高效利用磷酸鈣和卵磷脂功能的細(xì)菌菌株篩選,農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)論文

高效利用磷酸鈣和卵磷脂功能的細(xì)菌菌株篩選,農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)論文溶磷菌在轉(zhuǎn)化土壤難溶磷、提高磷肥利用率、促進(jìn)作物生長(zhǎng)方面都具有顯著作用,而不同溶磷菌對(duì)不同形態(tài)難溶磷的溶解能力存在差異。溶解難溶性磷酸鹽的細(xì)菌主要有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、沙雷氏菌(Serratia)、腸桿菌(Enterobacter)和伯克霍爾德氏菌(Burkholde-ria)等,溶磷量最高可達(dá)643.2mg/L;而溶解有機(jī)磷的細(xì)菌主要有芽孢桿菌(Bacillus),溶磷量到達(dá)26.5mg/L。溶磷菌溶磷機(jī)制各不一樣,大部分溶磷菌以分泌物溶磷,其胞外分泌物中含有多種溶磷物質(zhì),近年來(lái)的研究主要集中在有機(jī)酸和磷酸酶方面。研究表示清楚,大部分溶磷微生物的胞外分泌物中含有大量有機(jī)酸,所以一致以為有機(jī)酸是主要的溶磷物質(zhì);另外微生物生長(zhǎng)繁衍經(jīng)過(guò)中,分泌出酸性磷酸酶和堿性磷酸酶,這些磷酸酶能夠不斷地將環(huán)境中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷。蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等物質(zhì)在環(huán)境中可能會(huì)溶解難溶磷,這些物質(zhì)可能也與溶磷菌的溶磷效果有關(guān),但當(dāng)前此方面研究較少。為此,本研究從生活垃圾堆積地采集土樣,挑選兼具高效利用磷酸鈣和卵磷脂功能的細(xì)菌菌株,并測(cè)定其在不同磷源培養(yǎng)下胞外分泌物中的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸含量及酸性磷酸酶活性,以期為高效溶磷菌的挑選及其溶磷機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方式方法1.1土樣供試土樣取自生活垃圾堆積地非根際土壤。1.2難溶磷培養(yǎng)基葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、KCl0.3g、MgSO47H2O0.3g、FeSO47H2O0.03g、MnSO41.0g、Ca3(PO4)25.0g或卵磷脂2.0g、無(wú)菌水1L,pH值7.0~7.5。1.3溶磷菌的挑選和溶磷能力的測(cè)定將采集的土樣用稀釋平板法涂布于難溶磷卵磷脂培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)5d,挑選周圍產(chǎn)生明顯透明圈的單菌落劃線純化后保存于LB固體斜面培養(yǎng)基上。用滅過(guò)菌的牙簽將挑選出的菌株分別點(diǎn)接在2種難溶磷固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)5d,挑選在2種難溶磷固體平板上均能產(chǎn)生明顯透明圈的單菌落,并測(cè)量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)。挑選D/d或D值較大的菌株,按1%接種量分別接入2種難溶磷液體培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)6d(30℃、150r/min)。發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心10min,用鉬銻抗比色法測(cè)定上清中可溶性磷含量,選擇溶磷量最大的菌株進(jìn)行鑒定。1.4溶磷菌的鑒定1.4.1生理生化鑒定參照文獻(xiàn)[12]對(duì)溶磷菌分別進(jìn)行生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)、厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)。1.4.216SrDNA分析采用DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取細(xì)菌基因組DNA,利用16SrDNA通用引物(P1:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3P2:5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反響條件:95℃5min;30個(gè)循環(huán)(94℃1min,55℃1min,72℃2min);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)回收,連接pSURE-T載體后測(cè)序。