藥品QC微生物實驗室管理課件

藥品QC微生物實驗室管理藥品QC微生物實驗室管理1目錄微生物實驗室質量管理與保障USP微生物檢測技術精要培養(yǎng)基的質量控制和規(guī)范化操作菌種管理（保藏、傳代、分離和鑒定等）藥品微生物檢測分析方法的驗證目錄微生物實驗室質量管理與保障2第一部分微生物實驗室質量管理與保障第一部分微生物實驗室3目錄431概述及法規(guī)要求WHO微生物實驗室管理要求實例質量管理與保障管理2微生物實驗室的風險分析目錄431概述及法規(guī)要求WHO微生物實驗室管理要求實例4無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點藥品微生物的檢驗結果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室規(guī)范要求進行。藥品微生物實驗室管理用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控制及質量保證。無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點藥品微生物的檢驗結果受很5無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點這決定了微生物檢驗質量保證的高要求。

藥品的無菌和微生物限度檢測是指按照一定的檢測程序和質量控制措施，確定要求無菌的樣品中是否存有活的或者不允許存在的微生物

（定性試驗——一次檢出不得復試），或者確定單位（g/ml）樣品中存在微生物的數(shù)量

（定量試驗）無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點這決定了微生物檢驗質量保6相關法規(guī)和指南相關法規(guī)2010年版《中國藥典》一部附錄XVIIIG2010年版《中國藥典》二部附錄XIXQUSP36版<1117>《MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICES》

WHOTechnicalReportSeries,No.961,2011Annex2《WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratories》FDA《藥品質量控制微生物實驗室檢查指南》相關法規(guī)和指南相關法規(guī)2010年版《中國藥典》一部附錄XVI7微生物實驗室的風險分析人員風險人員配置不足，不能準確及時完成崗位工作。培訓不足，工作人員不能按照SOP要求完成崗位工作。微生物實驗室的風險分析人員風險人員配置不足，不能準確及時完8微生物實驗室的風險分析環(huán)境風險環(huán)境潔凈度：環(huán)境未達標，檢驗室環(huán)境污染導致測試結果陽性。實驗室功能區(qū)設計不合理，污染無菌室。未對進入微生物實驗室的人員進行限制，造成實驗室污染。所用消毒劑管理不規(guī)范，未進行消毒效果驗證，不能有效保證潔凈區(qū)的微生物控制。微生物實驗室的風險分析環(huán)境風險環(huán)境潔凈度：環(huán)境未達標，檢驗室9微生物實驗室的風險分析檢測方法風險檢測方法的制定不符合法規(guī)要求。檢測方法未進行確認或驗證。微生物實驗室的風險分析檢測方法風險檢測方法的制定不符合法規(guī)要10微生物實驗室的風險分析設備風險用于實驗室的設備、儀器和其它裝置未按要求進行驗證和校準。用于實驗室的設備、儀器和其它裝置維護不足。實驗室的設備、儀器和其它裝置的監(jiān)控未按要求進行。微生物實驗室的風險分析設備風險用于實驗室的設備、儀器和其它裝11微生物實驗室的風險分析試液及培養(yǎng)基風險未對供應商進行審核，不能保證試液及培養(yǎng)基質量。未按照要求儲存條件進行儲存，對試液及培養(yǎng)基質量產生不良影響。試液及培養(yǎng)基的配制未進行監(jiān)控或驗證，對試液及培養(yǎng)基質量產生不良影響。未對試液及培養(yǎng)基進行質量檢查，不能保證試液及培養(yǎng)基質量。試液及培養(yǎng)基有效期管理不規(guī)范。微生物實驗室的風險分析試液及培養(yǎng)基風險未對供應商進行審核，不12微生物實驗室的風險分析菌種風險未對供應商進行審核，菌種質量不能保證。未按照要求儲存條件進行儲存，降低菌種活力。菌種操作（復蘇、傳代、保存）不規(guī)范，造成菌種污染和活力降低。未對保藏菌種進行質量檢查，不能保證菌種的純度及菌種特性。菌種使用有效期管理不規(guī)范。微生物實驗室的風險分析菌種風險未對供應商進行審核，菌種質量不13微生物實驗室的風險分析樣品管理風險取樣操作管理不規(guī)范，污染樣品。樣品傳遞、保存、分發(fā)不規(guī)范，對樣品中微生物產生不利影響或直接導致檢驗結果錯誤（如需陰涼存放的樣品，放在普通環(huán)境，導致樣品變質或被污染；分發(fā)錯誤，理化檢測的樣品用于微生物檢測）。物品：消毒、滅菌措施未經驗證，如滅菌釜溫度過高，培養(yǎng)基被破壞，微生物沒辦法真實表達出來，造成假陰性結果。消毒、滅菌后存放條件不合適或放置時間過長造成污染。微生物實驗室的風險分析樣品管理風險取樣操作管理不規(guī)范，污染樣14微生物實驗室的風險分析污物處理管理風險污染物質的處理過程不適當，造成環(huán)境和人員的污染。未按操作規(guī)程處理剩余樣品，特別是劇毒樣品、生物樣品，導致嚴重的環(huán)境污染，甚至對人員健康造成不良影響。（檢驗樣品、

有毒的溶液、用過的培養(yǎng)基、動物實驗動物及其排泄物）微生物實驗室的風險分析污物處理管理風險污染物質的處理過程不適15微生物實驗室的風險分析質量保證和質量控制風險實驗室未制定內部質量保證和質量控制體系（如

