評(píng)價(jià)布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果,免疫學(xué)論文

評(píng)價(jià)布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果,免疫學(xué)論文布氏菌病〔Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病〕是布氏菌引起的能夠在人和動(dòng)物中傳播的一類人獸共患病。布氏菌具有侵襲力強(qiáng)、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點(diǎn)。家畜感染后假如得不到良好的治療可引發(fā)母畜流產(chǎn)和不育，人感染則主要引起波浪熱和轉(zhuǎn)化為慢性感染。據(jù)調(diào)查，全球已有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有布病發(fā)生和流行。而我們國(guó)家28個(gè)省市區(qū)的人、畜有布病存在和流行，每年造成近千萬(wàn)元損失。疫苗接種是防治布病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。布氏疫苗主要包括滅活苗、減毒活疫苗、菌體組分疫苗以及如今熱門(mén)研究的基因疫苗和重組蛋白疫苗等。當(dāng)前，我們國(guó)家采用的人用布氏菌活疫苗為牛種弱毒株104M菌株，接種方式為皮上劃痕。該方式方法操作復(fù)雜、不能定量接種，人群接種陽(yáng)轉(zhuǎn)率低，保衛(wèi)效果有限，被接種者因劃痕產(chǎn)生疼痛而不易被接受，進(jìn)而影響疫苗的廣泛使用。鑒于布病疫情控制的需要，我們采用具有經(jīng)濟(jì)性好和安全性高的皮內(nèi)注射接種方式替代傳統(tǒng)的皮上劃痕。本次研究以小鼠為動(dòng)物模型，采用皮內(nèi)注射方式免疫，從體液免疫、細(xì)胞免疫和保衛(wèi)力試驗(yàn)三個(gè)方面的結(jié)果全面評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性和免疫保衛(wèi)效果。1、材料與方式方法1.1主要材料1.1.1動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c小鼠，6~8周，白色雌性，共30只，由中國(guó)食品藥品檢定研究院〔簡(jiǎn)稱中檢院〕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK〔京〕2018-0017，飼養(yǎng)于中檢院清潔級(jí)動(dòng)物室。1.1.2菌種皮下注射用布氏菌活疫苗及羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器Bio-II-A生物安全柜購(gòu)自西班牙Telstar公司；Dragon-MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭Labsystems公司；DH6000AB型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自天津市泰斯特儀器公司；高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀購(gòu)于美國(guó)CTL公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Napco公司；加樣槍購(gòu)于Gilson公司。1.1.4試劑耗材牛血清白蛋白和ConA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠IFN-酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；達(dá)優(yōu)-淋巴細(xì)胞分離液、無(wú)血清培養(yǎng)基、IFN-及IL-4ELISA預(yù)包被試劑盒均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)公司；堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a購(gòu)自美國(guó)Bethyl公司；pNPP底物顯色液購(gòu)自美國(guó)SurModics公司。1.2方式方法1.2.1動(dòng)物分組及免疫將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為低劑量組〔5107/只〕，高劑量組〔2108/只〕，生理鹽水對(duì)照組，3組均為后肢皮下注射，劑量為0.2ml/只。1.2.2動(dòng)物血清和脾臟淋巴細(xì)胞的制備免疫4周后，對(duì)每只小鼠進(jìn)行摘眼球取血，分離血清，20℃保存，用于ELISA體液免疫檢測(cè)。將每只動(dòng)物無(wú)菌取出的脾臟放在篩網(wǎng)上，滴加淋巴細(xì)胞分離液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15ml離心管中，滴加200~500l達(dá)優(yōu)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行低速梯度離心，在25℃條件下，800g離心30min，吸出淋巴細(xì)胞層，參加10ml無(wú)血清培養(yǎng)基，顛倒洗滌，室溫、250g離心收集細(xì)胞，用于ELISPOT細(xì)胞免疫的檢測(cè)。1.2.3體液免疫檢測(cè)1.2.3.1抗菌體抗原總IgG抗體水平檢測(cè)用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清IgG的效價(jià)。以滅活布氏菌體5108/ml的濃度包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；以TBS-T300l洗板5次，用1%的BSA封閉〔200l/孔〕，37℃靜置1h；每孔參加100l的50開(kāi)場(chǎng)倍比稀釋的待檢血清，37℃靜置1h；按1:1000倍稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，洗板后100l/孔參加，37℃靜置1h；洗板，參加100l/孔的pNPP底物顯色液，室溫避光30min后參加100l/孔終止液〔3mol/LNaOH〕終止反響；在波長(zhǎng)為405nm處檢測(cè)吸光值A(chǔ)405。1.2.3.2抗菌體抗原IgG抗體亞類檢測(cè)以滅活布氏菌體5108/ml的濃度包被96孔酶標(biāo)板，小鼠免疫4周后血清為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a為二抗，其余操作步驟同1.2.3.1。1.2.4細(xì)胞免疫檢測(cè)1.2.4.1分泌IFN-、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)目檢測(cè)小鼠免疫4周后，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加混有2.0106個(gè)/ml濃度細(xì)胞100l，每孔分別參加100l布氏PPD抗原〔終濃度為5g/ml和10g/ml〕和滅活菌體抗原〔終濃度為1108/ml和1107/ml〕。每種抗原刺激物做復(fù)孔，另用細(xì)胞培養(yǎng)液作陰性對(duì)照，一孔加ConA作陽(yáng)性對(duì)照〔終濃度為5g/ml〕。共同孵育16h后，按ELISPOT操作依次參加檢測(cè)抗體等試劑，洗板，顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。1.2.4.2體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子產(chǎn)生水平檢測(cè)取48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加2.0106個(gè)/ml濃度細(xì)胞400l，每孔分別參加50l布氏PPD抗原〔終濃度為5g/ml和10g/ml〕和滅活菌體抗原〔終濃度為1108/ml和1107/ml〕。