醫(yī)藥行業(yè)病毒載體專題報(bào)告

醫(yī)藥行業(yè)病毒載體專題報(bào)告1.病毒載體：最常用的基因遞送載體之一1.1病毒載體是通過(guò)改造病毒來(lái)遞送基因的常用工具病毒載體是一種常用的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入其他細(xì)胞進(jìn)行感染的分子機(jī)制。病毒是一種由核酸分子和蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞形態(tài)生物，能夠攜帶基因進(jìn)入受體細(xì)胞，經(jīng)開發(fā)和改造后可用作CGT載體。由于病毒的多樣性及宿主機(jī)體的高度復(fù)雜性，目前僅腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和溶瘤病毒等少數(shù)種類可改造為CGT載體。經(jīng)過(guò)改造且攜帶治療性基因的病毒，即重組病毒載體。通過(guò)改造后的病毒載體一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度，同時(shí)感染能力也得到了定向進(jìn)化，從而具備了更快捷、更廣譜的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，以及更安全、更特異的感染特性。病毒載體可通過(guò)受體配體識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)吞等多種途徑進(jìn)入細(xì)胞，并完成目的基因遞送。1.2病毒載體在基因治療和細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)有重要的地位在基因和細(xì)胞治療中，使用的載體可以分為病毒載體和非病毒載體；迄今為止，大多數(shù)基因療法利用病毒載體來(lái)傳遞目標(biāo)基因。據(jù)SamanthaL.Ginn綜述文章的統(tǒng)計(jì)，在1989-2017年間基因治療的所有臨床試驗(yàn)中，使用病毒載體的臨床占總數(shù)的67.3%。根據(jù)AnAnalysisOfTheGeneTherapyViralVectorLandscape，目前常用的病毒載體包括腺相關(guān)病毒（AAV）、慢病毒（LV）、仙臺(tái)病毒、腺病毒

（AdV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和溶瘤病毒等，相比于腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)說(shuō)，慢病毒載體和AAV載體安全性較好，二者在臨床試驗(yàn)中使用的數(shù)量也越來(lái)越多。非病毒載體主要有脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒，外泌體等。該類載體具有低免疫原型、低成本、易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性、靶向性等問(wèn)題還有待解決。2.細(xì)胞治療與基因治療（CGT）高速發(fā)展，助力病毒載體生產(chǎn)行業(yè)爆發(fā)病毒載體是細(xì)胞治療與基因治療的重要物料，而伴隨著細(xì)胞治療和基因治療的高速發(fā)展，病毒載體生產(chǎn)行業(yè)正在迎來(lái)重大利好。2.1細(xì)胞治療和基因治療迎來(lái)高速發(fā)展期CGT行業(yè)正準(zhǔn)備進(jìn)入快速發(fā)展階段，2015-2020年臨床試驗(yàn)數(shù)量復(fù)合年均增長(zhǎng)率超60%。根據(jù)弗若斯特沙利文2021年發(fā)布的報(bào)告中國(guó)細(xì)胞與基因治療發(fā)展白皮書，中國(guó)CGT臨床試驗(yàn)數(shù)量爆發(fā)式增長(zhǎng)，數(shù)量?jī)H次于美國(guó)，結(jié)合國(guó)家利好政策的推動(dòng)，CGT行業(yè)將進(jìn)入快速發(fā)展階段。自2015年開始，中國(guó)CGT療法的臨床試驗(yàn)數(shù)量快速增長(zhǎng)。2015年至2020年間，中國(guó)累計(jì)開展了約250項(xiàng)CGT臨床試驗(yàn)，已成為數(shù)量?jī)H次于美國(guó)的地區(qū)，復(fù)合年均增長(zhǎng)率超過(guò)60%，位列全球第一。截至2021年6月，中國(guó)正在開展的CGT臨床試驗(yàn)約100項(xiàng)，涉及大小公司約80家。CGT藥物全球商業(yè)化進(jìn)程持續(xù)加快，在研CGT臨床試驗(yàn)項(xiàng)目已近2000項(xiàng)。在技術(shù)、資本和政策的驅(qū)動(dòng)下，全球CGT行業(yè)快速升溫，大量CGT藥物研發(fā)進(jìn)入臨床階段，并自2015年起呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)。根據(jù)ASGCT（AmericanSocietyofGene+CellTherapy，美國(guó)權(quán)威的細(xì)胞和基因治療協(xié)會(huì)）的數(shù)據(jù)，截至2020年底，全球累計(jì)在研CGT臨床試驗(yàn)超過(guò)1,300項(xiàng)，到2022年第一季度末已達(dá)到1,986項(xiàng)。根據(jù)弗若斯特沙利文的統(tǒng)計(jì)，全球CGT行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模自2016年開始飛速增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)中國(guó)CGT行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模在政策利好及研發(fā)投入增長(zhǎng)的背景下也將快速擴(kuò)增。