第章濁度自動(dòng)化儀器XXXX

第二十章免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析1．了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化的基本概念2．了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化設(shè)計(jì)的基本原理3．了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化儀器在臨床上的應(yīng)用4．掌握常用的幾種免疫檢測(cè)自動(dòng)化儀器的檢測(cè)原理、應(yīng)用以及評(píng)價(jià)，本章重點(diǎn)

免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化(automationofimmunoassays)

是將免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)過(guò)程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、打印報(bào)告和檢測(cè)后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)行。第一節(jié)自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)免疫濁度分析屬液相沉淀試驗(yàn)，其基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

一、免疫透射比濁法【原理】一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱(圖9-7)，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。

二、免疫膠乳比濁法

原理

用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單個(gè)膠乳顆粒不阻礙光線透過(guò)，b為抗原抗體結(jié)合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強(qiáng)。

三、免疫散射比濁法【原理】

粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：

式中Iθ為與入射光成θ角處散射光強(qiáng)度；λ和I0為入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測(cè)器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4顆粒直徑<1/10λRayleigh散射1/10λ<顆粒直徑≤λDebye散射顆粒直徑≥λMile散射㈠定時(shí)散射比比濁法（fixedtimenephelometry）定時(shí)散射比比濁法是在在保證抗體體過(guò)量的情情況下，加加入待測(cè)抗抗原，此時(shí)時(shí)反應(yīng)立即即開(kāi)始，在在反應(yīng)的第第一階段，，溶液中產(chǎn)產(chǎn)生的散射射光信號(hào)波波動(dòng)較大，，所獲取的的信號(hào)計(jì)算算出的結(jié)果果會(huì)產(chǎn)生一一定的誤差差。定時(shí)散散射比濁法法是避開(kāi)抗抗原抗體反反應(yīng)的不穩(wěn)穩(wěn)定階段，，即散射光光信號(hào)在開(kāi)開(kāi)始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次次讀數(shù)，專專門(mén)在抗原原抗體反應(yīng)應(yīng)的最佳時(shí)時(shí)段進(jìn)行讀讀數(shù)，將檢檢測(cè)誤差降降到最低。。㈡速率散射比比濁法（ratenephelometry）速率散射比比濁法是抗抗原抗體結(jié)結(jié)合反應(yīng)的的動(dòng)力學(xué)測(cè)測(cè)定法。所所謂速率是是指抗原抗抗體反應(yīng)在在單位時(shí)間間內(nèi)形成免免疫復(fù)合物物的速度（（不是免疫疫復(fù)合物累累積的量）），連續(xù)測(cè)測(cè)定各單位位時(shí)間內(nèi)復(fù)復(fù)合物形成成的速率與與其產(chǎn)生的的散射光信信號(hào)聯(lián)系在在一起，形形成動(dòng)態(tài)的的速率散射射比濁法，，每項(xiàng)檢測(cè)測(cè)僅1min～2min即可完成。。表抗原抗抗體復(fù)合物物形成的速速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率累計(jì)時(shí)間（s）形成IC總量速率5