偏差的處理、加標樣品的使用、重復性檢測和操作的熟練度），不能保證每天的檢測結果與標準規(guī)定的一致性。微生物實驗室的風險分析質量保證和質量控制風險實驗室未制定內部16質量管理和保障管理5.廢棄物的處理6.檢測報告7.樣品8.檢測步驟1.人員2.環(huán)境3.檢驗方法的驗證4.結果質量保證和操作質量控制9.樣品操作和鑒別10.標準物質和標準培養(yǎng)基11.試劑和培養(yǎng)基12.設備微生物實驗室管理質量管理和保障管理5.廢棄物的處理6.檢測報告7.樣品8.檢17WHO微生物實驗室管理要求實例區(qū)域安裝級別推薦要求樣品接收無級別無級別培養(yǎng)基制備無級別無級別滅菌前室無級別無級別滅菌后室（無菌區(qū)域內）GradeBISO5and<10cfu/m3無菌測試（操作區(qū)）GradeAISO5and<1cfu/m3無菌測試（背景區(qū)）GradeBISO5and<10cfu/m3操作區(qū)域布局-1WHO微生物實驗室管理要求實例區(qū)域安裝級別推薦要求樣品接收無18WHO微生物實驗室管理要求實例區(qū)域安裝級別推薦要求無菌測試（隔離器）GradeAISO5and<1cfu/m3無菌測試（隔離器背景）無級別無級別培養(yǎng)箱無級別無級別計數(shù)區(qū)域無級別（關鍵步驟應在層流區(qū)域操作）無級別（關鍵步驟應在層流區(qū)域操作）清潔區(qū)域無級別無級別操作區(qū)域布局-2WHO微生物實驗室管理要求實例區(qū)域安裝級別推薦要求無菌測試（19WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率培養(yǎng)箱冰箱冷庫、烘箱清潔和消毒內部外部每月需要時（3個月）需要時（每年）水浴清潔、消毒、更換用水每月每6月滅菌劑消毒離心機維護清潔和消毒每年每次使用高壓蒸汽滅菌器外觀檢查維護壓力容器安全檢查按照供應商要求每年（按照供應商要求）每年設備維護-1WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率培養(yǎng)箱清潔和消20WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率安全柜層流柜維護及機械檢查每年（按照供應商要求）顯微鏡維護每年厭氧罐清潔和消毒每次使用培養(yǎng)基分配裝置清潔及適當消毒每次使用螺旋震蕩器清潔及消毒每次使用實驗室清潔和消毒工作區(qū)域、地面清潔和消毒其它表面每次使用每3月設備維護-2WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率安全柜維護及機21WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率標準液體溫度計全量程校準單點校準（通常為0點）每3年每年標準熱電偶全量程校準標準溫度計核對每3年每年工作溫度計和工作熱電偶標準溫度計冰點和/或全量程核對每年濕度計校準每次使用設備校準及頻率WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率標準液體溫度計22WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率溫控設備確認溫度的穩(wěn)定性和均一性溫度監(jiān)控每2年及維修改造后每次使用干熱滅菌柜確認溫度的穩(wěn)定性和均一性溫度監(jiān)控每2年及維修改造后每次使用高壓蒸汽滅菌器確認溫度的穩(wěn)定性和均一性溫度監(jiān)控每2年及維修改造后每次使用無菌測試A級區(qū)——安全柜——隔離器——性能確認——微生物監(jiān)控——空氣流型監(jiān)控——高效過濾器完整性監(jiān)控——每年及維修改造后——每次使用——每6月——每6月設備確認及監(jiān)控-1WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率溫控設備確認溫23WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率單向層流柜——性能確認——微生物監(jiān)控——空氣流型監(jiān)控——高效過濾器完整性監(jiān)控——每年及維修改造后——每周——每6月——每6月培養(yǎng)基分配器體積分配檢查每次調節(jié)及復位移液管體積分配精確性檢查定期（依據(jù)使用頻率確定）厭氧罐/培養(yǎng)箱厭氧指示劑檢查每次使用實驗室環(huán)境空氣及表面微生物污染檢查（通常使用空氣采樣器、沉降碟、接觸碟、拭子）依據(jù)風險評估，建立合適的監(jiān)測計劃。設備確認及監(jiān)控-2WHO微生物實驗室管理要求實例設備類型要求頻率單向層流柜——24WHO微生物實驗室管理要求實例標準菌株的使用標準菌株（來源于有資質的供應商）標準儲存菌株1代（凍干、液氮、超低溫保存）工作菌株日常使用標準儲存菌株2代（凍干、液氮、超低溫保存）工作菌株日常使用標準儲存菌株3代（凍干、液氮、超低溫保存）工作菌株日常使用標準儲存菌株4代（凍干、液氮、超低溫保存）工作菌株日常使用工作菌株日常使用WHO微生物實驗室管理要求實例標準菌株的使用標準菌株（來源于25第二部分USP微生物檢測技術精要第二部分USP微生物26目錄藥典微生物章節(jié)概要非無菌制劑的微生物檢查無菌測試微生物特性確定，鑒定及菌株分型目錄藥典微生物章節(jié)概要27微生物專家委員會的責任范圍負責不負責微生物測試微生物監(jiān)控水個論（除了設立微生物限度、無菌和細菌內毒素標準）微生物專家委員會的責任范圍負責不負責微生物測試水28微生物學是開發(fā)、生產及成品測試的一部分無菌控制也適用于非無菌產品控制貫穿于一個藥物或生物制劑從研發(fā)到市場到成品控制的整個過程整個過程中的各種微生物控制的整合將提高最終產品微生物的質量保證USP提供了每個階段微生物控制程序和指導微生物學是開發(fā)、生產及成品測試的一部分無菌控制也適用于非無菌29作為重要組成的微生物控制原料和組分的微生物控制環(huán)境的微生物控制生產過程的微生物控制成品的微生物控制人員的微生物控制所有微生物控制的組合微生物控制作為重要組成的微生物控制原料和組分的微生物控制微生物控制30原料和組分的微生物控制的USP觀點及文件<61>非無菌制劑的微生物檢查：微生物計數(shù)測試<62>非無菌制劑的微生物檢查：特定微生物的檢驗<1111>非無菌藥品的微生物屬性原料和組分的微生物控制的USP觀點及文件原料和組分的微生物控制的USP觀點及文件<61>非無菌制劑的31環(huán)境微生物控制的USP觀點及文件<1116>潔凈室和其他受控環(huán)境的微生物評估<1072>消毒劑與殺菌劑<1208>無菌產品包裝-完整性評估環(huán)境微生物控制的USP觀點及文件環(huán)境微生物控制的USP觀點及文件<1116>潔凈室和其他受控32過程微生物控制的USP觀點及文件<1211>滅菌與無菌保證<1035>生物指示劑<1209>滅菌-化學和物理指示劑，及綜合指示劑<55>生物指示劑-耐受力測試過程微生物控制的USP觀點及文件過程微生物控制的USP觀點及文件<1211>滅菌與無菌保證過33成品微生物控制的USP觀點及文件<71>無菌測試<85>細菌內毒素測試<151>熱源測試<51>抗菌有效性測試<1222>最終滅菌物品-參數(shù)放行<1207>無菌產品包裝-完整性評估成品微生物控制的USP觀點及文件成品微生物控制的USP觀點及文件<71>無菌測試成品微生物控34微生物章節(jié)<51>防腐劑-有效性<55>生物指示劑–耐受力測試<61>非無菌產品的微生物檢查：微生物測試<62>控制菌的微生物檢查<71>無菌測試<85>細菌內毒素測試<1035>滅菌生物指示劑微生物章節(jié)<51>防腐劑-有效性35微生物章節(jié)<1072>消毒劑與殺菌劑<1111>非無菌產品的微生物屬性<1112>水分活性應用<1116>潔凈室和其他受控環(huán)境的微生物評估<1117>微生物實驗室規(guī)范<1207>無菌產品包裝-完整性評估微生物章節(jié)<1072>消毒劑與殺菌劑36微生物章節(jié)<1208>無菌測試-隔離系統(tǒng)驗證<1209>無菌-化學和物理化學指示劑，及綜合指示劑<1211>滅菌和無菌保證<1222>最終滅菌藥品-參數(shù)放行<1223>微生物替代方法驗證<1227>藥物的微生物回收率驗證<1229>藥典物質滅菌微生物章節(jié)<1208>無菌測試-隔離系統(tǒng)驗證37微生物章節(jié)<1231>制藥用水<2021>微生物計數(shù)測試-營養(yǎng)和食品補充劑<2022>控制菌的微生物檢查-營養(yǎng)和食品補充劑<2023>非無菌營養(yǎng)和食品補充劑的微生物評估微生物章節(jié)<1231>制藥用水38非無菌制劑的微生物檢查-計數(shù)方法介紹在此描述的測試允許對在需氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌進行定量計數(shù)這些測試設計用于確定原料藥或制劑是否符合已建立的微生物質量標準。當用于這樣的目的時，按下列指導進行，包括取樣數(shù)量，結果詮釋。該方法不適用于將微生物作為活性成分的產品。其它可替代的微生物程序，包括自動化方法，如果已證明了其同藥典方法的等效性，也可以使用。非無菌制劑的微生物檢查-計數(shù)方法介紹在此描述的測試允許對在需39常規(guī)過程避免產品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）去除細菌抑制/真菌抑制性（為什么？）常規(guī)過程避免產品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）40計數(shù)方法薄膜過濾法孔徑0.45um的濾膜，選擇不受樣品液干擾的材質，不對微生物的截留產生影響，建議每片薄膜上的樣品量為1g，過濾后適當沖洗薄膜平皿計數(shù)：平皿澆注法9cm的平皿，加入1ml樣品液，15-20ml培養(yǎng)基，澆制溫度≤45℃，每種培養(yǎng)基每個稀釋度至少2個平皿，可使用更大規(guī)格的平皿平皿計數(shù)：表面涂布法9cm的平皿，加入45℃左右15-20ml培養(yǎng)基，待凝固，每種培養(yǎng)基每個稀釋度至少2個平皿，樣品涂布不少于0.1ml，可使用更大規(guī)格的平皿最大可能計數(shù)法（MPN）用于檢測極少數(shù)量的微生物，精密度、準確度差，不適用于霉菌計數(shù)方法薄膜過濾法孔徑0.45um的濾膜，選擇不受樣品液干擾41生長能力測試和方法適用性生長能力測試包括：一般考慮測試菌株準備緩沖液陰性對照培養(yǎng)基生長測試計數(shù)方法適用性包括：樣品制備接種與稀釋中和/去除抗菌活性產品存在情況下的微生物回收率結果與解釋生長能力測試和方法適用性生長能力測試包括：計數(shù)方法適用性包括42生長能力測試和方法適用性“必須建立在待測產品存在微生物情況下，仍有檢出微生物能力的方法”“如果測試性能發(fā)生變化或發(fā)生可能影響測試結果的產品變更，方法適用性必須重新進行再確認”USP<61>生長能力測試和方法適用性“必須建立在待測產品存在微生物情況下43測試菌種及陰性對照微生物使用不超過5代2小時內使用，如2-8℃不超過24h黑曲霉及枯草芽孢桿菌也可制備孢子懸浮液，2-8℃保存期限需確認陰性對照必須沒有微生物，測試失敗需要進行調查測試菌種及陰性對照微生物使用不超過5代44培養(yǎng)基生長能力測試測試每批“待用”培養(yǎng)基，每批從干粉培養(yǎng)基制備得到的培養(yǎng)基，及根據(jù)配方制備得到的培養(yǎng)基按上述表中的條件培養(yǎng)TSA/TSB30-35℃，沙堡葡萄糖瓊脂20-25℃細菌：3d，真菌5d結果判斷：固體培養(yǎng)基：偏差系數(shù)為2液體培養(yǎng)基：有明顯生長，與前次測試結果一致培養(yǎng)基生長能力測試測試每批“待用”培養(yǎng)基，每批從干粉培養(yǎng)基制45計數(shù)方法的適用性計數(shù)方法適用性章節(jié)包括樣品準備，接種，稀釋，中和抗菌活性和在產品存在的情況下的回收率，結果和解釋的方面的討論計數(shù)方法的適用性計數(shù)方法適用性章節(jié)包括樣品準備，接種，稀釋，46樣品制備樣品制備方法依據(jù)待測產品的物理特性。如如下述的個程序均被證明不適用，必須開發(fā)適用的替代方法水溶性產品水不溶性非脂類產品脂類產品氣霧劑皮膚貼劑樣品制備樣品制備方法依據(jù)待測產品的物理特性。如如下述的個程序47測試樣品數(shù)量除非其他地方指出，用10g或10ml氣霧劑：10個容器皮膚貼劑：取10片隨機抽樣，混合測試測試樣品數(shù)量除非其他地方指出，用10g或10ml48產品檢測樣品培養(yǎng)：TAMC:30-35℃,3-5dTYMC:20-25℃,5-7d產品檢測樣品培養(yǎng)：49非無菌制劑的微生物檢查-特定微生物的檢驗介紹樣品培養(yǎng)下述檢驗方法用于在規(guī)定條件下測定指定的微生物是否存在。該測試設計用于確定一種原料藥或制劑是否符合已建立的微生物質量質量標準。當用于這樣的目的時，按下述的指導進行，包括取樣數(shù)量，結果詮釋?？商娲奈⑸锍绦?，包括自動化方法，如果已證明了其同藥典方法的等效性，也可以使用。