2025年全球整體市場(chǎng)規(guī)?；蚩傻?05億美元（復(fù)合年均增長(zhǎng)率71%），中國(guó)整體市場(chǎng)規(guī)模達(dá)29.5億美元（復(fù)合年均增長(zhǎng)率276%）。2016年至2020年，全球CGT市場(chǎng)規(guī)模從0.5億美元增至20.8億美元，復(fù)合年均增長(zhǎng)率約為153%。根據(jù)弗若斯特沙利文咨詢預(yù)測(cè)，未來(lái)CGT市場(chǎng)規(guī)模仍保持快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，預(yù)計(jì)于2025年全球整體市場(chǎng)規(guī)模為305.4億美元，2020年至2025年

（估計(jì)）全球CGT市場(chǎng)復(fù)合年均增長(zhǎng)率約為71%。2016年至2020年，中國(guó)CGT市場(chǎng)規(guī)模從0.02億美元增至0.03億美元，復(fù)合年均增長(zhǎng)率約為12%。根據(jù)弗若斯特沙利文咨詢預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)未來(lái)中國(guó)CGT市場(chǎng)規(guī)模仍保持快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，于2025年整體市場(chǎng)規(guī)模為25.9億美元，2020年至2025年（估計(jì)）中國(guó)CGT市場(chǎng)復(fù)合年均增長(zhǎng)率約為276%。2.2病毒載體的生產(chǎn)對(duì)CDMO產(chǎn)業(yè)依賴度高病毒載體的生產(chǎn)是細(xì)胞與基因治療CDMO市場(chǎng)最為關(guān)鍵的細(xì)分領(lǐng)域之一。CGT公司約八成為初創(chuàng)公司，與基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化聯(lián)系緊密，依賴CDMO提供產(chǎn)業(yè)化服務(wù)。根據(jù)ARM報(bào)告、弗若斯特沙利文分析，截至2020年12月31日，全球約500家CGT公司中，79.1%為初創(chuàng)公司；截至2021年7月20日，在中國(guó)CDE有產(chǎn)品臨床試驗(yàn)公示的48家CGT公司中，75.0%為初創(chuàng)公司。CGT初創(chuàng)新藥企業(yè)在藥物開發(fā)、臨床申報(bào)至商業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，由于受到工藝開發(fā)能力、GMP生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)、臨床申報(bào)相關(guān)法規(guī)知識(shí)的限制，更多依賴專業(yè)的CRO和CDMO。據(jù)和元生物招股書的數(shù)據(jù)，基因治療外包滲透率超過(guò)65%，遠(yuǎn)超傳統(tǒng)生物制劑的35%。全球CGTCDMO行業(yè)處于快速發(fā)展階段。根據(jù)和元生物招股書的數(shù)據(jù)，2016年至2020年，全球CGTCDMO市場(chǎng)規(guī)模從7.7億美元增至17.2億美元，復(fù)合年均增長(zhǎng)率達(dá)22.4%；預(yù)計(jì)到2025年，全球CGTCDMO市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到78.6億美元，2020年至2025年的復(fù)合年均增長(zhǎng)率將上升至35.5%。預(yù)計(jì)到2027年，全球范圍內(nèi)，歐美發(fā)達(dá)地區(qū)的CGTCDMO行業(yè)發(fā)展相對(duì)更為成熟，市場(chǎng)規(guī)模更大，行業(yè)格局更為成熟穩(wěn)定；目前市場(chǎng)參與者主要包括Lonza、Catalent、OxfordBioMedica、藥明康德等巨頭。國(guó)內(nèi)CGTCDMO行業(yè)經(jīng)過(guò)近年的穩(wěn)定增長(zhǎng)，即將邁入高速發(fā)展階段。2018年至2022年，預(yù)計(jì)中國(guó)CDMO市場(chǎng)規(guī)模將從8.7億元增長(zhǎng)到32.6億元，復(fù)合年均增長(zhǎng)率達(dá)39.3%；預(yù)計(jì)到2027年，市場(chǎng)規(guī)模將增至197.4億元，2022年至2027年的預(yù)期復(fù)合年均增長(zhǎng)率將高達(dá)43.3%。與歐美市場(chǎng)相比，當(dāng)前國(guó)內(nèi)CGTCDMO行業(yè)正處于發(fā)展初期，但近年來(lái)市場(chǎng)規(guī)?？焖贁U(kuò)大，增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好。國(guó)內(nèi)主要從事CGTCDMO業(yè)務(wù)的公司包括藥明康德子公司無(wú)錫生基醫(yī)藥、金斯瑞生物科技、博騰股份子公司博騰生物等。2.3病毒載體生產(chǎn)產(chǎn)能緊張，供不應(yīng)求病毒載體生產(chǎn)產(chǎn)能緊張，供不應(yīng)求。病毒載體外包率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)生物制劑，而下游產(chǎn)品型企業(yè)往往需要較長(zhǎng)的等待期。與此同時(shí)，病毒載體生產(chǎn)需要預(yù)留定金，這種在CDMO行業(yè)罕見的行為也顯示了其供不應(yīng)求的狀態(tài)。