蛋白質(zhì)組學(xué)廣州中醫(yī)藥大學(xué)課程課件_第1頁(yè)
蛋白質(zhì)組學(xué)廣州中醫(yī)藥大學(xué)課程課件_第2頁(yè)
蛋白質(zhì)組學(xué)廣州中醫(yī)藥大學(xué)課程課件_第3頁(yè)
蛋白質(zhì)組學(xué)廣州中醫(yī)藥大學(xué)課程課件_第4頁(yè)
蛋白質(zhì)組學(xué)廣州中醫(yī)藥大學(xué)課程課件_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩93頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

Proteome&ProteomicsProteome&Proteomics1Proteome&Proteomics定義Proteome:1994年,由澳大利亞Macguarie大學(xué)的Wilkins等首先提出:“蛋白質(zhì)組指的是一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”(proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome)“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個(gè)字母“prote”和基因組一詞的后幾個(gè)字母“ome”拼接而成蛋白質(zhì)組(Proteome):細(xì)胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)Proteome&Proteomics定義Proteo2Proteomics定義蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)最早是在1995年提出的,它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征:表達(dá)水平(量)翻譯后的修飾(成熟與調(diào)控)蛋白與蛋白相互作用(信號(hào)通路)等由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生,細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)Proteomics定義蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,研3Proteome與Genome關(guān)系互補(bǔ)的角度/空間來研究細(xì)胞的分子架構(gòu)相輔相成Genome導(dǎo)演 RNome編劇 Proteome演員Proteome與Genome關(guān)系互補(bǔ)的角度/空間來研究4Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性Proteome靜態(tài)Genome動(dòng)態(tài)修飾化程度Proteome高Genome底復(fù)雜程度Proteome高(20aa+高度多樣性修飾)Genome底(4nt)特異性Proteome組織和細(xì)胞特異性Genome無組織和細(xì)胞特異性Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性5功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)1997年,由Cordwell和Humphery-Smith提出的,它指的是在特定時(shí)間、特定環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件下基因組活躍表達(dá)的蛋白質(zhì)。功能蛋白質(zhì)組只是總蛋白質(zhì)組的一部分,通過對(duì)功能蛋白質(zhì)組的研究,既能闡明某一群體蛋白質(zhì)的功能,亦能豐富總蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),是從生物大分子(蛋白質(zhì)、基因)水平到細(xì)胞水平研究的重要橋梁環(huán)節(jié)。功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)1996功能蛋白質(zhì)組功能蛋白質(zhì)組7蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具8蛋白質(zhì)組研究相關(guān)網(wǎng)站蛋白質(zhì)組學(xué)研究依賴生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)、信息等發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用(新藥開發(fā))蛋白質(zhì)組研究相關(guān)企業(yè)、各種儀器來源、新聞等teome.co.uk各種蛋白質(zhì)組研究相關(guān)信息http://www.micromass.co.uk介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進(jìn)儀器http://www.expasy.ch

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),SwissInstituteofBioinformatics.au

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),AustralianProteomeAnalysisFacilityhttp://expasy.cbr.nrc.ca

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),CanadianBioinformaticsResours蛋白質(zhì)組研究相關(guān)網(wǎng)站蛋白質(zhì)組學(xué)研究依賴生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)9主要專業(yè)術(shù)語(yǔ)及其英文對(duì)照和縮寫IPG-IEF:固相pH梯度等電聚焦(immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing)SDS-PAGE:十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis)2-DE:雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC:高效液相色譜(HighperformanceLiquidChromatography)MALDI-TOFMS:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要專業(yè)術(shù)語(yǔ)及其英文對(duì)照和縮寫IPG-IEF:固相pH梯度等10研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程基于凝膠的工作流程 (Gel-basedworkflow)基于液相色譜的工作流程 (LC-basedworkflow)研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程11蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件12雙向凝膠電泳(2DE)是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進(jìn)行等電聚焦電泳(按照pI分離)然后再進(jìn)行SDS(按照分子大小)凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖雙向凝膠電泳(2DE)是等電聚焦電泳和SDS的組合13蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS:樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色(銀染)及圖譜分析目標(biāo)蛋白獲取及其鑒定(MC分析)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS:142DE結(jié)果圖譜2DE結(jié)果圖譜15蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備(預(yù)處理):組織細(xì)胞細(xì)胞器(線粒體、葉綠體、細(xì)胞核)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備(預(yù)處理)16蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性:在制備時(shí)丟失的蛋白永遠(yuǎn)不能在后面實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)把蛋白質(zhì)看作具有獨(dú)特而奇妙性質(zhì)的實(shí)體原則:使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾(如酶性或化學(xué)性降解等)完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性:17蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟:破碎沉淀蛋白去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟:18蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機(jī)械法(超聲波法、高壓法、機(jī)械勻漿法)化學(xué)法(去污劑法、酶裂解法)物理法(液氮研磨法、循環(huán)凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程19蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵

TCA-丙酮沉淀法

三氯醋酸(TCA)沉淀法–引起降解/修飾丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–影響IEF醋酸銨沉淀法–步驟繁瑣

蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程202D電泳結(jié)果影響因素分析2D電泳結(jié)果影響因素分析21蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程去除雜質(zhì)

關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除(DNase/Rnase)多糖的清除(超離心、TCA沉淀等)去污劑的清除(丙酮沉淀法等)鹽離子和外源帶電小分子的清除(透析、TCA-丙酮沉淀法)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程222D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:樣品含高豐度Pr可能原因:TCA殘留致使Pr丟失2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:樣品含高豐度Pr可能原因:232D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:Tris質(zhì)量不好可能原因:Urea不純2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:Tris質(zhì)量不好可能原因:24蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項(xiàng):蛋白質(zhì)水解蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)(核糖體)、極端分子量)樣品定量重復(fù)性蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項(xiàng):252D-SDS重復(fù)性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2D-SDS重復(fù)性Thesameprotoco262-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中,在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后,各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上,形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點(diǎn)信息2-DE第一向IPG-IEF電泳27IEF的基本條件step1step2step3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min---Linear400040002hr------10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmstep1step2step3totaltotalstep1step2step311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr------------------20,000V-hr40,000V-hr~30,000V-hr~50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapidIEF的基本條件step1step2step3tota28IPG-IEF電泳IPG-IEF電泳292-DE第二向垂直SDS電泳聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物,從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異,電泳速度僅與分子量有關(guān)

從而得知其分子量信息2-DE第二向垂直SDS電泳30第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍31第二向垂直SDS電泳步驟:溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED)灌膠電泳EttanDalttwelve電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳步驟:EttanDaltt32第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電332-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)染色:

1)考馬斯亮蘭染色法;

2)銀染法;3)負(fù)染法;4)熒光染色法;5)放射性同位素標(biāo)記法等2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)染色:342-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像掃描和分析——ImageScannerII2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像掃描和分析——Image352-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)(EttanSpotPicker)

2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)(Ettan362-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)質(zhì)譜或MALDI-TOFMS質(zhì)譜分析基本原理是使試樣中各組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子,經(jīng)加速電場(chǎng)的作用,形成離子束,進(jìn)入質(zhì)量分析器,利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散——離子束中速度較慢的離子通過電場(chǎng)后偏轉(zhuǎn)大,速度快的偏轉(zhuǎn)??;在磁場(chǎng)中離子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉(zhuǎn),即速度慢的離子依然偏轉(zhuǎn)大,速度快的偏轉(zhuǎn)?。划?dāng)兩個(gè)場(chǎng)的偏轉(zhuǎn)作用彼此補(bǔ)償時(shí),它們的軌道便相交于一點(diǎn)。與此同時(shí),在磁場(chǎng)中還能發(fā)生質(zhì)量的分離,這樣就使具有同一質(zhì)荷比而速度不同的離子聚焦在同一點(diǎn)上,不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點(diǎn)上,將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖,從而確定其質(zhì)量。2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)質(zhì)譜或MALDI-TOFMS372-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)MALDI-TOFMS樣品溶于固定的底物中形成晶體,用激光脈沖使其離子化,離子被加速后通過飛行管時(shí)分離,所有離子均可被檢測(cè),常用來測(cè)蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)MALDI-TOFMS382-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)通過質(zhì)譜分析,可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息SARS病毒N蛋白整體分子量2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)通過質(zhì)譜分析,可以獲得分析樣品39蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)40蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)酵母雙雜交蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)酵母雙雜交41蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)Co-IP技術(shù)蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)Co-IP技術(shù)42蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)Co-IP&Pulldown蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)Co-IP&Pulldown43蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中