非無菌制劑的微生物檢查-特定微生物的檢驗介紹樣品培養(yǎng)下述檢驗50常規(guī)過程常規(guī)過程避免產品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）去除細菌抑制/真菌抑制性（為什么？）常規(guī)過程常規(guī)過程避免產品以外的微生物污染（最大的污染源是什么51產品測試產品測試通則分別列出了各個微生物測試的章節(jié)，每個章節(jié)包括以下這些通用部分：樣品制備和增殖選擇性培養(yǎng)結果解釋產品測試產品測試通則分別列出了各個微生物測試的章節(jié)，每個章節(jié)52培養(yǎng)基適用性測試和方法適用性測試培養(yǎng)基適用性測試和方法適用性測試培養(yǎng)基適用性測試：測試菌株準備緩沖液陰性對照生長能力測試，抑制及選擇性測試方法適用性包括樣品制備接種與稀釋中和/去除抗菌活性產品存在情況下的微生物回收率結果與解釋培養(yǎng)基適用性測試和方法適用性測試培養(yǎng)基適用性測試和方法適用性53菌種、陰性對照及培養(yǎng)基菌種、陰性對照及培養(yǎng)基菌種微生物使用不超過5代2小時內使用，如2-8℃不超過24h生孢梭菌也制備孢子懸浮液，2-8℃保存期限需確認陰性對照必須沒有微生物，測試失敗需要進行調查測試每批“待用”培養(yǎng)基，每批從干粉培養(yǎng)基制備得到的培養(yǎng)基，及根據(jù)配方制備的培養(yǎng)基，根據(jù)藥典確認相應培養(yǎng)基具有適當?shù)奶匦跃N、陰性對照及培養(yǎng)基菌種、陰性對照及培養(yǎng)基菌種54質控可接受標準質控可接受標準生長能力測試液體培養(yǎng)基與前一批通過測試并被批準的培養(yǎng)基結果一致固體培養(yǎng)基-清楚觀察到與前一通過測試并被批準的培養(yǎng)基的前次結果一致抑制性應無測試微生物生長指示能力菌落外觀和指示反應與前一通過該測試并被批準的培養(yǎng)基的前次結果一致質控可接受標準質控可接受標準生長能力測試55方法適用性方法適用性如果對某個微生物的抗菌活性不能去除，那就假設這個被抑制的微生物不會出現(xiàn)在產品中方法適用性方法適用性如果對某個微生物的抗菌活性不能去除，那就56劑型TAMC(cfu/gorcfu/ml)TYMC(cfu/gorcfu/ml)控制菌（1g或ml）非液體口服給藥制劑103102大腸埃希菌液體口服給藥制劑102101大腸埃希菌直腸給藥制劑103102---牙齦、皮膚、鼻及耳用102101金黃色葡萄球菌銅綠假單孢菌陰道制劑102101金黃色葡萄球菌銅綠假單孢菌白色念珠菌吸入劑102101金黃色葡萄球菌銅綠假單孢菌耐膽鹽革蘭陰性菌活性藥物成分，輔料103102方法適用性劑型TAMCTYMC控制菌（1g或ml）非液體口服給藥制57控制微生物測試控制微生物測試沙門菌大腸埃希菌銅綠假單孢菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌生孢梭菌耐膽鹽G-的定性及定量沒有其他的有害微生物嗎？控制微生物測試控制微生物測試沙門菌沒有其他的58FDA說什么無有害微生物21CFR211.113微生物污染控制（a）適當?shù)臅娉绦虮仨毥⒉⒆裱苑乐狗菬o菌藥品中的有害微生物FDA說什么無有害微生物21CFR211.113微生物污59FDA說什么還有什么？21CFR211.165分發(fā)前的測試與放行…（b）必須的話，對每批應不存在有害微生物的藥品應有適當?shù)膶嶒炇覝y試不僅僅是不存在USP規(guī)定的微生物FDA說什么還有什么？21CFR211.165分發(fā)前的測60有害微生物有害微生物有害微生物的概念不適合用于無菌產品，無菌產品中不得有任何微生物將用于非無菌產品的微生物測試，及非無菌生產環(huán)境中分離得到的微生物評估及清潔驗證有害微生物有害微生物有害微生物的概念不適合用于無菌產品，無菌61有害微生物有害微生物有害微生物可以被定義為：能在產品中增殖的微生物，對藥品的物理特性及治療作用有負面影響，并且由于產品中微生物的數(shù)量及致病性能導致使用該藥品的患者受到感染有害微生物有害微生物有害微生物可以被定義為：62有害微生物有害微生物顯而易見的藥品的有害微生物舉例：在含有普通防腐劑的局部用霜劑、鼻腔噴劑或口服液中能夠增殖的假單胞菌，片劑的表面生長的真菌食源性的致病細菌，如口服制劑中的沙門菌和志賀菌暴露與高濕環(huán)境中的氣泡眼包裝內的片劑表面會生長真菌有害微生物有害微生物顯而易見的藥品的有害微生物舉例：63在注射劑中經常會發(fā)現(xiàn)下述要求：“當按待檢產品無菌測試要求進行膜過濾法測試時符合要求?！备髡撝袑o菌的通常要求在各論中另一種指出無菌測試要求的方法是什么呢？在注射劑中經常會發(fā)現(xiàn)下述要求：各論中對無菌的通常要求64嗎啡硫酸鹽注射劑：“其他要求——符合注射劑項下要求。”各論中對無菌的通常要求From<1>Injections注射劑：無菌測試-注射劑應符合無菌測試<71>的要求嗎啡硫酸鹽注射劑：“其他要求——符合注射劑項下要求?！备髡撝?5美國傳統(tǒng)的對無菌的觀點：“沒有細菌或其它微生物”什么是“無菌”<1211>滅菌和無菌保證中的觀點“按照無菌最嚴格的定義，只有當樣品中完全沒有活的微生物時，它才能被稱為是無菌的”證明產品中完全沒有活的微生物，有可能嗎？美國傳統(tǒng)的對無菌的觀點：“沒有細菌或其它微生物”什么是“無菌66不能，除非你不準備留下產品進行銷售，因為你不將整批產品進行逐個破壞檢查是無法證明絕對無菌的無菌測試的首要難點盡管批產品中有污染，但通過無菌測試的概率有多大呢？不能，除非你不準備留下產品進行銷售，因為你不將整批產品進行逐67無菌測試的首要難點假設生產無菌注射劑，批量為20，000瓶，該批染菌率為0.1%，即20瓶，從20，000中隨機抽取20（n）瓶進行無菌檢查，檢查合格的機會P為多少？P=（1-0.1%）20=98%無菌測試的首要難點假設生產無菌注射劑，批量為20，000瓶，68首要難點的推論如果你不能評估批產品中的每個產品，那根據(jù)什么判斷產品的？無菌是根據(jù)概率的原則判斷的。從給定批號的所有產品中存在被污染產品的概率得出判斷目的是使其可能性與真實性僅有可接受的微小差異。在無菌保證中將詳細討論。首要難點的推論如果你不能評估批產品中的每個產品，那根據(jù)什么判69我們現(xiàn)在知道不能用無菌測試合格來證明整批產品的無菌性無菌測試那么，一個產品通過無菌測試能證明什么呢？我們現(xiàn)在知道不能用無菌測試合格來證明整批產品的無菌性無菌測試70無菌測試本身并不是設計用于保證產品無菌或產品已滅菌。產品的無菌保證是通過滅菌工藝或滅菌工藝的驗證來得到的。無菌測試無菌測試適用于藥典要求無菌的藥物成分，配劑或制劑。然而，合格結果僅說明在測試條件下受檢的樣品中未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌測試本身并不是設計用于保證產品無菌或產品已滅菌。產品的無71無菌測試流程培養(yǎng)基和細菌抑制/真菌抑制性測試（方法驗證）去除任何抑制細菌和真菌生長的因素確定用于測試的樣品數(shù)量，每個樣品的用量培養(yǎng)樣品檢查測試樣品是否有生長的跡象顯微鏡檢查有疑問的容器是否有生長的跡象必要的話再接種培養(yǎng)寫報告無菌測試流程培養(yǎng)基和細菌抑制/真菌抑制性測試（方法驗證）72無菌測試：培養(yǎng)基測試培養(yǎng)基儲存2-25℃無菌，密閉容器儲存不超過驗證的期限巰乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基顏色指示要求符合培養(yǎng)基的無菌每種要求的培養(yǎng)基取一部分在特定溫度下培養(yǎng)14天，檢查是否渾濁？（為什么不止一個溫度？）與測試同時進行培養(yǎng)基的無菌檢查（這樣做有什么風險嗎？）