Catalent和ThermoFisher都有在產(chǎn)能還沒(méi)釋放時(shí)收到客戶提前支付的產(chǎn)能預(yù)留定金的情況，這在傳統(tǒng)的CDMO行業(yè)中是從未存在過(guò)的。目前該領(lǐng)域存在較大未被滿足的產(chǎn)能需求。2015年發(fā)表在NCBI的一篇文章估計(jì)，病毒載體的生產(chǎn)能力需要增加1-2個(gè)數(shù)量級(jí)才能滿足最終的商業(yè)需求。盡管自2015年以來(lái)產(chǎn)能明顯增長(zhǎng)，但自2015年以來(lái)飛快進(jìn)展的臨床項(xiàng)目也極大地增加了產(chǎn)能的需求。3.當(dāng)前使用最廣泛的兩種病毒載體：腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)是當(dāng)前使用最廣泛的兩種病毒載體，其中AAV常用于基因治療，LV常用于細(xì)胞治療。LV基因組長(zhǎng)度為9kB，有更強(qiáng)的嗜性，能夠感染非分裂細(xì)胞，同時(shí)在安全性上較逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)更安全；AAV基因組長(zhǎng)度為4.8kB，其宿主范圍極為廣泛，長(zhǎng)時(shí)程基因表達(dá)，治療效果持久，同時(shí)其免疫原性極低，肝毒性低，但包裝容量小，感染到表達(dá)的時(shí)間比較長(zhǎng)。3.1腺相關(guān)病毒載體：基因治療的萬(wàn)金油，廣泛用于體內(nèi)或全身基因治療3.1.1腺病毒載體1965年被發(fā)現(xiàn)，1995年第一次用于人類疾病治療腺相關(guān)病毒(AAV)最早于1965年首次在實(shí)驗(yàn)室的腺病毒制劑中被發(fā)現(xiàn)，隨后科學(xué)家對(duì)其進(jìn)行了多角度的研究。1982年成功完成了AAV2基因組的克隆以及測(cè)序工作。1995年，AAV載體首次用于治療人類的囊性纖維化病。進(jìn)入21世紀(jì)后，科研人員發(fā)現(xiàn)了更多不同的AAV血清型家族，豐富了AAV載體的選擇范圍。2008年，科研人員在治療萊伯氏先天性黑蒙癥時(shí)利用了基于AAV載體的基因療法，獲得了良好的成果。2012年，第一個(gè)基于AAV用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥LPLD的基因治療藥物Glybera獲得了歐洲藥品管理局EMA的批準(zhǔn)。5年后，治療由RPE65基因突變導(dǎo)致的遺傳性視網(wǎng)膜疾病的AAV基因治療產(chǎn)品Luxturna獲得美國(guó)食品藥品管理局FDA的批準(zhǔn)。3.1.2腺相關(guān)病毒是一種安全性較高的細(xì)小病毒，通過(guò)整合到人類基因組中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期潛伏AAV屬于細(xì)小病毒科依賴性細(xì)小病毒屬，它由一個(gè)直徑約26nm的二十面體蛋白質(zhì)衣殼和一個(gè)約4.8kb的單鏈DNA基因組組成，該基因組可以是正義鏈也可以是反義鏈。病毒衣殼由VP1、VP2和VP3三種亞基構(gòu)成，三種亞基的比例為1：

1：10，共60份拷貝。目前的普遍共識(shí)是AAV病毒不會(huì)引起人類疾病，安全性非常高。在人類細(xì)胞中，AAV基因組可以整合到一個(gè)被稱為AAVS1的基因組位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期潛伏。這一現(xiàn)象的部分原因是AAVS1位點(diǎn)的序列和ITR的序列有很大的相似性，位點(diǎn)的插入同樣需要rep基因編碼蛋白的活性，缺乏rep基因的重組AAV載體的基因組整合效率會(huì)大大降低。純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細(xì)胞，侵染細(xì)胞時(shí)，AAV與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而觸發(fā)AAV通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在核內(nèi)體、高爾基體等細(xì)胞器的協(xié)助下進(jìn)入細(xì)胞核，隨后病毒裂解，其單鏈DNA需復(fù)制成為雙鏈DNA后表達(dá)目的基因。3.1.3AAV載體改造策略：分型發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)及修飾為了將野生型AAV變成適合體內(nèi)基因遞送的重組型AAV載體，研究人員對(duì)其進(jìn)行了一系列的遺傳改造。重組型AAV載體的病毒衣殼依然沿用野生型AAV的序列與構(gòu)造，如完全剔除了rep基因和cap基因，僅僅保留有了負(fù)責(zé)引導(dǎo)病毒載體基因組復(fù)制和包裝的ITRs序列。與野生型AAV相比，這種改造在很大程度上提高了AAV載體的裝載量并極大程度上降低了體內(nèi)免疫原性和毒性。與AAV載體復(fù)制和裝配相關(guān)的rep、cap基因元件以及腺病毒輔助基因元件被分別克隆到其它質(zhì)粒載體上，這樣的設(shè)計(jì)允許利用多質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)大量制備科研或者臨床級(jí)別的重組AAV載體產(chǎn)品。3.1.4AAV載體的優(yōu)勢(shì)與面臨的挑戰(zhàn)AAV載體具有器官靶向性、安全性高以及長(zhǎng)效性等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在包裝容量小、感染到表達(dá)的時(shí)間比較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。