利用Blast將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已經(jīng)知道序列進(jìn)行比對(duì)分析,采用Mega5.05軟件以鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。1.5溶磷菌胞外分泌物中溶磷物質(zhì)含量及活性測(cè)定將活化好的菌株按1%接種量分別接種于以磷酸鈣、卵磷脂、磷酸氫二鉀(對(duì)照)為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng),分別于第2、4、6天取培養(yǎng)液以8000r/min離心10min,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。分別利用酸堿滴定法、茚三酮顯色法、蒽酮法、DNS法及考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定上清液中的有機(jī)酸、氨基酸、總糖、單糖及蛋白質(zhì)含量,利用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法測(cè)定上清液中酸性磷酸酶的活性。2結(jié)果與分析2.1溶磷菌株的分離、挑選初篩出32個(gè)能夠溶解卵磷脂的菌株。將這些菌株點(diǎn)接于2種難溶磷固體平板上,有10株菌株在平板上構(gòu)成明顯透明圈,講明這10株菌株都具有降解卵磷脂和磷酸鈣的能力。華而不實(shí),菌株LY4、LY8、LY12、LY25在卵磷脂培養(yǎng)基上的D/d值較大,均大于3.0;LY7、LY8、LY10、LY25在磷酸鈣培養(yǎng)基上的D/d值較大,均大于2.0。2.2溶磷菌溶磷能力分析綜合考慮D、D/d值,挑選菌株LY4、LY7、LY8、LY10、LY12、L25進(jìn)行液體搖瓶復(fù)篩試驗(yàn),以確定不同菌株對(duì)不同難溶磷源的溶解能力。由表1可知,對(duì)于卵磷脂,LY4的溶磷量最大,到達(dá)28.2mg/L;LY8次之,為26.6mg/L。對(duì)于磷酸鈣,LY8的溶磷量最大,到達(dá)647.8mg/L;LY10次之,為625.4mg/L。綜合考慮對(duì)卵磷脂和磷酸鈣的溶解能力,選擇LY8菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)?！颈?】2.3菌株LY8的初步鑒定菌株LY8能在5~40℃條件下生長(zhǎng),接觸酶和苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)為陽(yáng)性,能水解明膠、淀粉,V-P試驗(yàn)為陰性,能利用檸檬酸鹽,可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖產(chǎn)酸,在糖類中生長(zhǎng)不產(chǎn)氣,厭氧環(huán)境下不能生長(zhǎng)。菌株LY8的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1560bp,利用Blast進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),其與Bacillusar-yabhattai(HF570067.1)、Bacillusmegaterium(AB334764.1)和Bacillussubtilis(EU257453.1)的同源性均到達(dá)99%。將華而不實(shí)與菌株LY8類似性較高的9種菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特征,初步確定LY8為宏大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。2.4菌株LY8胞外分泌物中的溶磷物質(zhì)分析2.4.1有機(jī)酸有機(jī)酸是一類酸性有機(jī)化合物,能夠解離出游離的H+,H+與PO3-4結(jié)合構(gòu)成可溶性H2PO-4和HPO2-4鹽,同時(shí)有機(jī)酸根離子能夠與Fe3+、Al3+、Ca2+結(jié)合進(jìn)而釋放無(wú)機(jī)磷。由圖2能夠看出,貧磷條件下發(fā)酵液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于富磷條件,尤其是在磷酸鈣條件下,這與伊鋆的研究結(jié)果一致。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),有機(jī)酸質(zhì)量濃度微弱增加。