無菌測試：培養(yǎng)基測試培養(yǎng)基儲存73無菌測試：培養(yǎng)基測試生長能力測試：細菌培養(yǎng)3天，真菌培養(yǎng)5天檢查生長的跡象“生長”看起來是什么樣的？無菌測試：培養(yǎng)基測試生長能力測試：74無菌測試：方法適用性測試產品特性允許的話，首選膜過濾法解釋：如果生長，有渾濁產生，和對照一致。如果不是，你需要修改測試條件以去除抗菌活性如何做呢？無菌測試：方法適用性測試產品特性允許的話，首選膜過濾法75無菌測試：常規(guī)方法測試的樣品量是多少？每個容器中需要轉移出的樣品量，例如：液體（非抗生素）:裝量小于1ml/瓶—所有內容物；固體：裝量300mg～5g—150mg每種培養(yǎng)基的樣品測試的數(shù)量，例如：批量大于500瓶—2%或20瓶，取少量。當一個容器的內容物足夠用于兩種培養(yǎng)基時，該測試數(shù)量可等分至兩種培養(yǎng)基，否則按藥典表中取雙倍數(shù)量無菌測試：常規(guī)方法測試的樣品量是多少？76無菌測試：常規(guī)方法測試的樣品量是多少？膜過濾法時，可能的話，使用容器中所有樣品直接接種法時，兩種培養(yǎng)基中使用同樣的樣品，除非一個容器中的樣品不夠用于兩種培養(yǎng)基無菌測試：常規(guī)方法測試的樣品量是多少？77無菌測試：通常的注意點無菌測試在無菌環(huán)境中進行注意避免污染的同時，注意不要影響測試對微生物的檢出進行測試的工作環(huán)境應通過對工作環(huán)境取樣，進行定期監(jiān)控并進行適當?shù)目刂茻o菌測試時包括適當?shù)年幮詫φ諢o菌測試：通常的注意點無菌測試在無菌環(huán)境中進行78無菌測試：常規(guī)方法培養(yǎng)條件：巰乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基在32.5±2.5℃培養(yǎng)不少于14D，TSB在22.5±2.5℃培養(yǎng)不少于14D，觀察在14D的培養(yǎng)過程中定期觀察培養(yǎng)基顯微鏡檢查（渾濁的話，除非合理的將結果視為無效）無菌測試：常規(guī)方法培養(yǎng)條件：79無菌測試：結果解釋只有一項或多項下列情況發(fā)生時，測試才可能被考察為無效測試：無菌測試區(qū)域的微生物環(huán)控數(shù)據(jù)顯示有錯誤發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)測試過程有錯誤陰性對照發(fā)現(xiàn)微生物陽性測試污染微生物鑒定后，能明確地將微生物生長歸因于用于無菌測試使用的物料/技術發(fā)生錯誤無效測試可重新進行測試無菌測試：結果解釋只有一項或多項下列情況發(fā)生時，測試才可能被80微生物特性確定，鑒定及菌株分型-概述USP35-NF302012年5月1日生效內容介紹純培養(yǎng)分離初步篩選及初步確認表型微生物鑒定基因型微生物鑒定微生物鑒定方法確認生物種類史思考微生物特性確定，鑒定及菌株分型-概述USP35-NF30281何時需要進行微生物定性在下述情況中檢出的微生物原料藥輔料制藥用水生產環(huán)境中間體成品何時需要進行微生物定性在下述情況中檢出的微生物82微生物定性程度微生物特性確定微生物鑒定菌株分離微生物定性程度微生物特性確定微生物鑒定菌株分離83微生物定性程度微生物特性確定利用菌落形態(tài)學、細胞形態(tài)學，不同的染色計數(shù)，重要的診斷特性來確定實驗室分離得到的微生物的特性，用于趨勢分析及調查，并不是鑒定。適用于大多數(shù)非無菌生產運作及部分無菌生產環(huán)境的風險評估。微生物定性程度微生物特性確定利用菌落形態(tài)學、細胞形態(tài)學，不同84微生物定性程度微生物鑒定定義：確定實驗室分離的微生物的類別，大類（如細菌，酵母菌或霉菌），小類（如屬、種）。更明確的鑒定到種和屬，某些方法甚至鑒定到株。當產品中的微生物數(shù)量高于制定限度或出現(xiàn)異常高的微生物檢出率時，尤其適用。對無菌工藝很有幫助，對在無菌測試陽性及模擬工藝，如培養(yǎng)基灌裝，失敗時檢出的微生物污染進行評估時是必須的。微生物定性程度微生物鑒定定義：確定實驗室分離的微生物的類別，85微生物定性程度微生物鑒定<62>控制菌檢測中，特別指出，當在選擇性或指示培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的疑似菌落需進行確認鑒定。<1116>建議對分離得到的微生物進行適當頻率的鑒定，以支持環(huán)境監(jiān)測計劃。對大量的非致病微生物，如葡萄球菌，棒狀桿菌，微球菌，一般鑒定到屬。微生物定性程度微生物鑒定<62>控制菌檢測中，特別指出，當在86微生物定性程度菌株分離菌株分型是臨床及公共健康微生物學中，流行病學調查的組成部分。方法包括脈沖場凝膠電泳，核糖體DNA測序，隨意引物聚合酶鏈反應，全基因組序列限制圖或光學圖，用于證明微生物是相同菌株，并非?？赡苁峭粊碓?。用于調查微生物的來源。微生物定性程度菌株分離菌株分型是臨床及公共健康微生物學中，流87微生物定性程度菌株分離對無菌工藝很有幫助，對在無菌測試陽性或模擬工藝失敗時檢出的微生物污染進行評估時是必須的。<71>無菌測試允許，當測試中分離的微生物經鑒定，其生長明確歸因于與物料和/無菌測試中所用到的技術相關的錯誤，該測試可判斷為無效。微生物定性程度菌株分離對無菌工藝很有幫助，對在無菌測試陽性或88微生物鑒定步驟及方法分離純培養(yǎng)初步篩選及特性確定表型微生物鑒定基因型微生物鑒定微生物鑒定步驟及方法分離純培養(yǎng)89第三部分培養(yǎng)基的質量控制和規(guī)范化操作第三部分培養(yǎng)基的質量控制和規(guī)范化操作90目錄培養(yǎng)基制備的質量控制2培養(yǎng)基使用規(guī)范4培養(yǎng)基測試33培養(yǎng)基的確認和接收31培養(yǎng)基有效期的驗證35目錄培養(yǎng)基制備的質量控制2培養(yǎng)基使用規(guī)范4培養(yǎng)基測試33培養(yǎng)91培養(yǎng)基定義培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。培養(yǎng)基定義培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物組織和動物組92培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基由于配制的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養(yǎng)基在受熱、吸潮后，易被細菌污染或分解變質，因此一般培養(yǎng)基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養(yǎng)基（如組織培養(yǎng)基），較長時間的貯存，必須冷藏存放。培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基由于配制的原料不同，使用要求不同，而貯存保管93購置驗收要求技術數(shù)據(jù)清單產品名稱、編號批號使用前的pH必要的安全/危害數(shù)據(jù)有效期生產企業(yè)提供材料：產品標簽購置驗收要求技術數(shù)據(jù)產品名稱、編號批號使用前的pH必要的安全94購置驗收要求生產企業(yè)提供材料：質控證書性能評價所用測試菌株購置驗收要求生產企業(yè)提供材料：質控證書性能評價所用測試菌株95購置驗收要求實驗室驗收例行常規(guī)檢查內容使用前檢查(即用型培養(yǎng)基)購置驗收要求實驗室驗收96培養(yǎng)基儲存培養(yǎng)基的儲存條件應按照供應商的要求進行。大部分培養(yǎng)基應儲存在干燥、陰涼處，溫度一般為15～25℃。部分培養(yǎng)基需要儲存在2～8℃。培養(yǎng)基儲存培養(yǎng)基的儲存條件應按照供應商的要求進行。97培養(yǎng)基儲存培養(yǎng)基應建立臺賬，至少應包括以下信息：