重組的AAV2血清型病毒載體仍然處于主流位置。從2003-2019年的144項(xiàng)披露了AAV病毒衣殼數(shù)據(jù)的臨床試驗(yàn)中分析發(fā)現(xiàn)，重組的AAV2血清型仍然處于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性證據(jù)，截至2019年末已經(jīng)有超過(guò)40項(xiàng)使用AAV2病毒載體的臨床試驗(yàn)完成全部流程。利用組織特異性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)成為新趨勢(shì)。從104項(xiàng)披露了啟動(dòng)子數(shù)據(jù)的臨床試驗(yàn)中分析發(fā)現(xiàn)，像CBA、CAG和CMV等泛表達(dá)類的啟動(dòng)子依然受到研究者的廣泛青睞，而在2015-2019年間，超過(guò)25項(xiàng)臨床試驗(yàn)使用了組織特異性啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)特定組織的表達(dá)，例如白蛋白啟動(dòng)子和突觸蛋白啟動(dòng)子等。3.1.5基于AAV載體的基因治療臨床試驗(yàn)數(shù)量猛增截至2022年6月，在ClinicalT上登記了239項(xiàng)以AAV為載體的基因治療臨床試驗(yàn)。2016年-2022年6月，臨床以AAV為載體的基因治療試驗(yàn)數(shù)量增長(zhǎng)迅猛，從2016年的不足10個(gè)增至2018年11月的145個(gè)，再到2022年6月進(jìn)一步提升至239個(gè)。盡管臨床試驗(yàn)中所用最多的是基于AAV2血清型的載體，但是新的血清型如AAV8、AAV9也在不斷被用于臨床試驗(yàn)。大多臨床試驗(yàn)通過(guò)進(jìn)行I/II期合并臨床試驗(yàn)以加速研發(fā)進(jìn)程。以AAV為載體的基因治療主要靶向眼、肝、肌肉和腦部，其中尤以靶向眼部疾病的臨床試驗(yàn)數(shù)量為多，占比約21%。3.1.6AAV載體生產(chǎn)方式主要有三種，基于Sf9細(xì)胞的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的重要方法在AAV載體的生產(chǎn)中，目前主流的方法主要有三種：1、基于HEK293細(xì)胞的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)；2、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞系；3、基于夜蛾昆蟲細(xì)胞(Sf9)的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。1、HEK293三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工藝的方法是研究級(jí)與臨床前使用的AAV載體的主要生產(chǎn)方式；HEK293三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中的質(zhì)粒分別有：含ITRs和目的基因的順式質(zhì)粒、含rep和cap基因的反式質(zhì)粒、提供E2a/b、E4和VARNA基因的Ad輔助質(zhì)粒三種質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞（表達(dá)E1a和E1b基因）來(lái)生產(chǎn)AAV載體。此方法中細(xì)胞通常以半貼壁的方式培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后2-3天達(dá)到最高生產(chǎn)力，隨著時(shí)間的推移失去活力。2、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞系：上世紀(jì)90年代，Clark等人將rep/cap和AAV載體基因組克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，并使其穩(wěn)定感染Hela細(xì)胞，首次建立了基于Hela的生產(chǎn)細(xì)胞系。近來(lái)開發(fā)的混合rAAV/rAd載體，將轉(zhuǎn)基因載體和腺病毒元件同時(shí)遞送，從而使穩(wěn)定整合的AAV基因在Hela細(xì)胞系中獲得rep-cap的高表達(dá)。穩(wěn)定細(xì)胞系生產(chǎn)可以消除常規(guī)生產(chǎn)中的外來(lái)輔助污染物（如外源性病毒、質(zhì)粒污染物等）。但是穩(wěn)轉(zhuǎn)株內(nèi)的基因產(chǎn)物可能組裝成雜質(zhì)，造成潛在的安全隱患。3、桿狀病毒/Sf9系統(tǒng)是在錐體夜蛾昆蟲細(xì)胞(Sf9)中使用桿狀病毒表達(dá)載體(BEV)來(lái)生產(chǎn)AAV病毒載體。該方法是利用攜帶AAV載體基因組的BEV感染Sf9細(xì)胞。由于桿狀病毒具有輔助功能，BEV系統(tǒng)與Sf9細(xì)胞系結(jié)合可以穩(wěn)定表達(dá)，用于高滴度的大規(guī)模載體生產(chǎn)。3.2慢病毒載體：體外基因修飾細(xì)胞治療（含CAR-T療法）最常用的載體3.2.1慢病毒載體是基因治療和CAR-T細(xì)胞治療的重要物料慢病毒載體（LVs）是傳遞遺傳物質(zhì)最常用的轉(zhuǎn)移載體之一，也是改造造血細(xì)胞以糾正原發(fā)性免疫缺陷、血紅蛋白病和白血病的首選載體。慢病毒載體也被廣泛用于修改T細(xì)胞以通過(guò)免疫療法治療癌癥（如嵌合抗原受體T細(xì)胞療法，CART）。在基因組編輯中，LV被用來(lái)傳遞序列特異性設(shè)計(jì)核酸酶和DNA模板。3.2.2LVs載體的前身是HIV-1，具有免疫原性低、安全性高等多重優(yōu)點(diǎn)慢病毒（Lentivirus）載體是一種單鏈RNA病毒，是以人類免疫缺陷型病毒

