細菌鑒定之生化反應

細菌鑒定之生化反應南醫(yī)大三附院檢驗科江培濤最新細菌鑒定之生化反應常用試驗碳水化合物的代謝試驗蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗碳源和氮源利用試驗各種酶類試驗抑菌試驗最新細菌鑒定之生化反應一碳水化合物的代謝試驗

1糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗原理：細菌含有發(fā)酵糖（醇、苷）的酶分解糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、或僅產(chǎn)酸

培養(yǎng)基：含有0.5%~1%的糖（醇、苷）的液體、半固體、固體、或微量生化管方法：純菌種接種培養(yǎng)基，要求的溫度，數(shù)小時至兩周，微量管注意保持濕潤，以免干燥結果：能分解糖（醇、苷）類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應若能產(chǎn)氣時，培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂氣泡等現(xiàn)象意義：腸桿菌科尤為重要最新細菌鑒定之生化反應2氧化-發(fā)酵試驗（O/F）原理：細菌分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的稱為產(chǎn)堿型培養(yǎng)基：HL二氏培養(yǎng)基方法；待測菌同時接種兩只HL培養(yǎng)基，其中一只滴加無菌的液體石蠟，高度不少于1cm，35℃培養(yǎng)48h或更長結果：兩只均無變化為產(chǎn)堿型；兩只均產(chǎn)酸為發(fā)酵型；僅不加石蠟的產(chǎn)酸為氧化型意義：腸桿菌科與非發(fā)酵菌的鑒別；葡萄球菌與微球菌的鑒別，前者為發(fā)酵型，后者為氧化型最新細菌鑒定之生化反應3ONPG（β半乳糖苷酶試驗）原理：有的細菌可以產(chǎn)生β半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚-β半乳糖苷生成黃色的鄰-硝基酚方法：從KIA上取菌，于0.25ML無菌生理鹽水中制菌懸液，加甲苯一滴，使酶釋放。37℃水浴5min,加0.25mlONPG試劑，水浴20min-3h觀察結果結果：呈現(xiàn)黃色為陽性，一般20-30min內(nèi)顯色意義：迅速及遲緩發(fā)酵乳糖的細菌為陽性，不發(fā)酵乳糖的細菌為陰性。本試驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖的細菌的快速鑒定注意：該試驗不一定與分解乳糖相一致，決定于細菌產(chǎn)生的酶及其活性最新細菌鑒定之生化反應七葉苷水解試驗原理：有的細菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，后者與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色方法：將待測菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結果結果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，前者為陽性；肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌多陽性最新細菌鑒定之生化反應V-P試驗原理：細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，進而與培養(yǎng)基中蛋白胨內(nèi)精氨酸中的胍基作用，生成紅色化合物，即為V-P試驗陽性。α奈酚可加速此反應培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃48h，加入甲液（6%α奈酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液）結果：20min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，如無紅色，且于35℃4h后仍如故即為陰性意義：本試驗常與甲基紅一起試驗，前者陽性則后者多陰性最新細菌鑒定之生化反應甲基紅試驗原理：細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者進一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下，加入甲基紅試劑后顯紅色即陽性。若產(chǎn)酸量少，或進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，則培養(yǎng)基的PH仍在6.2以上，加入甲基紅試劑后顯黃色，為陰性培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，2-4天后，加入甲基紅試劑，觀察結果結果：呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性，黃色為陰性意義：大腸、沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌、等為陽性；腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性最新細菌鑒定之生化反應7葡萄糖酸鹽試驗原理：某些細菌能氧化葡萄糖酸鹽作為唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸鹽。加入班氏試劑，于沸水煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀，表明有葡萄糖酸鹽的存在培養(yǎng)基：2-酮基葡萄糖酸鹽肉湯方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24h，于其中加入0.3ml濃縮班氏試劑，然后沸水中煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀表明有葡萄糖酸鹽的存在意義：用于腸桿菌科分類最新細菌鑒定之生化反應二蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗1明膠液化試驗原理：細菌產(chǎn)生明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體變?yōu)橐后w方法：待測菌接種于明膠培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)7天。若用35℃孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察前先置4℃冰箱30min再觀察結果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性意義：多數(shù)假單胞菌能液化明膠，腸桿菌科細菌如：沙雷菌、變形桿菌、陰溝桿菌等可液化明膠最新細菌鑒定之生化反應2吲哚（?；|(zhì)）試驗原理：某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當加入吲哚試劑-柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚培養(yǎng)基：蛋白胨水方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24-48小時，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑結果：于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性意義：腸桿菌科細菌的鑒定；大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯為陽性試劑：柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）與歐氏試劑的區(qū)別：前者含戊醇，后者含酒精，都含濃鹽酸，前者主要成分為后者10倍，后者靈敏度更高最新細菌鑒定之生化反應硫化氫試驗原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，后者遇亞鐵離子或鉛則形成黑褐色的沉淀。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基方法：待測菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24-48小時觀察結果結果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、腐敗假單胞菌為陽性最新細菌鑒定之生化反應4尿素分解試驗原理：某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時觀察結果結果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：變形桿菌、摩根氏、雷氏普羅維登氏、克雷伯氏為陽性最新細菌鑒定之生化反應5苯丙氨酸脫氨酶（TDA）試驗原理：某些細菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時，加10%三氯化鐵試劑3-4滴，觀察結果結果：腸桿菌科變形桿菌、普羅維登氏菌、摩根氏菌陽性最新細菌鑒定之生化反應6氨基酸脫羧酶試驗原理：具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯色培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，并加入無菌液體石蠟，35℃培養(yǎng)18-24小時觀察結果結果：對照管應呈黃色，測定管呈紫色，（指示劑為溴甲酚紫）測定管呈黃色為陰性；若對照管呈紫色則試驗無意義意義：腸桿菌科細菌的鑒定最新細菌鑒定之生化反應三碳源和氮源利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗原理：某些細菌能以枸櫞酸鹽為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18-24小時，觀察結果結果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{色為陽性，不變色為陰性意義：克雷伯菌屬、沙門菌屬常為陽性最新細菌鑒定之生化反應丙二酸鹽利用試驗原理：有的細菌可利用丙二酸鹽為唯一碳源，將其分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18-24小時，觀察結果結果：培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{為陽性，無變化則為陰性意義：腸桿菌科屬間鑒別最新細菌鑒定之生化反應四各種酶類試驗1氧化酶試驗原理：細胞色素氧化酶是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺方法：菌落法、濾紙法、試劑紙片法。前二者浪費試劑，后者節(jié)省結果：10秒內(nèi)呈深紫紅色為陽性應用：腸桿菌科細菌與假單胞菌的區(qū)別，前者陰性，后者多陽性奈瑟菌屬、莫拉菌屬也為陽性最新細菌鑒定之生化反應2觸酶試驗原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和氧，出現(xiàn)氣泡試劑：3%過氧化氫溶液方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴，觀察結果結果：出現(xiàn)大量氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性意義：用于革蘭氏陽性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌為陽性，鏈球菌和腸球菌為陰性，腸球菌多假陽性最新細菌鑒定之生化反應硝酸鹽還原試驗原理：硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨，氨再轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物；硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸系統(tǒng)中的終末受氫體。有的細菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，有的能使其還原為亞硝酸鹽和離子銨，有的能使其還原為氮培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基試劑：甲（對氨基苯磺酸），乙（α奈胺）方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18-24小時，將甲乙液分別加入培養(yǎng)基，立即觀察結果結果：出現(xiàn)紅色為陽性注意：若加入試劑后無反應，可能是①硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性②硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而致假陰性，此時要加入少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色則為陰性，不產(chǎn)生紅色則為假陰性，實際為陽性意義：腸桿菌科為陽性；銅綠、嗜麥芽能產(chǎn)生氮氣；鏈球菌腸球菌陰性，葡萄球菌陽性最新細菌鑒定之生化反應4DNA酶試驗原理：某些細菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解，后者可被酸沉淀，長鏈DNA水解后形成的寡核苷酸鏈則溶于酸，所以在平板上加入酸后會在菌落周圍形成透明環(huán)培養(yǎng)基：0.2%DNA瓊脂平板方法：點種被測菌于上述平板，35℃培養(yǎng)18-24小時；用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結果結果：菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性意義：金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、變形桿菌陽性最新細菌鑒定之生化反應凝固酶試驗原理：致病性葡萄球菌；結合凝固酶、游離凝固酶；纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白使血漿凝固方法：1玻片法檢測結合凝固酶兔血漿2試管法檢測游離凝固酶0.5ml兔血漿37℃水浴3-4結果：玻片法中有明顯顆粒樣凝集而鹽水對照無凝集為陽性

