發(fā)酵豆粕品質(zhì)檢測方法適用性

梁運祥華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室發(fā)酵豆粕品質(zhì)檢測方法適應(yīng)性

發(fā)酵豆粕價值發(fā)酵豆粕：優(yōu)質(zhì)的尤其適用于幼小動物的蛋白質(zhì)飼料。加工過程：以豆粕為原料，通過多菌種發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來。價值實現(xiàn)：抗營養(yǎng)因子消除蛋白質(zhì)“預(yù)消化”微生物代謝產(chǎn)物微生物菌體益生作用品質(zhì)檢測:除常規(guī)營養(yǎng)等檢測外，圍繞上述作用開展針對性檢測。品質(zhì)檢測結(jié)果與動物飼喂結(jié)果一致性要求。發(fā)酵豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)，養(yǎng)殖效果得到了廣泛的認可和大量應(yīng)用。發(fā)酵豆粕品質(zhì)鑒別及分析方法初步建立，仍不完善，方法適用性和結(jié)果準確分析仍需要進一步明確。目錄1、原料組成分析2、大豆抗原的分解3、大豆低聚糖檢測4、大豆多肽分析5、其他檢測指標1、發(fā)酵豆粕的原料構(gòu)成分析受成本和利益的驅(qū)使，少數(shù)廠家在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中添加低值低成本的其它原料，嚴重下降了發(fā)酵豆粕的品質(zhì)。通過對大豆異黃酮和氨基酸的含量分析，能夠判斷發(fā)酵豆粕中是否添加有非豆粕成分和粗略添加比例。1.1豆粕發(fā)酵過程中影響大豆異黃酮的因素物理因素影響（加工工藝的影響）粉碎、干燥等工藝過程的影響。粉碎也是因為溫度而起作用。化學(xué)因素影響（pH的影響）工藝中不添加化學(xué)物質(zhì)，主要是pH的影響。生物因素影響（發(fā)酵菌株的影響）微生物及其酶的作用1.1.1加工工藝（溫度）對發(fā)酵豆粕大豆異黃酮的影響110℃熱處理對大豆異黃酮的影響0h1h3h5h7h9h12h14h16h0.970.950.960.980.950.990.971.031.00

加熱處理不會破壞大豆異黃酮。1.1.2微生物發(fā)酵菌株對發(fā)酵豆粕大豆異黃酮的影響菌株對大豆異黃酮的影響CK枯草地衣短小乳桿菌1乳酸菌2乳酸菌30.971.151.081.0830.990.980.94100%98102979898101

酵母菌1酵母菌2混菌發(fā)酵黑曲霉根霉毛霉1.000.991.131.231.031.059998100979997

微生物發(fā)酵菌株不會破壞大豆異黃酮1.1.3pH的影響

發(fā)酵豆粕的酸度不會破壞大豆異黃酮。CK3.54.04.55.05.56.00.970.940.980.950.990.970.99不同pH對大豆異黃酮的影響

異黃酮檢測結(jié)結(jié)果：樣品中存在非豆粕成分氨基酸的對比

豆粕發(fā)酵后，微生物的生物量在100-200億每克，100克產(chǎn)品中微生物菌體蛋白質(zhì)含量為0.5-1克，發(fā)酵后不會顯著改變原有氨基酸的組成，發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸對豆粕氨基酸的增加值與粗蛋白的增加值相當，變異幅度在10%左右，可以根據(jù)這一規(guī)律判斷發(fā)酵豆粕的原料組成。氨基酸含量分析：

氨基酸含量通過日立835-50氨基酸自動檢測儀來測定。

氨基酸種類發(fā)酵前豆粕（％）發(fā)酵后豆粕（％）比值蘇氨酸(Thr)1.9452.2371.15

絲氨酸(Ser)

2.1532.8081.30

谷氨酸(Glu)7.2319.5341.32

甘氨酸(Gly)2.2872.7021.18

丙氨酸(Ala)2.3502.6931.15

纈氨酸(Val)2.5223.1441.20

蛋氨酸(Met)0.5680.6701.18

異亮氨酸(Ile)2.3562.5431.08續(xù)表：氨基酸種類發(fā)酵前豆粕（％）發(fā)酵后豆粕（％）比值亮氨酸(Leu)4.0984.4591.09苯丙氨酸(Phe)2.3102.7991.20賴氨酸(Lys)2.9103.9781.36總氨基酸含量44.77055.1151.23粗蛋白46561.22※發(fā)酵后粗蛋白由46%提高到56%，增加22%，各單個氨基酸含量較發(fā)酵前都有相應(yīng)增加；總氨基酸較發(fā)酵前提高了23％。