華而不實(shí),以磷酸鈣為磷源時(shí),發(fā)酵液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度最大可到達(dá)34.3g/L;以卵磷脂為磷源時(shí),發(fā)酵液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度有所下降,最大到達(dá)11.2g/L。講明有機(jī)酸是菌株LY8的溶磷物質(zhì),尤其是溶解磷酸鈣的主要物質(zhì)。2.4.2酸性磷酸酶磷酸酶可水解有機(jī)磷化合物釋放出無(wú)機(jī)磷。在貧磷條件下,酸性磷酸酶活性明顯提高(圖3)。華而不實(shí),以卵磷脂為磷源時(shí),發(fā)酵液中酸性磷酸酶活性最高達(dá)4100mol/(gh);而以磷酸鈣為磷源時(shí),發(fā)酵液中酸性磷酸酶活性稍有下降,最高為2760mol/(gh)。所以,酸性磷酸酶是菌株LY8的溶磷物質(zhì),尤其是溶解卵磷脂的主要物質(zhì)。而鐘傳青等研究發(fā)現(xiàn),與可溶性磷和無(wú)機(jī)難溶磷相比,P4和Y3菌株在溶解有機(jī)磷時(shí),發(fā)酵液中磷酸酶活性較低,與本研究結(jié)果不一致。所以,酸性磷酸酶可能不是所有溶磷菌株溶解有機(jī)磷必須的物質(zhì)。另外,由圖3可知,酸性磷酸酶活性在LY8菌株培養(yǎng)2d后即到達(dá)最大,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),其活性明顯下降,這可能是由于酶的活性受培養(yǎng)溫度等條件的影響,所以磷酸酶的酶解作用主要發(fā)生在溶磷菌溶磷初期。2.4.3多糖由圖4可知,3種磷源條件下,菌株LY8均可分泌一定數(shù)量的多糖,但以卵磷脂為磷源時(shí),發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度明顯高于其他2種磷源,最高達(dá)到160.0mg/L,講明多糖可能也是菌株LY8溶解卵磷脂的重要物質(zhì)。2.4.4蛋白質(zhì)由圖5能夠看出,3種磷源條件下,菌株均可分泌一定數(shù)量的蛋白質(zhì),且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度逐步下降。華而不實(shí),以卵磷脂為磷源時(shí),培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度明顯高于其他2種磷源,最高到達(dá)47.8mg/L,講明蛋白質(zhì)可能也是菌株LY8溶解卵磷脂的重要物質(zhì)。2.4.5氨基酸Liba等研究固氮細(xì)菌溶磷時(shí)發(fā)現(xiàn),溶磷的主要分泌物為氨基酸。而本研究結(jié)果表示清楚,3種磷源條件下,菌株均能分泌一定數(shù)量的氨基酸,且沒(méi)有明顯差異(圖6),講明氨基酸與菌株LY8的溶磷能力關(guān)系不大。3結(jié)論通過(guò)初篩和復(fù)篩得到1株高效兼溶無(wú)機(jī)磷(磷酸鈣)和有機(jī)磷(卵磷脂)的溶磷菌LY8,其在2種難溶磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d后水溶性磷含量分別到達(dá)647.8mg/L和26.6mg/L。結(jié)合生理生化試驗(yàn)并經(jīng)過(guò)16SrDNA序列分析,初步確定LY8為宏大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。貧磷條件促進(jìn)LY8菌株分泌有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多糖和酸性磷酸酶,但在不同難溶磷源條件下其分泌的主要溶磷物質(zhì)不同。對(duì)于無(wú)機(jī)難溶磷磷酸鈣,LY8菌株分泌的主要溶磷物質(zhì)是有機(jī)酸,其次是磷酸酶;而對(duì)于有機(jī)難溶磷卵磷脂,LY8菌株分泌的主要溶磷物質(zhì)是磷酸酶,另外其分泌的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和多糖可能也具有一定的溶磷效果,但蛋白質(zhì)和多糖是缺磷脅迫誘導(dǎo)溶磷菌產(chǎn)生的,還是溶磷經(jīng)過(guò)中所必需的物質(zhì),需要進(jìn)一步研究。以下為參考文獻(xiàn):[1]胡曉峰.溶磷菌的挑選、溶磷條件優(yōu)化及對(duì)玉米的促生作用研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.[2]蔣欣梅,夏秀華,于錫宏,等.微生物解磷菌肥對(duì)大棚茄子生長(zhǎng)及土壤有效磷利用的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2020,39(6):685-688.[3]余旋,朱天輝,