試管法以血漿凝固為陽性意義：致病性葡萄球菌；金黃色葡萄球菌多陽性最新細菌鑒定之生化反應6CAMP試驗原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進葡萄球菌的β溶血毒素的活性，在兩菌的交界處溶血力加強，出現(xiàn)矢形溶血區(qū)培養(yǎng)基；BAP方法：先以產(chǎn)β溶血毒素的金葡菌劃一橫線接種于BAP，再將被測菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，0.5-1cm，37℃培養(yǎng)18-24小時觀察結果，設陰陽性對照結果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣溶血區(qū)為陽性意義：B群鏈球菌陽性，馬紅球菌出現(xiàn)反CAMP現(xiàn)象最新細菌鑒定之生化反應膽汁溶菌酶試驗原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，使細菌發(fā)生自溶試劑：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁方法：平板法：滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測菌落上35

℃30min觀察結果試管法：0.9ml被測菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35℃水浴10-30min觀察結果結果：菌落消失，或培養(yǎng)物變透明為陽性意義：肺炎鏈球菌陽性最新細菌鑒定之生化反應8脂酶、卵磷脂酶、鹼性磷酸酶主要用于厭氧菌的鑒定產(chǎn)氣夾膜梭菌卵磷脂酶陽性中間類桿菌脂酶陽性致病性葡萄球菌鹼性磷酸酶陽性，如金葡等最新細菌鑒定之生化反應五抑菌試驗1O/129試驗原理：O/129（二氨基喋啶）對弧菌屬有抑制作用，而對氣單胞菌屬無抑制作用培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基方法：紙片法藥敏40ug/片結果：有抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥最新細菌鑒定之生化反應桿菌肽試驗原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全敏感，而其他鏈球菌則耐藥培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏0.04U/片結果：＞10mm敏感；＜10mm耐藥意義：A群鏈球菌敏感最新細菌鑒定之生化反應3奧普托欣Optochin試驗原理：肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其他鏈球菌無抑制作用培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏5ug/片結果：抑菌環(huán)直徑＞14mm敏感；≤14mm耐藥此時加做膽汁溶菌試驗證實意義：肺炎鏈球菌對Optochin敏感最新細菌鑒定之生化反應4新生霉素敏感試驗原理：表皮葡萄球菌對新生霉素敏感；腐生葡萄球菌對新生霉素耐藥培養(yǎng)基：MH瓊脂方法：同紙片法藥敏5ug/片結果：抑菌環(huán)直徑＞16mm敏感；≤16mm耐藥意義：區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌最新細菌鑒定之生化反應氫氧化鉀拉絲試驗

(1)原理：革蘭陰性細菌的細胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來，而革蘭陽性細菌在稀堿溶液中沒有上述變化。(2)方法：取1滴40g/L氫氧化鉀