2、大豆抗原的分解原理：利用7S與11S蛋白抗原的SDS電泳圖譜直接展示。根據(jù)電泳圖譜的顏色及大小定性判斷抗原的分解程度。

SDS電泳展示的是溶解的蛋白質(zhì)，因此影響蛋白質(zhì)溶解的工藝過程，如高溫干燥工藝，發(fā)酵添加物，人工酸化以及使用陳化豆粕都將影響蛋白質(zhì)溶解率，使電泳圖變淺變小，出現(xiàn)分解好的假性結(jié)果。

目前這一方法存在較大局限性，不易作為品質(zhì)分析指標。7S與11S球蛋白的SDS電泳

從圖中可以看出：CK中存在7S球蛋白的三個亞基與11S球蛋白兩個亞基。Ck為發(fā)酵前豆粕中提取的球蛋白。M為低分子蛋白質(zhì)標準，分子量為14.4KD－97.4KD。2.1發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在堿性條件下的變化將樣品在堿性下（pH8.8）提蛋白，離心所得上清。原豆粕編號（Y）在pH調(diào)至6.85，發(fā)酵豆粕編號（7）pH調(diào)至6.05時開始出現(xiàn)明顯沉淀。原豆粕編號（Y）和發(fā)酵豆粕編號（7）pH調(diào)至4.5時酸溶性蛋白（小肽）沉淀狀況。2.2陳化豆粕與大豆分離蛋白的SDS電泳結(jié)果

樣品濃度mg/ml2010年豆粕(A)1.832012年豆粕(B)2.38

大豆分離蛋白(C)2.66隨著豆粕存放時間延長，堿溶性蛋白質(zhì)下降，

ABC隨著存放時間的延長，肽鏈的空間結(jié)構(gòu)有緊縮的趨勢2.2添加金屬鹽的影響低較低中高CKA鹽2.2添加金屬鹽的影響B(tài)鹽和C鹽注：1、2、3和4分別為B鹽的低、較低、中、高劑量，5、6、7、8分別為C鹽的低、較低、中、高劑量。2.3加熱處理豆粕的SDS電泳結(jié)果0h、1h、3h、5h、9h、15h為原豆粕經(jīng)115℃處理時間2.4酸處理豆粕的SDS電泳結(jié)果方法：HCl配成0%、1%、2%、3%、4%、5%濃度，按50%的量添加到原豆粕中，35℃烘干。0%、1%、2%、3%、4%、5%為加緩沖液提取，但不調(diào)pH0%’、1%’、2%’、3%’、4%’、5%’為加緩沖液提取，調(diào)pH8.8

不同發(fā)酵豆粕樣品堿性可溶性蛋白濃度

樣品編號蛋白濃度（mg/ml）

CK2.42A2.42C1.85Y22.23S11.7523.8573.66

理論上堿溶性蛋白濃度在25mg/ml,實際上在1.75—3.85mg/ml之間，提取蛋白質(zhì)僅占蛋白質(zhì)7%—15%。不同發(fā)酵豆粕絕對上樣量相同電泳圖濃縮膠濃度5%，分離膠濃度15%72S1Y2CACK

結(jié)合上面分析結(jié)果，不同產(chǎn)品雖然電泳結(jié)果存在較大差異，但它不能真正說明誰優(yōu)誰劣。

綜合來看，影響蛋白質(zhì)肽鏈空間結(jié)構(gòu)（或松散或緊密），電荷多少的條件，如存放時間、干燥溫度、干燥時間、鹽種類、鹽濃度等都影響電泳結(jié)果，且經(jīng)多重加工后，堿溶性提取蛋白質(zhì)不到全部蛋白質(zhì)的20%。因此，電泳膠的結(jié)果不能科學(xué)客觀反映蛋白質(zhì)降解狀況。因此，SDS電泳結(jié)果在直觀認識大豆蛋白質(zhì)特點、組成時是有意義的，在當前技術(shù)條件下，不能作為發(fā)酵豆粕質(zhì)量的判別依據(jù)。3、大豆低聚糖檢測在豆粕中低聚糖主要為水蘇糖、棉籽糖和蔗糖。它們在干基含量分別為4％、2％、5％。

