jī)鹽加入量的影響1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析蛋白質(zhì)溶解度1.無機(jī)鹽加入量的影響12345130246810-0.500.50-1.00μ(離子強(qiáng)度)lgS蛋白質(zhì)溶解度0不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系蛋白質(zhì)種類不同，鹽析所用的無機(jī)鹽量也不同024614

對于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時(shí)的無機(jī)鹽濃度范圍都是一定的，即具有一定的蛋白質(zhì)鹽析分布曲線。30lgS蛋白質(zhì)溶解度2030405060702040100P—不同(NH4)2SO4飽和度C0對于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時(shí)的無機(jī)鹽濃度范15蛋白質(zhì)沉淀的速度可用-—

對鹽飽和度（P）作圖來表示：dSdP62030405060704820dSdP–—蛋白質(zhì)溶解度隨(NH4)2SO4飽和度而變化的速率P利用不同蛋白質(zhì)鹽析分布曲線在橫軸上的位置不同，可采取先后加入不同量無機(jī)鹽的辦法來分級沉淀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀的速度可用-—對鹽飽和度（P）作圖來表示：d162.蛋白質(zhì)濃度的影響

蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無機(jī)鹽用量也不同。

隨濃度提高，鹽用量減少。640506070804820dSdP–—P不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線3g/L30g/L分級沉淀：將溶液稀釋，使重疊曲線拉開距離制取成品：提高蛋白質(zhì)濃度2.蛋白質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無機(jī)鹽用量也不173.溫度的影響低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低

溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀。高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫下進(jìn)行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。3.溫度的影響低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高溫度適當(dāng)提高184.pH的影響蛋白質(zhì)在pI時(shí)的溶解度最小，最容易從溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近。耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高4.pH的影響195.操作方式的影響10506070飽和度（%）52.51

酶活性U/ml操作方式對延胡索酸酶鹽析的影響固體，間歇12h飽和溶液，間歇12h飽和溶液，連續(xù)12h飽和溶液，連續(xù)1.6min采用間歇方式所需鹽量比連續(xù)方式少；間歇操作中，用飽和溶液的需鹽量比用固體鹽的高。5.操作方式的影響1050206.鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)：①室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長時(shí)間放置不會失活，且無機(jī)鹽不容易引起蛋白質(zhì)變性失活；②非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀；③適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用④設(shè)備簡單，操作方便。6.鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)：21

（2）缺點(diǎn)：①沉淀物中含有大量鹽析劑②硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上

鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無機(jī)鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。（2）缺點(diǎn)：鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制22

一、鹽析

鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程向某些蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機(jī)鹽溶液后，可以降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出,這種作用叫作鹽析，是物理變化，可復(fù)原。一、鹽析鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解23

（一）基本原理蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)以及溶劑的可利用度。這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強(qiáng)度等參數(shù)的影響。（一）基本原理24

蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，表面：大部分是親水基團(tuán)內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀25

當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽--鹽析(高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時(shí)：低鹽--鹽溶(低鹽情況下，隨26H+OH-+++++++++++pH<pI,帶正電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_________pH>pI,帶負(fù)電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+++++____pH=pI時(shí),有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+++++++++++中性鹽破壞水膜_+++++____中性鹽破壞水膜_________中性鹽中和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析機(jī)制示意圖蛋白質(zhì)沉淀H+OH-+++++++++++pH<pI,帶正電，有水膜，27

蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。通常用離子強(qiáng)度表示對鹽析的影響。蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子281234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5碳氧血紅蛋白的lgS與(NH4)2SO4離子強(qiáng)度μ的關(guān)系S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析鹽溶鹽析區(qū):lgS=β

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Ksμ蛋白質(zhì)溶解度常數(shù)鹽析常數(shù)鹽離子強(qiáng)度蛋白質(zhì)溶解度起始蛋白濃度1234561.02.5229

（二）無機(jī)鹽的選擇

在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。(NH4)2SO4原因廉價(jià)在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度對大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無損害（二）無機(jī)鹽的選擇在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有30020406080100中性鹽溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.675.481.088.095.31034.918.948.345.343.342.2--34.544.454.663.670.81.67.854.182.693.8101常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）020406031鹽析效果：陰離子>陽離子尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。常見陰離子的鹽析作用順序：PO43->SO42->CH3COO>Cl>NO3>ClO4>I>SCN陽離子對鹽析效果的影響：Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+鹽析效果：陰離子>陽離子常見陰離子的鹽析作用順序：陽離子32無機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)2SO4粉末—工業(yè)生產(chǎn)

(分批加入，充分?jǐn)嚢?加入(NH4)2SO4飽和溶液—實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)

(防止溶液局部過濃，但加量較多時(shí)溶液會被稀釋)無機(jī)鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)2SO433

（三）影響鹽析的各種因素

無機(jī)鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度pH操作方式（三）影響鹽析的各種因素?zé)o機(jī)鹽的加入量341.無機(jī)鹽加入量的影響1234561.02.52.00.5-0.5-1.0-1.501.5S0βμ(離子強(qiáng)度)lgS鹽析蛋白質(zhì)溶解度1.無機(jī)鹽加入量的影響12345350246810-0.500.50-1.00μ(離子強(qiáng)度)lgS蛋白質(zhì)溶解度0不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系蛋白質(zhì)種類不同，鹽析所用的無機(jī)鹽量也不同024636

對于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時(shí)的無機(jī)鹽濃度范圍都是一定的，即具有一定的蛋白質(zhì)鹽析分布曲線。30lgS蛋白質(zhì)溶解度2030405060702040100P—不同(NH4)2SO4飽和度C0對于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時(shí)的無機(jī)鹽濃度范37蛋白質(zhì)沉淀的速度可用-—

對鹽飽和度（P）作圖來表示：dSdP62030405060704820dSdP–—蛋白質(zhì)溶解度隨(NH4)2SO4飽和度而變化的速率P利用不同蛋白質(zhì)鹽析分布曲線在橫軸上的位置不同，可采取先后加入不同量無機(jī)鹽的辦法來分級沉淀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀的速度可用-—對鹽飽和度（P）作圖來表示：d382.蛋白質(zhì)濃度的影響

蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無機(jī)鹽用量也不同。

隨濃度提高，鹽用量減少。640506070804820dSdP–—P不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線3g/L30g/L分級沉淀：將溶液稀釋，使重疊曲線拉開距離制取成品：提高蛋