（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的CGT載體，能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞。慢病毒可以將外源片段隨機(jī)插入細(xì)胞基因組，因此可以在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)目的基因，同時(shí)慢病毒載體具有表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是重要的基因操作工具。慢病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。3.2.3四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工藝是LV載體生產(chǎn)的最常用方式，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞系可能是未來(lái)工業(yè)大規(guī)模連續(xù)過(guò)程的理想系統(tǒng)HIV維持生存的基本基因包括gag、pol和env基因；gag編碼結(jié)構(gòu)蛋白，pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，env編碼病毒包膜糖蛋白。LV的構(gòu)建基于野生型HIV-1病毒。為了避免有復(fù)制能力病毒（RCV）的產(chǎn)生，在構(gòu)建HIV-1型病毒載體時(shí)一般將HIV-1基因組分裝于幾個(gè)質(zhì)粒載體中，再共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后獲得只有一次感染能力而無(wú)復(fù)制能力的HIV-1載體顆粒。四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工藝（第三代系統(tǒng)）是目前用于研發(fā)和臨床的最多的系統(tǒng)。該系統(tǒng)由1個(gè)包含目的基因的表達(dá)質(zhì)粒、2個(gè)包裝質(zhì)粒、1個(gè)包膜蛋白質(zhì)粒，共4個(gè)質(zhì)粒組成。包裝構(gòu)建體在此系統(tǒng)中被進(jìn)一步拆分，gag-pro-pol和rev基因被分離在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒中。包膜蛋白質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒的糖蛋白G基因（VSVG）替代了病毒原有的env基因。應(yīng)用了VSV-G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體，擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，同時(shí)也增加了載體的穩(wěn)定性。四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，極大地降低了產(chǎn)生具有復(fù)制能力慢病毒的可能性，而VSV-G蛋白的使用也降低了這種重組的可能性。更新的第四代系統(tǒng)通過(guò)密碼子優(yōu)化，對(duì)rev蛋白（促進(jìn)晚期基因轉(zhuǎn)錄的因子）的需求也被取消。但是滴度較低，應(yīng)用尚少。穩(wěn)定包裝細(xì)胞系提供了可重復(fù)的和可擴(kuò)展的生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)降低了成本，且由于降低了病毒表達(dá)載體之間的重組概率，生產(chǎn)的安全性也得到了提升。其可擴(kuò)展性還可以適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)體系。所以在慢病毒生產(chǎn)中穩(wěn)定包裝細(xì)胞系的應(yīng)用是要優(yōu)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的，雖然建立慢病毒生產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞系也存在諸多困難，特別是一些病毒蛋白對(duì)細(xì)胞具有顯著毒性，但這依然是行業(yè)未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向。4.病毒載體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，擴(kuò)大培養(yǎng)與純化是難點(diǎn)4.1病毒載體生產(chǎn)工藝總覽病毒載體生產(chǎn)分為上游（生產(chǎn)）工藝（USP）和下游（純化）工藝（DSP）；

上游生產(chǎn)工藝包括：細(xì)胞復(fù)蘇→細(xì)胞擴(kuò)增→接種、轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)→收獲；

