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文檔簡介
儀器分析選論酶免疫分析技術(shù)第一頁,共三十五頁,2022年,8月28日2酶免疫技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定技術(shù)均相酶免疫測定異相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)液相酶免疫測定固相酶免疫測定:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位分析
液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量第二頁,共三十五頁,2022年,8月28日一、均相酶免疫測定法
酶蛋白與抗原或抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記物。未與抗原(抗體)結(jié)合的標(biāo)記抗體(抗原),稱為游離標(biāo)記物。與抗原(抗體)結(jié)合的標(biāo)記抗體(抗原),稱為結(jié)合標(biāo)記物。Ag+
Ab-EAgAb-E+Ab-E
(以標(biāo)記Ab檢測Ag為例)第三頁,共三十五頁,2022年,8月28日一、均相酶免疫測定法
基本原理酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后,其中的酶活性將發(fā)生改變。
因此,不需對反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離,直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性的變化即可推算出被測樣品中抗原的含量。Ag+
Ab-EAgAb-E+Ab-E
(以標(biāo)記Ab檢測Ag為例)第四頁,共三十五頁,2022年,8月28日二、非均相酶免疫測定法基本原理:抗原抗體反應(yīng)平衡后,需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物,然后對經(jīng)酶催化的底物顯色程度進(jìn)行測定,再推算待測樣品中抗原(或抗體)的含量。依據(jù)測定方法又可分為液相和固相酶免疫測定。目前臨床上多用固相酶免疫測定法。Ag+
Ab-EAgAb-E+Ab-E
(以標(biāo)記Ab檢測Ag為例)第五頁,共三十五頁,2022年,8月28日酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)一、基本原理底物顯色定性或定量的分析包被將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234第六頁,共三十五頁,2022年,8月28日方法類型及反應(yīng)原理(一)檢測抗原的方法
將己知抗體包被固相載體,待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合,洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合,形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.雙抗體夾心法第七頁,共三十五頁,2022年,8月28日E固相抗體標(biāo)本(含抗原)酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原適用于檢測含有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原第八頁,共三十五頁,2022年,8月28日(1)將已知抗體包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)加待檢標(biāo)本,溫育,洗滌。(3)加酶標(biāo)抗體,洗滌。(4)加底物,根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2.技術(shù)要點(diǎn)E固相抗體標(biāo)本(含抗原)酶標(biāo)抗體EE底物第九頁,共三十五頁,2022年,8月28日(+)1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物(無抗原)3、加酶標(biāo)抗體(-)YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原第十頁,共三十五頁,2022年,8月28日2.雙位點(diǎn)一步法檢測抗原
即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體,分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng),兩種抗體互不干擾,經(jīng)一次溫育和洗滌后,即可加入底物進(jìn)行顯色測定。第十一頁,共三十五頁,2022年,8月28日EEE底物固相抗體標(biāo)本(含抗原)酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗原在包被時(shí)使用一種單抗,酶標(biāo)記時(shí)使用一種單抗第十二頁,共三十五頁,2022年,8月28日3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY(+)3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物(無抗原)和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY(-)YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測抗原第十三頁,共三十五頁,2022年,8月28日
如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高,容易形成“鉤狀效應(yīng)(hookeffect)”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),可出現(xiàn)假陰性結(jié)果,必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。注意事項(xiàng)EE底物固相抗體標(biāo)本(抗原濃度高)酶標(biāo)抗體E第十四頁,共三十五頁,2022年,8月28日3.競爭法檢測抗原
酶標(biāo)抗原和待檢抗原對固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力,二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后,結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多,酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少,底物顯色反應(yīng)越淺;反之則顯色越深,即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。
第十五頁,共三十五頁,2022年,8月28日酶標(biāo)抗原EEEE固相抗體標(biāo)本(含抗原)底物E競爭法檢測抗原第十六頁,共三十五頁,2022年,8月28日(1)將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)待測管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,待檢標(biāo)本中如果含有抗原,則與酶標(biāo)抗原競爭固結(jié)合相抗體,使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對照管中只加酶標(biāo)抗原,溫育,洗滌。(3)加底物顯色。對照管中顏色深,待測管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。技術(shù)要點(diǎn)第十七頁,共三十五頁,2022年,8月28日3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY(+)EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物(無抗原)和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY(-)EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原第十八頁,共三十五頁,2022年,8月28日(二)檢測抗體的方法
將已知抗原吸附于固相載體上,待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合,形成固相抗原-抗體復(fù)合物,再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合,形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1.間接法第十九頁,共三十五頁,2022年,8月28日
固相抗原標(biāo)本(含抗體)酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白(如抗人IgG),因此該法只需要變換固相抗原,即可用一種酶標(biāo)二抗測各種與抗原相應(yīng)的抗體,具有更廣的通用性第二十頁,共三十五頁,2022年,8月28日4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體(+)YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物(無抗體)洗滌1.已知抗原包被載體(-)3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體第二十一頁,共三十五頁,2022年,8月28日2.雙抗原夾心法
將已知抗原包被固相載體,待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合,形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。技術(shù)要點(diǎn)第二十二頁,共三十五頁,2022年,8月28日E固相抗體標(biāo)本(含抗體)酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體第二十三頁,共三十五頁,2022年,8月28日4.加酶作用的底物不顯色(+)(-)4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物(無抗體)洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測抗體第二十四頁,共三十五頁,2022年,8月28日3.競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法,但其測定具體模式有區(qū)別。1.原理第二十五頁,共三十五頁,2022年,8月28日(1)競爭法檢測HBcAb:①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體,溫育,洗滌。③加入底物,溫育,形成有色產(chǎn)物,用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。2.技術(shù)要點(diǎn)第二十六頁,共三十五頁,2022年,8月28日固相抗原標(biāo)本(含抗體)底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb第二十七頁,共三十五頁,2022年,8月28日3.加酶作用的底物顯色3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體(+)YYYEYYYE2.加待檢物(無抗體)和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體(-)YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBcAb第二十八頁,共三十五頁,2022年,8月28日(2)競爭法檢測HBeAb:①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg,溫育,洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb,溫育,洗滌。④加入底物,溫育,形成有色產(chǎn)物,用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。第二十九頁,共三十五頁,2022年,8月28日固相抗體標(biāo)本(含抗體)抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb第三十頁,共三十五頁,2022年,8月28日(+)(-)4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物顯色2.加待檢物(無抗體)和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBeAb第三十一頁,共三十五頁,2022年,8月28日方法評價(jià)ELISA具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡單、應(yīng)用范圍廣泛、無反射性同位素污染等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)展最快、應(yīng)用最廣,普及。
第三十二頁,共三十五頁,2022年,8月28日1.病原體及其抗體測定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2.蛋白質(zhì)測定各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶等。3.藥物和毒品測定如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。酶免疫測定的應(yīng)用第三十三頁,共三十五頁,2022年,8月28日酶增強(qiáng)免疫測定技術(shù)EMIT將半抗原(或小分子抗原)與酶結(jié)合成酶
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