8－10

13

515

25

1220

60

3525

150

9030

230

8035

300

7040

360

6045

415

5550

450

4555

480

3060

500

20抗原抗體反反應(yīng)速率的的動(dòng)態(tài)變化化BNProSpec全自動(dòng)特定定蛋白分析析儀BNP防抗原過(guò)量量的設(shè)計(jì)：優(yōu)化反應(yīng)條條件，令初初始稀釋度度分析范圍圍更寬，保保證抗原抗抗體反應(yīng)呈呈最佳比例例預(yù)反應(yīng)程序序：IgM，LamU，AlbU，β2MUVLinIntegral計(jì)算程序定時(shí)散射比比濁法測(cè)定定原理示意意圖IMMAGE全自動(dòng)特定定蛋白分析析儀一、特異性性二、比例性性三、可逆性性一、抗體來(lái)來(lái)源：兔，，羊，---二、親合力力三、濃度四、電解質(zhì)質(zhì)，(增濁濁劑)五、pH六、溫度抗原抗體反反應(yīng)的特點(diǎn)點(diǎn)抗原抗體反反應(yīng)的影響響因素抗體抗體的質(zhì)量量特異性強(qiáng)，，效價(jià)高，，親和力強(qiáng)強(qiáng)，R型抗體的含量量抗體過(guò)量抗體的特異異性抗體只針對(duì)對(duì)相應(yīng)的抗抗原，非特特異性的交交叉反應(yīng)會(huì)會(huì)引起偽濁濁度?？贵w的效價(jià)價(jià)一個(gè)合格的的比濁用抗抗體其效價(jià)價(jià)必須在1：20（抗體稀稀釋度））以上，，否則易易形成偽偽濁度。?？贵w的親親和力親和力強(qiáng)強(qiáng)則抗體體活性高高，不僅僅可以加加快抗原原抗體反反應(yīng)速度度，而且且形成的的免疫復(fù)復(fù)合物較較牢固，，不易發(fā)發(fā)生解離離。R型抗血清清以家兔為為代表的的小動(dòng)物物血清，，如豚鼠鼠、大白白鼠、家家兔、家家禽、羊羊等動(dòng)物物的免疫疫血清。。這類抗血血清親和和力高，，與抗原原結(jié)合后后不易再再解離，，抗體過(guò)過(guò)剩時(shí)易易形成大大而穩(wěn)定定的復(fù)合合物，抗抗原過(guò)剩剩時(shí)則形形成可溶溶性復(fù)合合物。H型抗血清清以馬為代代表的大大動(dòng)物血血清，如如驢、騾騾、馬等等動(dòng)物的的免疫血血清。該血清親親和力弱弱，抗原原抗體結(jié)結(jié)合后極極易再解解離，抗抗原過(guò)剩剩和抗體體過(guò)剩皆皆易形成成可溶性性復(fù)合物物。pH：6.5~8.5離子強(qiáng)度度：在一定范范圍內(nèi)，，離子強(qiáng)強(qiáng)度大，，IC形成快；離子子強(qiáng)度過(guò)低或或無(wú)電解質(zhì)存存在，則不易易出現(xiàn)可見(jiàn)的的沉淀反應(yīng)。。3.增濁劑的使用用為了提高抗原原抗體復(fù)合物物的形成速度度，常常要加加入增濁劑，，如分子量為為6000～～8000的的3%～4%聚乙二醇醇（PEG）或吐溫-20（tween-20），以消除蛋白質(zhì)質(zhì)分子周圍的的電子云和水水化層，促進(jìn)進(jìn)抗原抗體結(jié)結(jié)合。但PEG濃度過(guò)高，分分子量過(guò)大會(huì)會(huì)引起血清中中其他蛋白質(zhì)質(zhì)（如IgM、α2巨球蛋白、脂脂蛋白）非特特異性沉淀，，形成偽濁度度。因此，使使用恰當(dāng)?shù)脑鲈鰸釀?，合適適的濃度是準(zhǔn)準(zhǔn)確測(cè)定所必必須的。4.偽濁度非抗原抗體特特異性結(jié)合形形成的濁度，，稱為偽濁度度，可導(dǎo)致抗抗原檢測(cè)結(jié)果果假性升高。。偽濁度形成成的原因包括括①混濁標(biāo)本本、高血脂標(biāo)標(biāo)本、反復(fù)凍凍融標(biāo)本；②抗體效價(jià)低（（<1:20）、抗血清滅滅活處理、抗抗血清含有交交叉反應(yīng)性抗抗體等；③增濁劑PEG濃度過(guò)高；④抗血清細(xì)菌污污染和變質(zhì)；；⑤器材尤其是比比色杯不清潔潔、塵埃污染染等；⑥緩沖液的離離子強(qiáng)度太高高，pH和溫度不適合合等，都對(duì)濁濁度產(chǎn)生影響響。5.標(biāo)準(zhǔn)曲線線制備與質(zhì)量量控制應(yīng)用儀器規(guī)定定的標(biāo)準(zhǔn)品制制備劑量-反應(yīng)曲線，一一般采用5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后后選擇適當(dāng)?shù)牡臄?shù)學(xué)方法進(jìn)進(jìn)行曲線擬合合；每每更換一批試試劑，應(yīng)重新新制備劑量-反應(yīng)曲線。為為保證結(jié)結(jié)果準(zhǔn)確可靠靠，選取合適適的質(zhì)控血清清，每次開(kāi)機(jī)機(jī)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)質(zhì)量控制是極極其必要的。。根據(jù)全自動(dòng)酶酶聯(lián)免疫分析析系統(tǒng)的處理理模式，人們們通常將全自自動(dòng)酶免分析析儀分成二類類，一類為分分體機(jī)，一類類為連體機(jī)。。分體機(jī)是由由“前處理系系統(tǒng)”即全自自動(dòng)樣本處理理工作站和“后處理系統(tǒng)””即全自動(dòng)酶酶免分析儀兩兩個(gè)獨(dú)立的部部分組成。連連體機(jī)是由多多個(gè)模塊組成成，使用一臺(tái)臺(tái)計(jì)算機(jī)、一一套操作系統(tǒng)統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)標(biāo)本稀釋、加加樣到酶標(biāo)板板孵育、洗滌滌、加試劑、、再孵育、洗洗滌、讀數(shù)和和結(jié)果打印全全自動(dòng)進(jìn)行。。自動(dòng)化酶聯(lián)免免疫分析系統(tǒng)統(tǒng)全自動(dòng)酶免分分析儀可對(duì)6～30塊板板酶標(biāo)板同時(shí)時(shí)進(jìn)行工作，，具有一套完完整的工作和和分析系統(tǒng)，，不同的儀器器大小不同、、配置不同，，但性能基本本相同。1.條形碼識(shí)別系系統(tǒng)2.樣本架和加樣樣系統(tǒng)3.試劑架4.溫育系統(tǒng)5.液路系統(tǒng)6.洗板系統(tǒng)7.酶標(biāo)板讀數(shù)儀儀8.自動(dòng)裝載傳遞遞系統(tǒng)9.計(jì)算機(jī)管理和和信息系統(tǒng)儀器評(píng)價(jià)全自動(dòng)酶免分分析儀中的連體機(jī)是將樣本處理理工作站和全全自動(dòng)酶免分分析儀聯(lián)合起起來(lái)，工作速速度快，自動(dòng)動(dòng)化程度高，，適合大批量量樣本的處理理，如血站系系統(tǒng)。分體機(jī)機(jī)，由于于它有有一個(gè)個(gè)獨(dú)立立的全全自動(dòng)動(dòng)樣本本處理理站，，加樣樣速度度快，，適合合試驗(yàn)驗(yàn)項(xiàng)目目變化