名稱、批號、數(shù)量、規(guī)格、有效期、到貨日期、驗收日期、有效期、儲存地點、儲存條件依據(jù)“先進先出”原則進行使用。應制定開瓶的培養(yǎng)基的使用周期。培養(yǎng)基儲存培養(yǎng)基應建立臺賬，至少應包括以下信息：98藥典2010版，2部除附錄另有規(guī)定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗可只進行1次。如果培養(yǎng)基的制備過程未經驗證，那么每一批培養(yǎng)基均要進行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據(jù)培養(yǎng)基的用途從相關附錄中進行選擇，也可增加從生產環(huán)境及產品中常見的污染菌株。培養(yǎng)基制備的質量控制藥典2010版，2部培養(yǎng)基制備的質量控制99培養(yǎng)基用水配制環(huán)境

器具稱量

溶解培養(yǎng)基制備的質量控制

pH

滅菌前分裝滅菌滅菌后分裝

儲存培養(yǎng)基用水培養(yǎng)基制備的質量控制pH100成品質量檢查外觀檢查pH值無菌性檢查促生長能力抑菌能力指示能力培養(yǎng)基測試成品質量檢查培養(yǎng)基測試101外觀檢查外觀、色澤和均一性無沉淀（一般）無氣泡包裝完整瓊脂凝膠無裂痕無褶皺平板培養(yǎng)基應水平特殊要求培養(yǎng)基測試外觀檢查培養(yǎng)基測試102

pH值冷卻至室溫后測定。應與培養(yǎng)基說明或相關法規(guī)要求范圍一致。如不符合，應進行pH值調整。培養(yǎng)基測試pH值培養(yǎng)基測試103無菌性檢查無菌檢查用培養(yǎng)基均應進行無菌性檢查。用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應進行100%的預培養(yǎng)以防止外來的污染物帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽性結果。其他試驗用培養(yǎng)基應進行預培養(yǎng)。培養(yǎng)基測試無菌性檢查培養(yǎng)基測試104菌種菌懸液制備促生長能力抑菌能力指示能力培養(yǎng)基測試菌種培養(yǎng)基測試105培養(yǎng)基使用規(guī)范制備培養(yǎng)基的儲存，注意瓊脂培養(yǎng)基易受冷凍的影響，不宜低于0℃，凝膠結構破壞。避光、避熱。瓊脂培養(yǎng)基密封，防止水分蒸發(fā)。培養(yǎng)基使用規(guī)范制備培養(yǎng)基的儲存，注意106培養(yǎng)基使用規(guī)范融化重復融化應被限制（不超過1次），防止過度加熱或潛在污染融化時，使用水浴或流通蒸汽微波爐，熱板要防止過度加熱融化的培養(yǎng)基的儲存在40-45℃水浴不應超過8h澆制平皿前擦干防止污染培養(yǎng)基使用規(guī)范融化107培養(yǎng)基使用規(guī)范-存儲培養(yǎng)基應標示批號，制備批號制備日期，有效期培養(yǎng)基名稱有效期確定根據(jù)成分，配方，容器，儲存條件等確定生長能力試驗數(shù)據(jù)支持培養(yǎng)基儲存不得超過有效期培養(yǎng)基使用規(guī)范-存儲培養(yǎng)基應標示108培養(yǎng)基使用規(guī)范-存儲培養(yǎng)基應根據(jù)生產商的說明書，并在驗證過的條件下