下游包括：純化→濃縮→制劑→灌裝、包裝；4.2上游工藝之細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)——成熟貼壁培養(yǎng)與前景廣闊的懸浮培養(yǎng)在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)方面，目前廣泛使用的是從實(shí)驗(yàn)室研究中沿襲下來(lái)的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)技術(shù)，被用于生產(chǎn)大約70%的病毒載體產(chǎn)品。AAV和LV載體生產(chǎn)最常用的是使用貼壁培養(yǎng)的人胚胎HEK293細(xì)胞。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞以單層形式附著在基質(zhì)上生長(zhǎng)。而在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞在培養(yǎng)基中自由漂浮。貼壁培養(yǎng)常常被用于生產(chǎn)小劑量的病毒，操作簡(jiǎn)單，可滿足部分工業(yè)需求。但是在大規(guī)模生產(chǎn)中也有處理復(fù)雜、容易污染、培養(yǎng)條件控制與檢測(cè)困難等問(wèn)題。微載體培養(yǎng)技術(shù)在一定程度上解決了貼壁細(xì)胞的部分缺點(diǎn)，工藝放大相對(duì)容易。而懸浮無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使得AAV生產(chǎn)的工藝放大更為容易，為AAV下游純化減少了負(fù)擔(dān)。4.3上游關(guān)鍵工藝之轉(zhuǎn)染——高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與長(zhǎng)期性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染是指是將目的基因轉(zhuǎn)染至特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法。目前工業(yè)生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)染方式主要有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，外源基因并沒(méi)有轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的染色體上而是存在于游離的載體上，這樣可以在短時(shí)間內(nèi)獲得基因的表達(dá)產(chǎn)物，但是隨著細(xì)胞的不斷分裂增殖外源基因最終會(huì)丟失，無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行重組蛋白的生產(chǎn)；而利用細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則會(huì)將外源基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞染色體上，目的基因不會(huì)隨著細(xì)胞傳代而消失，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的生產(chǎn)目的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各有優(yōu)缺點(diǎn)，需要按照實(shí)際場(chǎng)景而使用：

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染多用于貼壁細(xì)胞系，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染多用于懸浮細(xì)胞系。大部分瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體的生產(chǎn)使用貼壁性細(xì)胞系，其中所選培養(yǎng)容器需要有利于它們附著、生長(zhǎng)和生產(chǎn)病毒載體的表面。而穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系通常是適應(yīng)懸浮的細(xì)胞系，不需要基質(zhì)附著、生長(zhǎng)和生產(chǎn)病毒載體。因此，需要在臨床開發(fā)的早期就要確定CGT所需的目標(biāo)劑量和患者群體，以指導(dǎo)選擇最優(yōu)載體生產(chǎn)平臺(tái)，從而滿足未來(lái)的商業(yè)化需求。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染工藝成熟，使用廣泛；與穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系相比，基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的病毒生產(chǎn)相關(guān)的工藝開發(fā)時(shí)間相對(duì)較短，生物制藥行業(yè)已經(jīng)有多家成熟的供應(yīng)商，擁有高效瞬時(shí)轉(zhuǎn)染類載體生產(chǎn)需要的各種工具。同時(shí)可保持長(zhǎng)期穩(wěn)定生產(chǎn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染工藝也逐步被產(chǎn)業(yè)重視。使用穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系的載體生產(chǎn)方法雖然相對(duì)較新，不過(guò)其有很大潛力可支撐行業(yè)不斷增長(zhǎng)的產(chǎn)量需求。4.4除雜提純是下游工藝的關(guān)鍵（1）下游純化工藝的一般過(guò)程。下游純化工藝方案通常采用相似的工作流程：

