2020版：高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(全文)

2020版：高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用2020版：高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識（全文）規(guī)范化專家共識（全文）宏基因組下一代測序（mNGS）技術(shù)直接針對標(biāo)本中核酸無偏倚檢測病原微生物序列。但是，mNGS需經(jīng)標(biāo)本前處理、核酸提取、文庫制備、上機測序、數(shù)據(jù)庫比對、報告生成及結(jié)果解讀等一系列過程，對技術(shù)平臺及人員素質(zhì)要求較高。為規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥、疑難感染性疾病和新發(fā)突發(fā)傳染病的救治水平，在多項國家科技專項的支持下，本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識，技術(shù)平臺及人員素質(zhì)要求較高。為規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥、疑難感染性疾病和新發(fā)突發(fā)傳染病的救治水平，在多項國家科技專項的支持下，本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識，以促進mNGS技術(shù)的規(guī)范應(yīng)用和良性發(fā)展?？焖贉?zhǔn)確的微生物鑒定技術(shù)始終是臨床微生物關(guān)注的焦點。傳統(tǒng)微生物檢驗，諸如形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、抗原抗體及靶向核酸檢測等方法在解決疑難及未知病原微生物上存在局限性 快速準(zhǔn)確的微生物鑒定技術(shù)始終是臨床微生物關(guān)注的焦點。傳統(tǒng)微生物檢驗，諸如形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)、抗原抗體及靶向核酸檢測等方法在解決疑難及未知病原微生物上存在局限性 ［1,2新型宏基因組下一代測序（metagenomicsnext-generationsequencing，mNGS）技術(shù)直接針對樣本中所有核酸進行無偏性測序，結(jié)合病原微生物數(shù)據(jù)庫及特定算法，檢測樣本中含有的可能病原微生物序列。隨著該技術(shù)的社會經(jīng)濟成本不斷降低和技術(shù)的不斷完善，已逐漸從科研走向臨床應(yīng)用，成為臨床疑難和未知病原微生物檢驗的重要手段定算法，檢測樣本中含有的可能病原微生物序列。隨著該技術(shù)的社會經(jīng)濟成本不斷降低和技術(shù)的不斷完善，已逐漸從科研走向臨床應(yīng)用，成為臨床疑難和未知病原微生物檢驗的重要手段［3］。利用mNGS技術(shù)進行病原微生物檢測需經(jīng)樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機 測序并滿足測試的質(zhì)量控制要求后，采用特定算法軟件與專用的病原微生物數(shù)據(jù)庫進行比對，實現(xiàn)對病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲及非經(jīng)典 及新發(fā)突發(fā)傳染病的病原體發(fā)現(xiàn)具有獨特價值［6,7］。微生物等的檢測［1，4,5］。mNGS技術(shù)不依賴培養(yǎng)，對常見病原微生 物檢驗陰性、經(jīng)驗治療失敗、不明原因的危急重感染的病原學(xué)診斷以 及新發(fā)突發(fā)傳染病的病原體發(fā)現(xiàn)具有獨特價值［6,7］。［16］，組織本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識，以促進mNGS技術(shù)的規(guī)為進一步規(guī)范mNGS技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用，提高危急重癥和疑難感染性疾病的診療水平，在多項國家科技專項的支持下，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)、共識與規(guī)范［8,9,10,11,12,13,14,15］，特別借鑒了《高［16］，組織本領(lǐng)域有關(guān)專家起草了本共識，以促進mNGS技術(shù)的規(guī)通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識通量測序技術(shù)臨床檢測規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識（第一版通用部分）》范應(yīng)用和良性發(fā)展。