儲存重要區(qū)域環(huán)控用培養(yǎng)基必須雙重包裝最終滅菌，否則進行全數(shù)預培養(yǎng)及用前檢查應根據(jù)當?shù)厣镂ｋU品安全程序處置過期培養(yǎng)基培養(yǎng)基使用規(guī)范-存儲培養(yǎng)基應根據(jù)生產商的說明書，并在驗證過的109培養(yǎng)基使用規(guī)范記錄入庫記錄配置記錄滅菌記錄菌種使用記錄培養(yǎng)箱使用記錄培養(yǎng)基質量檢測記錄培養(yǎng)基配制驗證報告培養(yǎng)基有效期驗證報告培養(yǎng)基使用規(guī)范記錄110培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期：干粉培養(yǎng)基未開封，按照商品說明制定。已開封，依據(jù)培養(yǎng)基組分性質制定，有效期應適中。外購成品培養(yǎng)基參考商品說明和有效期驗證結論制定。培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期：111培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期：自制成品培養(yǎng)基平板固體培養(yǎng)基：有效期一般為七天未密封培養(yǎng)基：有效期一般為21天密封培養(yǎng)基：有效期最長不超過一年培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期：112培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期驗證內容：外觀檢查pH值無菌性檢查促生長能力抑菌能力指示能力培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期驗證內容：113培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期驗證階段：有效期較短的培養(yǎng)基：兩點驗證：0天、有效期截止時間（可適當延長）應有驗證報告有效期較長的培養(yǎng)基：多點驗證：0天、有效期內選擇驗證時間點、有效期截止時間（可適當延長）驗證報告定期的培養(yǎng)基質量檢查培養(yǎng)基有效期的驗證培養(yǎng)基有效期驗證階段：114第四部分菌種管理第四部分菌種管理115目錄菌種管理2菌種確認4菌種復蘇、傳代、保藏33菌種概述31目錄菌種管理2菌種確認4菌種復蘇、傳代、保藏33菌種概述31116菌種概述菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。標準菌株：由國內或國際菌種保藏機構保藏的，遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株。標準儲備菌株：由標準菌株經傳代得到的培養(yǎng)物。工作菌株：由標準儲備菌株經傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。菌種概述菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。117菌種概述中國藥典2010年版在新增的“藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則”中對菌種有了較為明確的規(guī)定實驗室認可準則檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明（CNAS-CL09）USP菌種概述中國藥典2010年版118菌種概述涉及藥品微生物檢驗的菌種由醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供。CMCC提供的標準菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。美國模式培養(yǎng)物集存庫(Americantypeculturecollection,ATCC)

ATCC向全球發(fā)布其獲取、鑒定、保存及開發(fā)的生物標準品，推動科學研究的驗證、應用及進步菌種概述涉及藥品微生物檢驗的菌種由醫(yī)學微生物菌種保藏管理中119菌種概述中國醫(yī)學菌種保藏中心提供的標準菌株ATCC的標準菌株商業(yè)派生菌株自制冷凍保藏菌株菌種概述中國醫(yī)學菌種保藏ATCC的標準菌株商業(yè)派生菌株自制120為保證菌種的質量應對以下幾個方面進行控制：文件管理效期管理標識管理確認管理使用管理菌種管理為保證菌種的質量應對以下幾個方面進行控制：菌種管理121菌種的使用：菌種采購菌種的接受和儲存菌種的復蘇菌種的傳代工作菌懸液的制備菌種的保存菌種的確認菌種的銷毀菌種管理菌種的使用：菌種管理122實驗環(huán)境應在生物安全柜中進行菌種的傳代凍干保藏菌種處理用75%酒精棉消毒菌種管外壁。先用砂輪在安瓶上三分之一處劃痕，再用干燥的無菌紗布包裹安瓶，最后將安瓶掰開。用無菌吸管將胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基0.5ml左右注入被開啟的菌種安瓶中吹打，使安瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。菌種復蘇實驗環(huán)境菌種復蘇123甘油冷凍保藏菌種處理將甘油冷凍保藏菌種置于2～8℃至融化。用75%酒精棉消毒菌種管外壁。用無菌吸管混勻菌種懸液接種：用無菌吸管吸取適量菌種懸液加入到適量胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，其中生孢梭菌加入到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中進行復蘇，并做好標識。菌種復蘇菌種復蘇124培養(yǎng)：將接種好的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細菌于30～35℃培養(yǎng)18～24小時；真菌于23～28℃培養(yǎng)24～48小時。廢棄物滅菌：將染菌的器具、試劑等浸泡消毒液，進行濕熱滅菌121℃30min后廢棄或清洗。菌種復蘇菌種復蘇125實驗環(huán)境應在生物安全柜中進行菌種的傳代?；靹颍河脽o菌吸管混勻培養(yǎng)好的菌種復蘇培養(yǎng)物。接種：用無菌吸管吸取適量菌種復蘇培養(yǎng)基加入到適量的適宜胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基或胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中。其中生孢梭菌提供厭氧環(huán)境或加入到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中進行傳代；黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。已接種菌種的培養(yǎng)基均應做好標識。菌種傳代實驗環(huán)境菌種傳代126培養(yǎng)：將接種好的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。接種于液體培養(yǎng)基時，細菌于30～35℃培養(yǎng)18～24小時；真菌于23～28℃培養(yǎng)24～48小時。接種于固體培養(yǎng)基時，細菌于30～35℃培養(yǎng)24～48小時；白色念珠菌于23～28℃培養(yǎng)48～72小時；黑曲霉于23～28℃培養(yǎng)5～7天。廢棄物滅菌：將染菌的器具、試劑等浸泡消毒液，進行濕熱滅菌121℃30min后廢棄或清洗。菌種傳代培養(yǎng)：菌種傳代127保藏原理首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次應人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫和缺氧），使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。菌種保藏保藏原理菌種保藏128保藏方式各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。菌種保藏保藏方式菌種保藏129保藏方式斜面低溫保藏法甘油冷凍低溫保藏法液體石蠟封藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法菌種保藏保藏方式菌種保藏130菌懸液準備取培養(yǎng)好的菌種傳代液體培養(yǎng)物或刮取培養(yǎng)好的菌種傳代固體培養(yǎng)物上的菌落至無菌0.9%氯化鈉溶液中，并用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋至1×106～5×106CFU/ml。取經23～28℃培養(yǎng)5-7天的黑曲霉固體培養(yǎng)物，加入含0.05%吐溫的無菌0.9%氯化鈉溶液10ml洗下孢子，吸出轉移至無菌試管作為原液，用含0.05%吐溫的無菌0.9%氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1×106-5×106CFU/ml的菌懸液。菌種保藏菌懸液準備菌種保藏13110%甘油菌懸液向已制備好的菌懸液中加入等體積濃度為20%的無菌甘油溶液，得到10%甘油菌懸液。分裝：將10%甘油菌懸液無菌分裝至已滅菌的保存管中，每管1.0ml，并標記菌種名稱、代次、編號、傳代時間。保藏：將菌種保存管置于程序降溫盒中，在-70℃的冰箱中保存過夜。將保存過夜的菌種保存管從程序降溫盒中取出，放置于菌種專用保藏容器中，于-70℃以下保存，保藏有效期為1年。菌種保藏10%甘油菌懸液菌種保藏132菌種保藏外購的0代標準菌株復蘇，1代傳代，2代2代儲備菌種復蘇，3代傳代，4代工作菌種2代儲備菌種菌種保藏外購的0代標準菌株復蘇，1代傳代，2代2代儲備菌種復133菌種確認確認要求：所有標準菌株在進行菌種保存后，應取一支保存菌種進行菌種鑒別，符合要求后方可做為標準菌株儲備菌種使用。包括以下幾個方面：純培養(yǎng)：菌落生長情況染色鏡檢菌種特性檢查生化試驗血清學檢查菌種確認確認要求：134菌種確認純培養(yǎng)所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細胞或孢子都屬于生物學的同一個種。嚴格地說，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個細胞或孢子分裂、繁殖而產生的后代。在該細胞或孢子的生長過程種，不受其他微生物的侵犯，不會在培養(yǎng)物中產生另外微生物種的后代，在整個生長過程中不發(fā)生變異或死亡。菌種確認純培養(yǎng)135菌種確認純培養(yǎng)菌種確認人員按照相應規(guī)程對菌種就進行復蘇培養(yǎng)。如有厭氧需要，應提供厭氧環(huán)境進行培養(yǎng)。菌種確認人員挑取傳代培養(yǎng)物，在適當?shù)耐ㄓ梦⑸锱囵B(yǎng)基上用進行扇形劃線分離，經過適當?shù)呐囵B(yǎng)后得到分離的純培養(yǎng)單菌落。菌種鑒別人員對菌種的菌落形態(tài)進行記錄，菌落形態(tài)應相似，包括但不限于菌落的隆起度、表面形態(tài)、邊緣、光澤、質地、顏色、透明程度、表面菌落、深層菌落和底層菌落等，并進行拍照存檔。菌種確認純培養(yǎng)136菌種確認染色鏡檢革蘭氏染色芽孢染色莢膜染色鏡檢特征：對數(shù)生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應應呈現(xiàn)一致性；細胞形狀、大小、莢膜、芽孢等特征應相似。菌種確認染色鏡檢137菌種確認菌種特性檢查生化試驗各種微生物具有各自的獨特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所參與的物質分解和合成代謝的產物也不同，這些代謝產物又具有不同的生化特征。根據(jù)此特征，利用生物化學方法來鑒定不同的微生物的試驗即為微生物的生化試驗。血清學檢查指抗原抗體反應。抗原抗體反應是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結合反應。菌種確認菌種特性檢查138菌種確認大腸埃希菌的確認菌落形態(tài)取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經30～35℃培養(yǎng)18～24h后，形成菌膜，管底有粘液狀沉淀，培養(yǎng)物有糞臭味。曙紅亞甲藍瓊脂(EMB)瓊脂平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。菌種確認大腸埃希菌的確認139菌種確認大腸埃希菌的確認革蘭染色、鏡檢革蘭染色：取菌落形態(tài)觀察操作的培養(yǎng)物少許進行革蘭氏染色，待干后，鏡檢。染色結果：革蘭陰性菌呈紅色。鏡檢結果：短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。菌種確認大腸埃希菌的確認140菌種確認大腸埃希菌的確認生化試驗靛基質試驗，實驗結果應為陽性。甲基紅試驗，實驗結果應為陽性。乙酰甲基甲醇生成試驗，實驗結果應為陽性。枸櫞酸鹽利用試驗，實驗結果應為陽性。乳糖發(fā)酵試驗，實驗結果應為產酸產氣。菌種確認大腸埃希菌的確認141菌種確認金黃色葡萄球菌的確認菌落形態(tài)取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經30～35℃培養(yǎng)18～24h后，呈均勻渾濁生長，繁殖較多時易產生沉淀，沉淀易被搖散。甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán),菌落直徑0.7-1mm。卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1-2mm。菌種確認金黃色葡萄球菌的確認142菌種確認金黃色葡萄球菌的確認革蘭染色、鏡檢革蘭染色：取菌落形態(tài)觀察操作的培養(yǎng)物少許進行革蘭氏染色，待干后，鏡檢。染色結果：革蘭陽性菌呈藍紫色。鏡檢結果：為革蘭陽性球菌，無芽孢，一般不產生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個、成雙或短鏈狀排列。生化試驗血漿凝固酶試驗，實驗結果為血漿凝固。菌種確認金黃色葡萄球菌的確認143第五部分藥品微生物檢測分析方法的驗證第五部分藥品微生物檢測分析方法的驗證144微生物限度檢查方法驗證驗證內容菌落計數(shù)控制菌檢查細菌計數(shù)真菌計數(shù)大腸埃希菌白色念珠菌耐膽鹽革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌梭菌金黃色葡萄球菌沙門菌微生物限度檢查方法驗證驗證內容菌落計數(shù)控制菌檢查細菌計145微生物限度檢查方法驗證微生物限度檢查法驗證包括：1.細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗證