①澄清步驟（由于收獲時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞裂解，可能需要額外進(jìn)行深層過(guò)濾）②純化步驟（通常采用離子交換法或親和層析法）③精純步驟（額外的層析法步驟/尺寸排阻）。（2）控制污染物與雜質(zhì)是下游工藝的核心關(guān)注點(diǎn)。下游純化所面臨的主要挑戰(zhàn)是：如何在最大程度提高產(chǎn)量的同時(shí)，滿足產(chǎn)品與雜質(zhì)的質(zhì)量規(guī)范。去除產(chǎn)品中的污染物，將其雜質(zhì)控制在監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)許可的范圍之內(nèi)，是下游工藝最關(guān)注的技術(shù)細(xì)節(jié)。4.5下游工藝改進(jìn)依然存在諸多潛力點(diǎn)（1）細(xì)胞裂解是從細(xì)胞中釋放病毒載體的重要環(huán)節(jié)，目前主要使用的是機(jī)械裂解和化學(xué)裂解，前者會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品損失，后者使用的細(xì)胞破膜劑存在安全性問(wèn)題，新的細(xì)胞裂解方法的開發(fā)對(duì)于工藝優(yōu)化意義重大。（2）過(guò)濾：過(guò)濾是AAV下游處理中最昂貴的單元操作。過(guò)濾過(guò)程中的大滯留量和產(chǎn)品損失是一個(gè)棘手的問(wèn)題。如何優(yōu)化過(guò)濾器以實(shí)現(xiàn)高通量回收是工藝優(yōu)化中的一大挑戰(zhàn)，連續(xù)過(guò)濾技術(shù)或可提供優(yōu)化方案。（3）平臺(tái)純化：由于缺乏穩(wěn)健的純化過(guò)程，目前的下游操作導(dǎo)致病毒回收率非常低。且對(duì)于不同亞型的AAV需要不同的純化方法，提高了平臺(tái)的復(fù)雜性。行業(yè)需要一種平臺(tái)純化工藝，可用于各種病毒載體，并盡量減少純化過(guò)程中的操作步驟。同時(shí)選擇性捕獲雜質(zhì)的新型樹脂也將極大地有助于獲得高純度產(chǎn)品。（4）安全且高效地分離空衣殼的方法是下游工藝改進(jìn)的一大重點(diǎn)。載體生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生空衣殼?？找職た赡軙?huì)影響AAV載體產(chǎn)品的功效和安全性，是最終產(chǎn)成品中需要去除的雜質(zhì)。但空衣殼與完整衣殼具有相似的大小及電荷量，分離仍具有挑戰(zhàn)性。兩種廣泛使用的分離方法是氯化銫和陰離子交換色譜法(AEX)。但依然有會(huì)產(chǎn)生刺激性物質(zhì)，擴(kuò)展性差，工藝難度大等問(wèn)題。5.病毒載體生產(chǎn)成本及拆分—價(jià)值千金的質(zhì)粒DNAAAV載體與LV載體的生產(chǎn)均有多種基于不同反應(yīng)容器的生產(chǎn)工藝，不同工藝的成本構(gòu)成存在一定的差異，使得在不同的生產(chǎn)規(guī)模下，成本最低的路線不盡相同。一般而言，生產(chǎn)規(guī)模越大，原材料成本占比越高。另外，常用的兩種病毒載體的生產(chǎn)原料均包括質(zhì)粒DNA（三質(zhì)粒/四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工藝等），而且質(zhì)粒DNA在生產(chǎn)成本中是占比最高的原料，符合GMP要求的質(zhì)粒DNA價(jià)格達(dá)每克數(shù)萬(wàn)美元，在商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模下在不同工藝中占生產(chǎn)成本的18%-46%。5.1質(zhì)粒質(zhì)粒是基因工程中最常見的DNA載體工具，是一種小型環(huán)狀DNA分子，常見于原核細(xì)菌和真菌內(nèi)，可以獨(dú)立于宿主染色體進(jìn)行自主復(fù)制、并穩(wěn)定遺傳所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒大小一般為1kb-20kb，可以置換或插入外源DNA將目的基因帶入宿主細(xì)胞，而且因?yàn)樗拗髟思?xì)菌生長(zhǎng)快，可以快速擴(kuò)增。5.1.1用途廣泛，身兼數(shù)職隨著細(xì)胞與基因治療的崛起，研發(fā)管線數(shù)量迅速擴(kuò)增，對(duì)質(zhì)粒DNA的需求量急劇增加，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量提出了更高的要求。根據(jù)在CGT中的用途，質(zhì)粒DNA可以分為藥物活性成分和藥物生產(chǎn)原料兩類。質(zhì)粒是病毒載體生產(chǎn)的關(guān)鍵原料，涉及病毒載體的實(shí)驗(yàn)室研究、藥物臨床試驗(yàn)的質(zhì)粒需求量一般在毫克級(jí)，商業(yè)化生產(chǎn)的需求量則為克級(jí)。以AAV載體生產(chǎn)為例，根據(jù)文獻(xiàn)研究，在最佳質(zhì)?！拗骷?xì)胞比例下，1.6μg的質(zhì)粒在懸浮反應(yīng)體系中生產(chǎn)的AAV載體滴度最高達(dá)到了7.64*109vg/ml（gc/ml等同于vg/ml，即VectorGenomespermL），對(duì)應(yīng)2.3*1011vg的AAV載體。一般基因治療的劑量單位為1014vg，已獲批上市的基因治療藥物ZOLGENSMA用量為1.1*1014vg/kg，以此為基準(zhǔn)則一單位劑量的基因治療產(chǎn)品約需要0.8mg的質(zhì)粒DNA。5.1.2質(zhì)粒大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)具有較高壁壘目前質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)一般基于大型不銹鋼生物反應(yīng)器中使用大腸桿菌發(fā)酵的方法，盡管質(zhì)粒的GMP生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)成熟，但商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)仍具有較高的技術(shù)壁壘。