本共識中聲明的內(nèi)容為專家討論并推薦的要點。 一、臨床應(yīng)用的基本要求（一）適應(yīng)證基于醫(yī)學(xué)決策的mNGS病原微生物檢測申請，一般用于傳統(tǒng)檢驗方法（一）適應(yīng)證基于醫(yī)學(xué)決策的mNGS病原微生物檢測申請，一般用于傳統(tǒng)檢驗方法未能給出明確病原學(xué)結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、驗證常規(guī)檢驗結(jié)果或排除其他發(fā)熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統(tǒng)微生物檢驗及聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreactionPCRreactionPCR）檢測擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術(shù)。在必要或緊急情況下，如危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法。表1列出了mNGS臨床應(yīng)用適應(yīng)性說明。臨床上在選擇mNGS進行病原微生物確認(rèn)時應(yīng)注意如下事項。1.1.mNGS檢測申請表：mNGS檢測實驗室應(yīng)提供適合臨床使用的申請表。除患者基本信息外，申請單應(yīng)包括標(biāo)本類型、擬診、現(xiàn)病史、既往史、流行病學(xué)史、關(guān)注的病原體、抗菌藥物使用史等。另外，申 請表中應(yīng)列出不同測序項目及適用范圍供醫(yī)生選擇。2.靶向基因測序：基于高通量測序技術(shù)的病原微生物檢測，除無偏倚的2.靶向基因測序：基于高通量測序技術(shù)的病原微生物檢測，除無偏倚的mNGS外，還包括原核生物的 16SrRNA基因、真菌（5SrRNA基因兩端的ITS1ITS2及25-28SrRNA基因中的D1及D2區(qū)等）以及特定病原微生物靶基因等［ 17］。如懷疑沙眼衣原體可選 momp（主要外膜蛋白基因），懷疑結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，tuberculosis，）可選rpoB等靶向基因測序［18192021］。臨床醫(yī)生通過測序?qū)嶒炇姨峁┑捻椖壳鍐芜x擇適宜的項目，切忌大撒網(wǎng)式排查。3.DNA測序與RNA測序的選擇：mNGS技術(shù)理論上可檢測以核酸為遺傳物質(zhì)的所有病原微生物。若臨床上已排除病毒感染，可直接進行DNA測序?？紤]到DNA測序受人源基因組影響較大，為避免因死亡遺傳物質(zhì)的所有病原微生物。若臨床上已排除病毒感染，可直接進行DNA測序?？紤]到DNA測序受人源基因組影響較大，為避免因死亡中的DNA和RNA進行測序。mNGS技術(shù)本身是一種核酸檢測技術(shù)，由于不同微生物類別本身結(jié)構(gòu)差別，其核酸釋放效率差異明顯，尤其微生物DNARNA23。（cerebrospinalfluid，）及血液標(biāo)本，或臨床表現(xiàn)復(fù)雜，無特定懷疑方向時，需要同時對樣本中的DNA和RNA進行測序。mNGS技術(shù)本身是一種核酸檢測技術(shù)，由于不同微生物類別本身結(jié)構(gòu)差別，其核酸釋放效率差異明顯，尤其是真菌、分枝桿菌等核酸提取需要特定的破壁處理，對于疑似真菌或分枝桿菌感染時也應(yīng)特別提出，在檢測過程中增加必要的樣本處理過程。4.mNGS技術(shù)的局限性：受臨床mNGS技術(shù)本身、測序成本及數(shù)據(jù)4.mNGS技術(shù)的局限性：受臨床mNGS技術(shù)本身、測序成本及數(shù)據(jù)庫等影響，常規(guī)mNGS策略常無法獲得樣本中所有微生物的序列， 臨床標(biāo)本中低濃度致病微生物可能會漏檢，同時針對特定的耐藥或毒力基因的分析亦較難實現(xiàn)［5］。如果需要對耐藥基因或毒力基因進行分 請者如有特殊要求應(yīng)加以注明。