定量—回收率測定實驗2.控制菌檢查方法的驗證

定性—能否生長、專屬性實驗微生物限度檢查方法驗證微生物限度檢查法驗證包括：1.細菌、146微生物限度檢查方法驗證平皿法最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod，簡稱MPN法）通常細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法有三種方法，即：薄膜過濾法微生物限度檢查方法驗證平皿法最可能數(shù)法通常細菌、霉菌及酵母菌147微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點平皿法：供試品不溶或微溶，出現(xiàn)混濁，會干擾計數(shù)結果；由于接種量受限制，試驗靈敏度受局限；操作簡便，設備要求低。微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點平皿法：148微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點薄膜過濾法：操作復雜，設備要求高；不適用于無法溶解或粘稠度比較高的樣品；可進行大體積的檢驗量，檢驗靈敏度不受局限；樣品中的抑菌因素一般可被濾除；中和試劑可應用在供試品前處理或淋洗液中；分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯。微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點薄膜過濾法：149微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點最可能數(shù)法：

MPN法用于微生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。微生物限度檢查方法驗證方法的優(yōu)缺點最可能數(shù)法：150微生物限度檢查方法驗證供試液的制備

液體供試品；

固體、半固體或粘稠性供試品；

需用特殊方法制備供試液的供試品：非水溶性供試品；

膜劑供試品；

腸溶及結腸溶制劑供試品；氣霧劑、噴霧劑供試品；貼劑供試品微生物限度檢查方法驗證供試液的制備液體供試品；151微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：增加稀釋液或培養(yǎng)基體積：取規(guī)定量的供試液加入到較大量的培養(yǎng)基中，減少單位體積內的供試品含量，消除或降低抑菌作用。測定細菌、霉菌和酵母菌的菌數(shù)時，一般將1毫升供試液等量分注多個平皿培養(yǎng)計數(shù)。控制菌檢查時可加大增菌培養(yǎng)基的使用量。微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：增加稀釋液152微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：加入適宜的中和劑或滅活劑：最好在稀釋劑或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設中和劑或滅活劑對照組，即取相應量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。試驗菌株不能僅局限于驗證試驗菌株，而應當包括產品中可能污染的微生物。微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：加入適宜的153微生物限度檢查方法驗證常見干擾物的中和劑或滅活方法微生物限度檢查方法驗證常見干擾物的中和劑或滅活方法154微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、薄膜過濾法三種方法的2種或3種聯(lián)合使用。綜上所述，對于具有抑菌活性的供試品，為了消除供試品的抑菌性應盡量選擇操作簡便、快速的方法，同時所選用的方法應避免損傷供試品中污染的微生物。對于抑菌活性比較強的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過濾法。微生物限度檢查方法驗證具有抑菌活性的供試液的制備：增加稀釋液155微生物限度檢查方法驗證菌液制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯，培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)時間18～24小時，分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液。