分別以ConA〔終濃度為5g/ml〕和培養(yǎng)基為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育18h，孵育完畢對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心，取各孔細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用小鼠IFN-、IL-4ELISA試劑盒檢測(cè)體外不同刺激物刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-、IL-4的情況。1.2.5布氏菌活苗保衛(wèi)力檢測(cè)在小鼠免疫4周后，各組取5只小鼠，對(duì)每只小鼠皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5108cfu/只，4周后無(wú)菌取脾臟，通過(guò)脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)布氏活苗的免疫保衛(wèi)作用。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xs表示，各組動(dòng)物的效價(jià)取以10為底的對(duì)數(shù)后進(jìn)行t檢驗(yàn)；用GraphPadPrism6繪圖及SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1小鼠血清中抗菌體抗原總IgG水平測(cè)定。小鼠血清用間接ELISA方式方法測(cè)抗體水平，結(jié)果顯示，陰性組小鼠檢測(cè)不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測(cè)出，但低劑量組抗體水平略高于高劑量組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔t=1.890，P=0.0950.05，n=10〕，結(jié)果見(jiàn)圖1。2.2抗菌體抗原抗體亞類測(cè)定抗體亞類分析結(jié)果顯示免疫組小鼠均產(chǎn)生特異性IgG1、IgG2a抗體，兩者的水平相近，結(jié)果見(jiàn)圖2。2.3ELISOPT結(jié)果將已構(gòu)成斑點(diǎn)的96孔板終止反響，自然風(fēng)干過(guò)夜后上機(jī)計(jì)數(shù)并拍照，對(duì)每孔內(nèi)的斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控。最終斑點(diǎn)計(jì)數(shù)顯示低劑量組和高劑量組在不同濃度的PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌IFN-、IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。2.4體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果利用ELISA方式方法檢測(cè)以PPD抗原〔5g/ml，10g/ml〕和滅活菌體抗原〔1108/ml，1107/ml〕體外刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-、IL-4水平。結(jié)果顯示，在不同濃度PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌的IFN-的含量明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕，結(jié)果見(jiàn)圖5。IL-4含量很低，達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)限，結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5布氏菌活苗免疫保衛(wèi)力結(jié)果為評(píng)價(jià)布氏菌活疫苗的保衛(wèi)力，用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊免疫動(dòng)物，以脾臟布氏菌分離數(shù)為指標(biāo)，評(píng)價(jià)保衛(wèi)力，結(jié)果見(jiàn)圖6。低劑量免疫組小鼠脾臟的細(xì)菌載量與陰性對(duì)照組比擬有顯著性差異〔t=4.406，P0.05，n=9〕，高劑量免疫組小鼠脾臟的細(xì)菌載量與陰性對(duì)照組比擬有顯著性差異〔t=3.842，P0.05，n=8〕。講明小鼠免疫布氏菌活苗獲得很好的免疫保衛(wèi)。3、討論機(jī)體對(duì)布氏菌的去除依靠于體液免疫和細(xì)胞免疫的聯(lián)合作用。體液免疫產(chǎn)生的抗體在細(xì)胞外能夠阻斷布氏菌與宿主細(xì)胞間互相作用，并將其包裹起來(lái)抑制菌體釋放內(nèi)毒素；在胞內(nèi)阻止細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁衍。本試驗(yàn)以低、高劑量免疫布氏活疫苗，檢測(cè)免疫4周后血清抗體，結(jié)果顯示，低劑量組和高劑量組小鼠可檢測(cè)到高滴度特異性抗體，低、高劑量組IgG效價(jià)幾何均數(shù)分別為459、229。由此可見(jiàn)，產(chǎn)生特異性抗體滴度比擬低，講明體液免疫水平相對(duì)較弱?？贵w亞類分析結(jié)果顯示免疫組小鼠均產(chǎn)生特異性IgG1、IgG2a抗體，兩者抗體水平相近。布氏菌是胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫對(duì)殺滅布氏菌起關(guān)鍵作用。布氏菌感染宿主后被APC提呈給吞噬細(xì)胞，同時(shí)激發(fā)APC分泌IL-12、IL-4細(xì)胞因子，引起Th0細(xì)胞〔CD4+〕分別分化Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌IFN-激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能，介入細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-4細(xì)胞因子主要介入體液免疫。本研究，分別用ELISOPT和ELISA方式方法對(duì)不同濃度的PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌IFN-和IL-4脾淋巴細(xì)胞數(shù)目和含量進(jìn)行檢測(cè)。ELISOPT結(jié)果顯示，與陰性組比擬，實(shí)驗(yàn)組在不同濃度的兩種刺激物下分泌IFN-、IL-4脾淋巴細(xì)胞數(shù)目均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ELISA結(jié)果顯示，與陰性組比擬，實(shí)驗(yàn)組在不同濃度的兩種刺激物體外刺激分泌IFN-含量有顯著差異，IL-4含量很低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分講明布氏菌疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)〔CD4+〕向Th1細(xì)胞的分化，機(jī)體主要以細(xì)胞免疫為主。疫苗的效力測(cè)定實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)疫苗免疫保衛(wèi)性最可靠指標(biāo)。傳統(tǒng)對(duì)布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠，效力實(shí)驗(yàn)用強(qiáng)毒株攻擊，本次研究參照(中國(guó)藥典〕效力測(cè)定的方式方法，以小鼠為動(dòng)物模型，羊布氏菌M5弱毒株攻擊，大大提高了實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性和安全性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟的細(xì)菌載量