人教版教學(xué)課件名校聯(lián)盟江蘇省懷仁中學(xué)高二生物12基因工程的基本操作程序課件

1.2基因工程的基本操作程序1/4/20231原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì),能調(diào)控遺傳信息表達(dá)1/4/20232真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子外顯子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列1/4/20233非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子終止子啟動(dòng)子原核真核基因的結(jié)構(gòu)1/4/20234原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼1/4/20235山西省孝義市第二中學(xué)基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過(guò)程目的基因的檢測(cè)與鑒定1/4/202361/4/20237目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因的獲取供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子1/4/20238獲得目的基因的方法

從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.什么是基因文庫(kù)？2.怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫(kù)：部分基因文庫(kù)：(如cDNA文庫(kù))基因的核苷酸序列等利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因人工合成含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA未知序列基因較小已知序列已知序列1/4/202391.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！诵?.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建1/4/202310質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——核心同一種(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.過(guò)程:1/4/202311

科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:1/4/202312基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因1/4/202313(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)1/4/202314方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1/4/202315(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交1/4/202316①直接分離法:用限制酶切成許多片斷2.構(gòu)建基因文庫(kù)將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。1/4/202317①直接分離法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶分別與載體連接受體細(xì)胞分別導(dǎo)入2.構(gòu)建基因文庫(kù)1/4/202318mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA）DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄法：2.構(gòu)建基因文庫(kù)1/4/202319cDNA合成過(guò)程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。1/4/202320基因組文庫(kù)：一般針對(duì)原核生物的基因，因?yàn)榛蛏俨糠只蛭膸?kù)：一般針對(duì)真核生物的基因，如cDNA文庫(kù)文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小小大基因中啟動(dòng)子無(wú)有基因中內(nèi)含子無(wú)有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種之間的基因交流可以部分基因可以說(shuō)明基因文庫(kù)的組建過(guò)程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫(kù)中獲取目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法1/4/202321依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。3．如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？1/4/202322利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。1/4/202323①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修1P60聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1/4/202324⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈1/4/2023251/4/202326利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1/4/202327山西省孝義市第二中學(xué)PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈1/4/202328PCR技術(shù)DNA復(fù)制過(guò)程DNA變性（90～95℃）→退火（復(fù)性55~60℃）→子鏈延伸（70~75℃）→重復(fù)循環(huán)DNA復(fù)制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同點(diǎn)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)條件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同點(diǎn)解旋方式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開(kāi)解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場(chǎng)所體外主要在細(xì)胞核中引物DNARNA酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1/4/202329目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：1/4/2023302.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：1/4/202331目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化1/4/2023321/4/202333如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。1/4/202334細(xì)胞類型常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)受精卵將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵→受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物微生物細(xì)胞Ca2+處理法原核細(xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w的方法1/4/202335

目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)步驟目的方法原理工具現(xiàn)象1DNA分子雜交技術(shù)堿基互補(bǔ)配對(duì)放射性同位素作標(biāo)記的含目的基因的DNA片段雜交帶2檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNADNA分子雜交技術(shù)堿基互補(bǔ)配對(duì)放射性同位素作標(biāo)記的含目的基因的DNA片段雜交帶3檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交抗體的專一性特定抗體雜交帶(陽(yáng)性反應(yīng))檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因1/4/202336尋根問(wèn)底——為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。1/4/202337尋根問(wèn)底：將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，結(jié)果會(huì)怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物中的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭(zhēng)議頗多，嚴(yán)格來(lái)講不算基因工程。1/4/202338思考與探究：1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；1/4/202339（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。1/4/202340思考與探究2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。1/4/2023413.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。思考與探究：1/4/202342（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。（3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。（4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。4.β-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？1/4/2023432、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫(kù)中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