將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯，培養(yǎng)溫度20～25℃，培養(yǎng)時間2～3天，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液。微生物限度檢查方法驗證菌液制備將大腸埃希菌、金黃色葡156微生物限度檢查方法驗證菌液制備將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，培養(yǎng)溫度20～25℃，培養(yǎng)時間5～7天，或直到獲得豐富的孢子。加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。微生物限度檢查方法驗證菌液制備將黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物157微生物限度檢查方法驗證驗證程序試驗組取制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu供試品對照組取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗微生物限度檢查方法驗證驗證程序試驗組供試品對照組菌液對照158微生物限度檢查方法驗證驗證程序平皿法-傾注法取制備好的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中,注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。微生物限度檢查方法驗證驗證程序平皿法-傾注法159微生物限度檢查方法驗證驗證程序平皿法-涂布法取胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，每一平皿表面接種制備好的供試液不少于0.1ml。按規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。微生物限度檢查方法驗證驗證程序平皿法-涂布法160微生物限度檢查方法驗證驗證程序薄膜過濾法取制備好的供試液適量，加至適量的稀釋液中,混勻,過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。微生物限度檢查方法驗證驗證程序薄膜過濾法161微生物限度檢查方法驗證驗證程序MPN法取照制備好的試驗組供試液至少3個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有9～10ml胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。接種管置30～35℃培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉種至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)1～2天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從檢索表中查對被測供試品每1g或每1ml中總需氧菌的最可能數(shù)。微生物限度檢查方法驗證驗證程序MPN法162微生物限度檢查方法驗證結果判斷薄膜過濾法或平皿法：試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.5～2范圍內。MPN法：試驗組菌數(shù)應在菌液對照組菌數(shù)95%置信限內。驗證試驗至少應進行三次獨立的平行實驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。若任一次試驗中試驗組的菌回收率不符合要求，應重新設計方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。微生物限度檢查方法驗證結果判斷薄膜過濾法或平皿法：試驗組菌163微生物限度檢查方法驗證控制菌檢查方法的驗證供試液的制備同計數(shù)方法驗證時的制備方法。試驗菌種包括：根據(jù)各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時,采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。微生物限度檢查方法驗證控制菌檢查方法的驗證供試液的制備同計164微生物限度檢查方法驗證菌液制備各菌液制備方法同微生物計數(shù)方法驗證中菌液制備內容。生孢梭菌菌液的制備：將生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下30～35℃培養(yǎng)48小時，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液微生物限度檢查方法驗證菌液制備各菌液制備方法同微生物165微生物限度檢查方法驗證驗證方法按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。采用薄膜過濾法時,取規(guī)定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下培養(yǎng)，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征微生物限度檢查方法驗證驗證方法按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液166微生物限度檢查方法驗證結果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查。若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性，應采用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。微生物限度檢查方法驗證結果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供167藥品QC微生物實驗室管理課件168藥品QC微生物實驗室管理藥品QC微生物實驗室管理169目錄微生物實驗室質量管理與保障USP微生物檢測技術精要培養(yǎng)基的質量控制和規(guī)范化操作菌種管理（保藏、傳代、分離和鑒定等）藥品微生物檢測分析方法的驗證目錄微生物實驗室質量管理與保障170第一部分微生物實驗室質量管理與保障第一部分微生物實驗室171目錄431概述及法規(guī)要求WHO微生物實驗室管理要求實例質量管理與保障管理2微生物實驗室的風險分析目錄431概述及法規(guī)要求WHO微生物實驗室管理要求實例172無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點藥品微生物的檢驗結果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實驗室規(guī)范要求進行。藥品微生物實驗室管理用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控制及質量保證。無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點藥品微生物的檢驗結果受很173無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點這決定了微生物檢驗質量保證的高要求。

藥品的無菌和微生物限度檢測是指按照一定的檢測程序和質量控制措施，確定要求無菌的樣品中是否存有活的或者不允許存在的微生物

（定性試驗——一次檢出不得復試），或者確定單位（g/ml）樣品中存在微生物的數(shù)量

（定量試驗）無菌檢查和微生物限度檢查的性質和特點這決定了微生物檢驗質量保174相關法規(guī)和指南相關法規(guī)2010年版《中國藥典》一部附錄XVIIIG2010年版《中國藥典》二部附錄XIXQUSP36版<1117>《MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICES》

WHOTechnicalReportSeries,No.961,2011Annex2《WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratories》FDA《藥品質量控制微生物實驗室檢查指南》相關法規(guī)和指南相關法規(guī)2010年版《中國藥典》一部附錄XVI175微生物實驗室的風險分析人員風險人員配置不足，不能準確及時完成崗位工作。培訓不足，工作人員不能按照SOP要求完成崗位工作。微生物實驗室的風險分析人員風險人員配置不足，不能準確及時完176微生物實驗室的風險分析環(huán)境風險環(huán)境潔凈度：環(huán)境未達標，檢驗室環(huán)境污染導致測試結果陽性。實驗室功能區(qū)設計不合理，污染無菌室。未對進入微生物實驗室的人員進行限制，造成實驗室污染。所用消毒劑管理不規(guī)范，未進行消毒效果驗證，不能有效保證潔凈區(qū)的微生物控制。微生物實驗室的風險分析環(huán)境風險環(huán)境潔凈度：環(huán)境未達標，檢驗室177微生物實驗室的風險分析檢測方法風險檢測方法的制定不符合法規(guī)要求。檢測方法未進行確認或驗證。微生物實驗室的風險分析檢測方法風險檢測方法的制定不符合法規(guī)要178微生物實驗室的風險分析設備風險用于實驗室的設備、儀器和其它裝置未按要求進行驗證和校準。用于實驗室的設備、儀器和其它裝置維護不足。實驗室的設備、儀器和其它裝置的監(jiān)控未按要求進行。微生物實驗室的風險分析設備風險用于實驗室的設備、儀器和其它裝179微生物實驗室的風險分析試液及培養(yǎng)基風險未對供應商進行審核，不能保證試液及培養(yǎng)基質量。未按照要求儲存條件進行儲存，對試液及培養(yǎng)基質量產生不良影響。試液及培養(yǎng)基的配制未進行監(jiān)控或驗證，對試液及培養(yǎng)基質量產生不良影響。未對試液及培養(yǎng)基進行質量檢查，不能保證試液及培養(yǎng)基質量。試液及培養(yǎng)基有效期管理不規(guī)范。微生物實驗室的風險分析試液及培養(yǎng)基風險未對供應商進行審核，不180微生物實驗室的風險分析菌種風險未對供應商進行審核，菌種質量不能保證。未按照要求儲存條件進行儲存，降低菌種活力。菌種操作（復蘇、傳代、保存）不規(guī)范，造成菌種污染和活力降低。未對保藏菌種進行質量檢查，不能保證菌種的純度及菌種特性。菌種使用有效期管理不規(guī)范。微生物實驗室的風險分析菌種風險未對供應商進行審核，菌種質量不181微生物實驗室的風險分析樣品管理風險取樣操作管理不規(guī)范，污染樣品。樣品傳遞、保存、分發(fā)不規(guī)范，對樣品中微生物產生不利影響或直接導致檢驗結果錯誤（如需陰涼存放的樣品，放在普通環(huán)境，導致樣品變質或被污染；分發(fā)錯誤，理化檢測的樣品用于微生物檢測）。物品：消毒、滅菌措施未經驗證，如滅菌釜溫度過高，培養(yǎng)基被破壞，微生物沒辦法真實表達出來，造成假陰性結果。消毒、滅菌后存放條件不合適或放置時間過長造成污染。微生物實驗室的風險分析樣品管理風險取樣操作管理不規(guī)范，污染樣182微生物實驗室的風險分析污物處理管理風險污染物質的處理過程不適當，造成環(huán)境和人員的污染。未按操作規(guī)程處理剩余樣品，特別是劇毒樣品、生物樣品，導致嚴重的環(huán)境污染，甚至對人員健康造成不良影響。（檢驗樣品、

有毒的溶液、用過的培養(yǎng)基、動物實驗動物及其排泄物）微生物實驗室的風險分析污物處理管理風險污染物質的處理過程不適183微生物實驗室的風險分析質量保證和質量控制風險實驗室未制定內部質量保證和質量控制體系