棉籽糖是半乳糖以α（1，6）糖苷鍵與葡萄糖基連接。

水蘇糖是半乳糖以α（1，6）糖苷鍵與棉籽糖中半乳糖基連接。

液相色譜可以進行準確定量，一般不具備檢測條件；薄層層析簡單，直觀，企業(yè)可進行分析。

3.1大豆低聚糖標準品棉籽糖與水蘇糖的液相色譜圖保留時間：棉籽糖7.462min

水蘇糖12.002min發(fā)酵前原豆粕中棉籽糖與水蘇糖的液相色譜圖保留時間：棉籽糖7.447min

水蘇糖11.917min峰高：水蘇糖2.10cm水蘇糖棉籽糖3.2薄層層析

4.大豆多肽大豆多肽定義：以大豆，豆粕或大豆蛋白為主要原料，用酶解法或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的，分子量分布在10000Da以下的肽稱為大豆多肽。能夠指示豆粕蛋白質(zhì)的水解狀態(tài)。4.1大豆多肽分析方法

由于精確分析難度大，一般以三氯乙酸-可溶性氮指數(shù)(TCA-SNI)和水解度(DH)表示。對蛋白質(zhì)水解由于存在內(nèi)切酶和外切酶的差距，上述方法不能完全準確預(yù)示一個混合蛋白質(zhì)或飼料原料蛋白質(zhì)水解狀況。4.1.1三氯乙酸-可溶性氮指數(shù)(TCA-SNI)的測定將發(fā)酵豆粕水溶液與濃度為10%的三氯乙酸以1:1比例混合，4500r/min離心10min后取上清液用凱氏定氮法測定。4.1.2水解度(DH)的測定蛋白質(zhì)水解度(DH)的定義為水解過程中打開的肽鍵占蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)的百分比，采用甲醛法測定。溫度對DH和TCA-SNI的影響

大豆蛋白質(zhì)肽鏈分子量主要分布在40000-70000之間，平均約為55000。以此推算，氨基酸殘基數(shù)約為458（氨基酸平均分子量取120），有457個肽鍵，若水解度為10%，即有45個肽鍵被分解，產(chǎn)生46個分子，其平均分子量為55000/46=1195，其水溶性指數(shù)理論上是100%，與上述40%相差甚遠。4.1.3酸溶性氮指數(shù)法1、發(fā)酵豆粕水溶（蒸餾水，一般按1：5），調(diào)至pH=4.5，并于12000rpm離心10min（或過濾），取上清檢測。2、采用凱式定氮法檢測上清中氮的含量（a）：3、直接取上清液（不消化）檢測無機氮（主要是銨態(tài)氮）（b）；4、樣品中多肽量的計算多肽量=（a-b）*蛋白質(zhì)換算系數(shù)4.2發(fā)酵豆粕多肽含量液體酶解條件下，在底物（大豆蛋白）和蛋白酶都過量情況下，大豆多肽含量最高在6.5%-7.0%。固體發(fā)酵由于受到水分限制，發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的多肽含量理論上不會超過10%。有些產(chǎn)品超過10%，是非蛋白氮較高，或者加入氨基酸生產(chǎn)廢液廢渣。底物濃度與多肽含量的關(guān)系5、胰蛋白酶抑制劑的測定（GB/T21498-2008）

原理：胰蛋白酶抑制劑能夠和胰蛋白酶結(jié)合，通過測定底物（BAPA）被未結(jié)合的胰蛋白酶酶解生成的產(chǎn)物――對硝基苯胺溶液的吸光度，然后以它和未加抑制劑的標準吸光度之差來表示被抑制的胰蛋白酶活性。6、植酸含量的測定

原理：用分光光度法測定用過量的Fe3+與植酸反應(yīng)后的上清液中剩余Fe3+，從而間接測定植酸含量。、7、脂肪氧化酶活性的測定原理：利用豆粕中的脂肪氧化酶與不飽和脂肪酸——亞油酸反應(yīng)，測定反應(yīng)物的吸光值大小來表示酶活的大小。、

9、

脲酶活性的測定

原理：將粉碎的豆粕與中性尿素緩沖溶液混合,在30℃保持30min,尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反應(yīng)。用過量鹽酸中和所產(chǎn)生的氨,再用氫氧化鈉標準溶液回滴。

10、致甲狀腺腫素含量的測定原理：在有水介質(zhì)存在的情況下，大豆中的硫代葡萄糖苷與同時存在硫代葡萄糖苷酶發(fā)生水解，在pH＝7的條件下，主要生成異硫氰酸酯（ITC），帶羥基的ITC極不穩(wěn)定，在極性溶液中自動環(huán)化成惡唑硫酮（OZT），在紫外區(qū)245nm處具有特征吸收峰，可靈敏地檢測到。11、大豆凝血素的測定原