質(zhì)粒生產(chǎn)流程涉及質(zhì)粒構(gòu)建、菌株庫(kù)構(gòu)建、發(fā)酵及純化等多個(gè)步驟，生產(chǎn)流程長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜難控、容錯(cuò)率低，操作不當(dāng)會(huì)使得整批產(chǎn)品報(bào)廢。上游發(fā)酵生產(chǎn)中的工藝參數(shù)如培養(yǎng)基成分、溫度、PH、接種密度、補(bǔ)料速度、生長(zhǎng)速率等均需嚴(yán)格控制，此外GMP生產(chǎn)對(duì)于最終質(zhì)粒產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量、DNA雜質(zhì)等含量均有嚴(yán)格規(guī)定。整體而言，質(zhì)粒DNA的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)對(duì)工藝水平、生產(chǎn)能力等有較高的要求。5.1.3質(zhì)粒DNA外包生產(chǎn)行業(yè)內(nèi)代表公司在質(zhì)粒外包生產(chǎn)領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)代表公司有金斯瑞、藥明生基、博騰生物、和元生物等。5.2AAV載體AAV的上游生產(chǎn)工藝包括傳統(tǒng)的基于多層托盤的貼壁工藝（MT）與基于懸浮工藝的攪拌生物反應(yīng)器及固定床生物反應(yīng)器，有研究對(duì)上述三種生產(chǎn)裝置在200L1000L生產(chǎn)規(guī)模下的的成本進(jìn)行了計(jì)算和比較。結(jié)果顯示，在生產(chǎn)規(guī)模為200L時(shí)，單批可生產(chǎn)12單位劑量的AAV載體（單位劑量為1014vg，對(duì)應(yīng)年產(chǎn)能600劑），貼壁工藝和懸浮工藝的單位劑量成本（包括上游和下游步驟）沒(méi)有差別，均為2.5萬(wàn)美元，而固定床工藝單位成本為2.1萬(wàn)美元。當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模提升到1000L（對(duì)應(yīng)一批次60劑，滿產(chǎn)一年約3000劑）時(shí)，貼壁工藝為1.5萬(wàn)美元，懸浮工藝為1.2萬(wàn)美元，固定床工藝為0.8萬(wàn)美元。進(jìn)一步的支出分析表明，懸浮和固定床工藝的資本和勞動(dòng)力成本相當(dāng)，而貼壁工藝的成本在臨床規(guī)模（200L）上與懸浮和固定床工藝接近。當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模達(dá)到1000L時(shí)，貼壁工藝的勞動(dòng)力成本會(huì)顯著上升，而懸浮及固定床工藝幾乎沒(méi)有變化?？傮w而言，若使用基于一次性耗材的固定床工藝代替懸浮工藝，可以使得生物反應(yīng)器的USP運(yùn)營(yíng)費(fèi)用降低30%至40%，生物反應(yīng)器的占地面積也可減少60%。5.3LVs載體有研究對(duì)比分析了若干種制備慢病毒載體在不同生產(chǎn)規(guī)模下的生產(chǎn)成本，工藝包括多層容器（標(biāo)準(zhǔn)的十層容器CF10）、中空纖維反應(yīng)器（HF）、微載體生物反應(yīng)器（RMmc）、一次性攪拌罐生物反應(yīng)器（SUB）、固定床生物反應(yīng)器（FB），上述五種生產(chǎn)工藝均符合cGMP標(biāo)準(zhǔn)，其中基于一次性攪拌罐生物反應(yīng)器的生產(chǎn)工藝在各種場(chǎng)景的生產(chǎn)規(guī)模中下單位成本均為最低，其次是微載體生物反應(yīng)器和固定床生物反應(yīng)器，多層容器和中空纖維反應(yīng)器由于上游生產(chǎn)過(guò)程中一次性組件價(jià)格昂貴，導(dǎo)致其成本最高。對(duì)原材料成本進(jìn)一步拆分顯示，在產(chǎn)量為1000劑/年的(2×109TU/劑)的情況下，對(duì)于多層容器（CF10）和纖維反應(yīng)器（HF）這類生產(chǎn)規(guī)模小（L級(jí)）、多應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、臨床研究等場(chǎng)景的工藝而言，USP一次性組件成本占主導(dǎo)地位

（多層容器為34%，纖維反應(yīng)器為82%）。而對(duì)于固定床（FB333）、微載體

（RMmc600）及攪拌罐（SUB500）生物反應(yīng)器等生產(chǎn)規(guī)模更大（可擴(kuò)展至百L級(jí)）、更適用于載體商業(yè)化生產(chǎn)的工藝而言，質(zhì)粒DNA的成本占比最高，占比分別為41%、46%和36%。6.病毒載體相關(guān)產(chǎn)業(yè)監(jiān)管日趨完善，多項(xiàng)利好政策密集出臺(tái)6.1病毒載體生產(chǎn)受藥監(jiān)局與衛(wèi)健委監(jiān)管，從準(zhǔn)入、研發(fā)、注冊(cè)、生產(chǎn)到上市的全流程具有完整的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)入門檻高病毒載體生產(chǎn)所在的CGT研發(fā)和生產(chǎn)外包服務(wù)行業(yè)屬于國(guó)家發(fā)改委頒布的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整