一種快速有效的細(xì)菌鑒定方法

一種快速有效的細(xì)菌鑒定方法傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是根據(jù)微生物的細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、血清學(xué)反應(yīng)、噬菌體敏感性等多方面進(jìn)行綜合鑒定的，使用該方法進(jìn)行鑒定的依據(jù)為細(xì)胞的表形特征，其缺點(diǎn)是檢測項(xiàng)目多、工作量大、耗時(shí)、結(jié)果不穩(wěn)定等，易出現(xiàn)弱反應(yīng)或假陽性。現(xiàn)代的方法：利用了PCR的方法，根據(jù)16srDNA兩端的保守序列，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增未知細(xì)菌的16srRNA基因，然后對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行序列分析，經(jīng)與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較后，對未知菌種進(jìn)行鑒定。該方法是在分子水平上對細(xì)菌進(jìn)行的分類，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。鑒定的原理細(xì)菌的rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA，約占總量的80%以上，其分子量大，種類多，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成。細(xì)菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5SrRNA信息量少，不適合分析；23SrRNA分子大，信息量多，但堿基突變速度較快，同樣不適于細(xì)菌鑒定；相比之下16SrRNA的遺傳較為穩(wěn)定，長度在1550±200bp左右,代表信息量適中，是研究系統(tǒng)進(jìn)化的好材料。目前已報(bào)道了10000種以上的細(xì)菌16SrDNA序列，通過對16SrDNA序列分析，可以將細(xì)菌劃分到屬或種，對于難以培養(yǎng)的細(xì)菌、生化反應(yīng)不明顯及傳統(tǒng)表型方法不能鑒定的細(xì)菌，使用該法鑒定細(xì)菌尤為方便。本文以某食品公司的食品原料和加工后成品中的細(xì)菌檢測為例，簡述細(xì)菌鑒定的方法。1.細(xì)菌分離及基因組DNA的制備細(xì)菌分離：使用平板記數(shù)的方法對食品原料及加工后成品中的細(xì)菌進(jìn)行分離?；蚪MDNA的制備：從食品原料的瓊脂平板上挑出10個(gè)單菌落（分別編號1-10），從加工后成品的瓊脂平板上挑出7個(gè)單菌落（編號11-17），采用細(xì)菌少量提取基因組DNA試劑盒提取各個(gè)樣品的基因組DNA。2.PCR擴(kuò)增2.1

按下述組分配制PCR反應(yīng)液模板*：1μlPCRPremix25μlForwardPrimer0.5μlReversePrimer0.5μl16S-freeH2Oupto50μl

*陰性對照使用1μl的16S-freeH2O替代模板DNA

陽性對照使用1μl的PositiveControlDNA為模板2.2

PCR反應(yīng)條件如下：

94℃5min94℃1min50℃1min30cycles72℃1.5min72℃5min3瓊脂糖凝膠電泳使用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，結(jié)果如下。電泳結(jié)果顯示，從食品原料和加工后成品中的17個(gè)細(xì)菌中，均擴(kuò)增出了16SrDNA的DNA條帶。11-17成品中分離細(xì)菌的16SrDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果—陰性對照（以16S-freeH20為模板）+陽性對照（以PositiveControlDNA為模板）1-10原料中分離細(xì)菌的16SrDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果—陰性對照（以16S-freeH20為模板）+陽性對照（以PositiveControlDNA為模板）4PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠回收使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行了切膠回收，純化目的片段。5DNA測序?qū)η心z回收純化的各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用Seqforward,Seqinternal,Seqreverse三條引物進(jìn)行測序。結(jié)果比對將各細(xì)菌DNA的測序結(jié)果通過GenBank（NCBI）進(jìn)行了比對，根據(jù)同源性的對比鑒定了相應(yīng)的細(xì)菌。AJ288151Pseudomonasstutzeri1366100%AY360594Bacillibacterium108896%…………..結(jié)果分析：細(xì)菌的16SrDNA序列對比結(jié)果表明：在食品原料中含有的細(xì)菌種類比較多，共有9種；但滅菌后的食品中只含有3種，主要是芽孢細(xì)菌。通過菌種鑒定發(fā)現(xiàn)，成品中出現(xiàn)的芽孢菌從原料中并沒有檢測出來，可能的原因是：此種細(xì)菌在原料中并不是主要的菌群，經(jīng)過高溫滅菌后其他菌體死亡，而此種細(xì)菌并沒有被完全殺死，發(fā)展成了主要細(xì)菌。因此可以推斷：食品的污染可能是滅菌不徹底造成的。特別是芽孢細(xì)菌，一般比較耐熱，高溫高壓只能殺死菌體，對于菌體產(chǎn)生的芽孢休眠體可能未能殺死，造成食品污染。解決方案：根據(jù)以上的結(jié)果分析：建議采用如下方法對食品原料和成品進(jìn)行處理：1、減少食品的包裝，不改變原有的滅菌條件，以免破壞食品風(fēng)味。2、對食品原料采用兩次滅菌的方法。第一次滅