的現(xiàn)狀和前景蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中

的現(xiàn)狀和前景44蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究直腸癌: Sanchez等對(duì)15例結(jié)腸癌和13例正常人的結(jié)腸上皮進(jìn)行2-DE。建立了包括882和861個(gè)斑點(diǎn)的結(jié)腸癌及正常人結(jié)腸粘膜的標(biāo)準(zhǔn)膠圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量為13kD和pI值為5.6處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。經(jīng)鑒定為:鈣粒蛋白B(calgranulinB)及鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin)

蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究45蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究肝癌醛糖還原酶膀胱癌醛糖還原酶、Trp-tRNA合成酶、IFN-γ誘導(dǎo)的r3,SOD及35.8kD和11.2kD兩未知蛋白擴(kuò)張型心肌病8種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究46蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景致病微生物的蛋白質(zhì)組研究檢測(cè)博氏疏螺旋體與免疫有關(guān)的蛋白質(zhì)弓形體抗原的檢測(cè)白色念珠菌對(duì)真菌細(xì)胞壁蛋白分析篩選抗藥真菌藥物蛋白質(zhì)組在醫(yī)學(xué)研究中的現(xiàn)狀和前景致病微生物的蛋白質(zhì)組研究47蛋白質(zhì)組學(xué)研究趨勢(shì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究趨勢(shì)48蛋白質(zhì)組學(xué)研究趨勢(shì)在應(yīng)用研究方面 蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一在技術(shù)發(fā)展方面研究方法將更強(qiáng)調(diào)各種方法間的整合和互補(bǔ),以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉互動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究趨勢(shì)在應(yīng)用研究方面 49Proteome&ProteomicsProteome&Proteomics50Proteome&Proteomics定義Proteome:1994年,由澳大利亞Macguarie大學(xué)的Wilkins等首先提出:“蛋白質(zhì)組指的是一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”(proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome)“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個(gè)字母“prote”和基因組一詞的后幾個(gè)字母“ome”拼接而成蛋白質(zhì)組(Proteome):細(xì)胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)Proteome&Proteomics定義Proteo51Proteomics定義蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)最早是在1995年提出的,它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征:表達(dá)水平(量)翻譯后的修飾(成熟與調(diào)控)蛋白與蛋白相互作用(信號(hào)通路)等由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生,細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)Proteomics定義蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,研52Proteome與Genome關(guān)系互補(bǔ)的角度/空間來研究細(xì)胞的分子架構(gòu)相輔相成Genome導(dǎo)演 RNome編劇 Proteome演員Proteome與Genome關(guān)系互補(bǔ)的角度/空間來研究53Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性Proteome靜態(tài)Genome動(dòng)態(tài)修飾化程度Proteome高Genome底復(fù)雜程度Proteome高(20aa+高度多樣性修飾)Genome底(4nt)特異性Proteome組織和細(xì)胞特異性Genome無組織和細(xì)胞特異性Proteome與Genome區(qū)別穩(wěn)定性54功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)1997年,由Cordwell和Humphery-Smith提出的,它指的是在特定時(shí)間、特定環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件下基因組活躍表達(dá)的蛋白質(zhì)。功能蛋白質(zhì)組只是總蛋白質(zhì)組的一部分,通過對(duì)功能蛋白質(zhì)組的研究,既能闡明某一群體蛋白質(zhì)的功能,亦能豐富總蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),是從生物大分子(蛋白質(zhì)、基因)水平到細(xì)胞水平研究的重要橋梁環(huán)節(jié)。功能蛋白質(zhì)組(functionalproteome)19955功能蛋白質(zhì)組功能蛋白質(zhì)組56蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具57蛋白質(zhì)組研究相關(guān)網(wǎng)站蛋白質(zhì)組學(xué)研究依賴生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)、信息等發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用(新藥開發(fā))蛋白質(zhì)組研究相關(guān)企業(yè)、各種儀器來源、新聞等teome.co.uk各種蛋白質(zhì)組研究相關(guān)信息http://www.micromass.co.uk介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進(jìn)儀器http://www.expasy.ch

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),SwissInstituteofBioinformatics.au

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),AustralianProteomeAnalysisFacilityhttp://expasy.cbr.nrc.ca

蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),CanadianBioinformaticsResours蛋白質(zhì)組研究相關(guān)網(wǎng)站蛋白質(zhì)組學(xué)研究依賴生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)58主要專業(yè)術(shù)語(yǔ)及其英文對(duì)照和縮寫IPG-IEF:固相pH梯度等電聚焦(immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing)SDS-PAGE:十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis)2-DE:雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC:高效液相色譜(HighperformanceLiquidChromatography)MALDI-TOFMS:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要專業(yè)術(shù)語(yǔ)及其英文對(duì)照和縮寫IPG-IEF:固相pH梯度等59研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程基于凝膠的工作流程 (Gel-basedworkflow)基于液相色譜的工作流程 (LC-basedworkflow)研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程60蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件61雙向凝膠電泳(2DE)是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進(jìn)行等電聚焦電泳(按照pI分離)然后再進(jìn)行SDS(按照分子大?。┠z經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖雙向凝膠電泳(2DE)是等電聚焦電泳和SDS的組合62蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS:樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色(銀染)及圖譜分析目標(biāo)蛋白獲取及其鑒定(MC分析)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS:632DE結(jié)果圖譜2DE結(jié)果圖譜64蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備(預(yù)處理):組織細(xì)胞細(xì)胞器(線粒體、葉綠體、細(xì)胞核)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備(預(yù)處理)65蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性:在制備時(shí)丟失的蛋白永遠(yuǎn)不能在后面實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)把蛋白質(zhì)看作具有獨(dú)特而奇妙性質(zhì)的實(shí)體原則:使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾(如酶性或化學(xué)性降解等)完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性:66蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟:破碎沉淀蛋白去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟:67蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機(jī)械法(超聲波法、高壓法、機(jī)械勻漿法)化學(xué)法(去污劑法、酶裂解法)物理法(液氮研磨法、循環(huán)凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程68蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵

TCA-丙酮沉淀法

三氯醋酸(TCA)沉淀法–引起降解/修飾丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–影響IEF醋酸銨沉淀法–步驟繁瑣

蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程692D電泳結(jié)果影響因素分析2D電泳結(jié)果影響因素分析70蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程去除雜質(zhì)

關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除(DNase/Rnase)多糖的清除(超離心、TCA沉淀等)去污劑的清除(丙酮沉淀法等)鹽離子和外源帶電小分子的清除(透析、TCA-丙酮沉淀法)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程712D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:樣品含高豐度Pr可能原因:TCA殘留致使Pr丟失2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:樣品含高豐度Pr可能原因:722D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:Tris質(zhì)量不好可能原因:Urea不純2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因:Tris質(zhì)量不好可能原因:73蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項(xiàng):蛋白質(zhì)水解蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)(核糖體)、極端分子量)樣品定量重復(fù)性蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項(xiàng):742D-SDS重復(fù)性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2D-SDS重復(fù)性Thesameprotoco752-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中,在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后,各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上,形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點(diǎn)信息2-DE第一向IPG-IEF電泳76IEF的基本條件step1step2step3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min---Linear400040002hr------10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmstep1step2step3totaltotalstep1step2step311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr------------------20,000V-hr40,000V-hr~30,000V-hr~50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapidIEF的基本條件step1step2step3tota77IPG-IEF電泳IPG-IEF電泳782-DE第二向垂直SDS電泳聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物,從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異,電泳速度僅與分子量有關(guān)

從而得知其分子量信息2-DE第二向垂直SDS電泳79第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍80第二向垂直SDS電泳步驟:溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED)灌膠電泳EttanDalttwelve電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳步驟:EttanDaltt81第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電822-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)染色:

1)考馬斯亮蘭染色法;

2)銀染法;3)負(fù)染法;4)熒光染色法;5)放射性同位素標(biāo)記法等2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)染色:832-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像掃描和分析——ImageScannerII2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像掃描和分析——Image842-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)(EttanSpotPicker)

2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)(Ettan852-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)質(zhì)譜或MALDI-TOFMS質(zhì)譜分析基本原理是使試樣中各組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子,經(jīng)加速電場(chǎng)的作用,形成離子束,進(jìn)入質(zhì)量分析器,利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散——離子束中速度較慢的離子通過電場(chǎng)后偏轉(zhuǎn)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論