T-SHZSAQS 00161-2022 生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)

ICS65.020.30CCSB40團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/SHZSAQS00161—2022生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)2022-11-09發(fā)布 2022-11-09實(shí)施石河子市質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) 發(fā)布T/SHZSAQS 00161—2022T/SHZSAQS 00161—2022PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II1范引文件 1語(yǔ)定義 1黃葡球菌 1時(shí)量合鏈應(yīng) 1112器備試劑 2器設(shè)備 22定黃葡球物與針明 2增因 2增物 2物用明 2針明 2的段 3控粒 3驗(yàn)法 3品備 3板備 3驗(yàn)驟 3果定 4員護(hù) 4意項(xiàng) 4前 言本文件參照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。張?jiān)?、何開兵、張靜、郭嘉、趙天藝、何白雪、張夢(mèng)琦。T/SHZSAQS 00161—2022T/SHZSAQS 00161—2022PAGEPAGE4生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)范圍本文件規(guī)定了生鮮乳中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的術(shù)語(yǔ)與定義及儀器設(shè)備和試劑、鑒定金黃色葡萄球菌引物與探針說(shuō)明、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定、人員防護(hù)、注意事項(xiàng)等。適用于生鮮乳中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489 驗(yàn)生物全用求GB/T27401 實(shí)質(zhì)量制范NY/T541 物病實(shí)室驗(yàn)樣YY/T1173 合鏈反分儀JJF1527 金黃色葡萄球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，不含芽胞和鞭毛，是微球菌科葡萄球菌屬細(xì)菌。在顯微鏡下呈葡萄串狀。PCR（QuantitativeReal-timeDNADNA應(yīng)用化學(xué)方法合成一對(duì)與已知擴(kuò)增基因片段兩側(cè)DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸，作為PCR擴(kuò)增的片段。待擴(kuò)增的靶DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作、校準(zhǔn)方法均參考YY/T1173聚合酶鏈反應(yīng)分析儀和JJF1527-201聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范。:1.5mLPCRTipPCR（10μL～1000μL）DNAAceQUniversalU+ProbeMasterMixV2。金黃色葡萄球EbpS基因（GenBank:U48826.2）。EbpS-F:TTCTGGCAAGGTGAATAACTCGACEbpS-R:GCACTATTACTTGCTGCGCCTEbpS-Probe:TCGGTGCTGGAACAGCAGGTTTGGCT引物EbpS-F、EbpS-R、EbpS-Probe在使用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋成濃度為10umol/L。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)EbpS基因設(shè)計(jì)TaqMan探針，探針5’端標(biāo)記為：6-FAM（6-羧基熒光素）；探針3’端標(biāo)記為：BHQ1（熒光標(biāo)記多肽）。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段134bp。EbpS-pMD-19-T-DH5α大腸桿菌，涂布LB平板，次日挑取單克隆菌落，無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)接種至20mLLB液體培養(yǎng)基，搖床180rpm/min培養(yǎng)12h，取5mL菌液，提取EbpS陽(yáng)性質(zhì)粒，用微量核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)粒濃度。采集哺乳動(dòng)物新鮮原乳約（10～20）mL置于滅菌的帶蓋塑料管中，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩０凑栈蚪MDNA提取試劑盒的說(shuō)明書提取各乳樣DNA。PCR30minqPCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)循環(huán)污染消化21個(gè)循環(huán)預(yù)變性51個(gè)循環(huán)95℃1045個(gè)循環(huán)60℃30取出8EbpS陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以10度稀釋方法，提取乳樣DNA3qPCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分添加量（μL）AceQUniversalU+Probe10F、R(10μM)各0.4TaqManProbe(10μM)0.2模板2無(wú)酶水至25μLPCRPCRCty=-3.3141x+44.364（y為CtDNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算孔中檢測(cè)核酸濃度，當(dāng)孔內(nèi)DNA濃度超過(guò)9.6ng/μL時(shí)，判定檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即生鮮乳中金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)大于9.56×104CFU/mL；當(dāng)孔內(nèi)DNA濃度小于9.6ng/μL時(shí)，判定檢測(cè)結(jié)果為陰性，生鮮乳中金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)小于9.56×104CFU/mL。實(shí)驗(yàn)室工作人員在上班前應(yīng)進(jìn)行個(gè)人衛(wèi)生處置，對(duì)全身進(jìn)行噴霧消毒；進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后必須穿工作衣、戴工作帽、手套、膠套、醫(yī)用口罩；實(shí)驗(yàn)室工作人員在每次接觸標(biāo)本后立即進(jìn)行清洗和消毒，手消毒可用75%乙醇或用0.3%～0.5%碘伏，嚴(yán)格按照洗手法搓揉