食品中大腸菌群MPN計數(shù)法

第一法：大腸菌群MPN計數(shù)法主講：林曉麗

—1—樣品的采集和處理一設(shè)備和材料二培養(yǎng)基和試劑三

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大腸菌群MPN計數(shù)檢樣程序四

大腸菌群MPN計數(shù)檢樣操作步驟五

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一1.采樣原則和采樣方案2.采樣用品3.樣品的采取和送檢4.檢樣的處理

樣品的采集和處理

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大腸菌群MPN計數(shù)法一、樣品的采集和處理1.采樣原則1.1樣品的采集應(yīng)遵循隨機性、代表性的原則。1.2采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。2.采樣方案2.1根據(jù)檢驗?zāi)康摹⑹称诽攸c、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。2.2采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設(shè)有n、c和m值,三級采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。

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一、樣品的采集和處理2.3采樣方案的解釋說明n:同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù);c:最大可允許超出m值的樣品數(shù);m:微生物指標(biāo)可接受水平限量值(三級采樣方案)或最高安全限量值(二級采樣方案);M:微生物指標(biāo)的最高安全限量值。注1:按照二級采樣方案設(shè)定的指標(biāo),在n個樣品中,允許有≤c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于m值。注2:按照三級采樣方案設(shè)定的指標(biāo),在n個樣品中,允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值小于或等于m值;允許有≤c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值在m值和M值之間;不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于M值。大腸菌群MPN計數(shù)法

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一、樣品的采集和處理

例如:n=5,c=2,m=100CFU/g,M=1000CFU/g。含義是從一批產(chǎn)品中采集5個樣品,若5個樣品的檢驗結(jié)果均小于或等于m值(≤100CFU/g),則這種情況是允許的;若≤2個樣品的結(jié)果(X)位于m值和M值之間(100CFU/g<X≤1000CFU/g)，則這種情況也是允許的;若有3個及以上樣品的檢驗結(jié)果位于m值和M值之間,則這種情況是不允許的；若有任一樣品的檢驗結(jié)果大于M值(>1000CFU/g)，則這種情況也是不允許的。大腸菌群MPN計數(shù)法

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大腸菌群MPN計數(shù)法一、樣品的采集和處理2.4各類食品的采樣方案按食品安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定執(zhí)行。2.5食品安全事故中食品樣品的采集2.5.1由批量生產(chǎn)加工的食品污染導(dǎo)致的食品安全事故,食品樣品的采集和判定原則按2.3和2.4執(zhí)行。重點采集同批次食品樣品。2.5.2由餐飲單位或家庭烹調(diào)加工的食品導(dǎo)致的食品安全事故,重點采集現(xiàn)場剩余食品樣品，以滿足食品安全事故病因判定和病原確證的要求。

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2.采樣用品采樣箱、

滅菌采樣杯、滅菌塑料袋、有蓋搪瓷盤、滅菌刀、剪子、鑷子、滅菌帶塞廣口瓶、滅菌棉簽、溫度計、編號牌（或蠟筆和紙）大腸菌群MPN計數(shù)法一、樣品的采集和處理

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大腸菌群MPN計數(shù)法3.樣品的采取和送檢3.1生肉及臟器的檢樣如是屠宰場宰后的畜肉，可于開腔后，用無菌刀采取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各250g(或劈半后采取兩側(cè)背部最長肌肉各250g)，如是冷藏或銷售的生肉，可用無菌刀取腿肉或其他部位的肌肉250g/只（頭），檢樣采取后放入無菌容器內(nèi)，立即送檢；如果條件不許可時，最好不超過3h。送檢時應(yīng)冷藏，不得加入任何防腐劑。檢樣送往化驗室應(yīng)立即檢驗或放置冰箱暫存。一、樣品的采集和處理

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大腸菌群MPN計數(shù)法3.2禽類（包括家禽和野禽）

鮮、凍家禽采取整只，放入無菌容器內(nèi)。帶毛野禽可放清潔容器內(nèi)，立即送檢。其他處理要求同3.1。3.3各類熟肉制品諸如醬鹵肉、方圓腿、熟灌腸、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取250g,熟禽采取整只，均放入無菌容器內(nèi)，立即送檢。其他處理同3.1。一、樣品的采集和處理

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大腸菌群MPN計數(shù)法3.4生灌腸（臘腸、香腸）采取整根、整只，小型的可采用數(shù)根、數(shù)只，其總量不少于250g4.檢樣的處理4.1鮮肉檢樣的處理先將檢樣進(jìn)行表面消毒（在沸水內(nèi)燙3~5s，或灼燒消毒），再用無菌剪子取檢樣深層肌肉25g，放入無菌乳缽內(nèi)用滅菌剪子剪碎后，加入滅菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入滅菌水225mL，混勻后即為1:10稀釋液?；蛴镁|(zhì)器以8000~10000r/min，均質(zhì)1min，做成1:10稀釋液。一、樣品的采集和處理

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大腸菌群MPN計數(shù)法4.2鮮、凍家禽檢樣的處理

先將檢樣進(jìn)行表面消毒，再用無菌剪子取檢樣深層肌肉25g（一般可從胸部或腿部剪?。?。其他處理同生肉。帶毛野禽去毛后，同家禽檢樣處理。4.3各類熟肉制品檢樣處理直接切取或稱取25g,其他處理同生肉。4.4臘腸、香腸等生灌腸檢樣處理先對生灌腸表面進(jìn)行消毒，用滅菌剪子剪取內(nèi)容物25g。其他處理同生肉。一、樣品的采集和處理

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二、設(shè)備和材料大腸菌群MPN計數(shù)法除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、

均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、天平、菌落計數(shù)器、pH計或pH比色管或精密pH試紙等。

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三、培養(yǎng)基和試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、

1mol/L鹽酸（HCI)。

大腸菌群MPN計數(shù)法

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LST不產(chǎn)氣（－）小導(dǎo)管里無氣泡將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯LST產(chǎn)氣（+）四、大腸菌群MPN計數(shù)檢樣程序

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1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。五、大腸菌群MPN計數(shù)檢樣操作步驟

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1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯)。五、大腸菌群MPN計數(shù)檢樣操作步驟

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接種完畢后，將其放入培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(證實試驗),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3.復(fù)發(fā)酵試驗(證實試驗)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中,36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計為大腸菌群陽性管。4.大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報告按3確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表(見表1),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。五、大腸菌群MPN計數(shù)檢樣操作步驟

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