析，可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比 例，或者結(jié)合耐藥相關(guān)基因或毒力基因進行靶向捕獲富集后進行。申 請者如有特殊要求應(yīng)加以注明。（二）標(biāo)本類型及采集規(guī)范 類別微生物核酸的提取效率。理論上，凡存在于臨床標(biāo)本中的病原微生物均可通過 mNGS檢出但該技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴標(biāo)本中微生物的核酸質(zhì)量及含量，也依賴于不同 類別微生物核酸的提取效率。1.血液及高凝標(biāo)本：持針器肘靜脈采集3~5實驗室提供專用采血DNA（ethylenediaminetetraaceticacidEDTA）抗凝劑和保護劑，可抑制血漿中核酸酶及有核細(xì)胞中 DNA有核細(xì)胞中 DNA的釋放］。采血時皮膚需徹底消毒，采血至刻度，上下顛倒混勻5~10次，條碼標(biāo)記或編號。切忌在輸液處或?qū)Ч芴幉杉獦?biāo)本。此外，高凝狀態(tài)的關(guān)節(jié)液、胸腹腔積液，甚至CSF也可采用此方法。如果增加RNA測序應(yīng)同時采2管。2.支氣管肺泡灌洗液及痰液：嚴(yán)格按操作規(guī)程采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF2.支氣管肺泡灌洗液及痰液：嚴(yán)格按操作規(guī)程采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF），棄去前段可能污染的部分，回收10ml置無菌螺帽管（塑料或玻璃質(zhì)地均可）中，內(nèi)含支氣管末梢和肺泡中的分泌物?？忍禈?biāo)本需在醫(yī)護人員協(xié)助下，患者用生理鹽水漱口2~3次，彎腰90°，用力咳出深部痰 3~5ml置無菌螺帽或編號。管中。若無法自行咳痰，可通過吸痰器從氣道采集。咽拭子只適用于 呼吸道病毒檢測。檢查容器有無滲漏，緊蓋后封口膜密封，條碼標(biāo)記 或編號。3.CSF帽管封口膜密封。CSF（留取第2管或第2）、關(guān)節(jié)腔積液、膽汁等檢測病原微生物DNA或RNA需采集1ml，如同時進行DNA及RNA測序應(yīng)采集2ml。房水至少采集200μl。骨髓單獨進行DNA或及RNA測序應(yīng)采集2ml。房水至少采集200μl。骨髓單獨進行DNA或RNA測序，0.5ml標(biāo)本即可，如果同時進行 DNA及RNA測序則至少采集1ml。這些臨床標(biāo)本采集困難，切記防污染，避免經(jīng)引流管采集。胸腹腔積液需富集后提核酸，至少采集10ml［24］。4.膿腫及深部組織：（1）開放性膿腫需清創(chuàng)后采集深部傷口或潰瘍基底部分泌物拭子置無菌管中。（2）封閉的膿腫需對病灶局部的皮膚或4.膿腫及深部組織：（1）開放性膿腫需清創(chuàng)后采集深部傷口或潰瘍基底部分泌物拭子置無菌管中。（2）封閉的膿腫需對病灶局部的皮膚或黏膜表面徹底消毒，注射器抽取膿液，若少于3ml，應(yīng)采集最大標(biāo)本量送檢。（3）深部組織感染需手術(shù)取材，置于無菌螺帽瓶中。多數(shù)情況下組織中病原微生物含量低于膿液，盡可能取膿腫邊緣組織。5.糞便標(biāo)本：至少黃豆粒大小的新鮮標(biāo)本，稀便3~5ml5.糞便標(biāo)本：至少黃豆粒大小的新鮮標(biāo)本，稀便3~5ml中。6.標(biāo)本轉(zhuǎn)運：若標(biāo)本在24h內(nèi)到達(dá)實驗室并開始檢測，可考慮冰袋低溫運輸；若運輸時間在24~72h內(nèi)，應(yīng)干冰運輸，并立刻進行標(biāo)本前4℃冰箱保存不得超過7（專用采血管在運輸過程中避免劇烈晃動；其他臨床標(biāo)本如需長期保存，應(yīng)按如下原則執(zhí)行：（在運輸過程中避免劇烈晃動；其他臨床標(biāo)本如需長期保存，應(yīng)按如下原則執(zhí)行：（1）DNA-20℃保存不超過7d。（2）RNA測序：應(yīng)置-80（3）避免標(biāo)本反復(fù)凍融，一般不得超過3（4）-80℃可長期保存。（5）若懷疑高致病性或新發(fā)突發(fā)傳染病，嚴(yán)格按照國內(nèi)傳染病法等相關(guān)法律要求包裝及轉(zhuǎn)運。盡可能在醫(yī)院生物安全防護條件下抽提核酸后再送測序。物安全防護條件下抽提核酸后再送測序。建議1原則上，臨床懷疑病原微生物感染，常規(guī)方法未得到明確病原學(xué)證據(jù)而影響臨床救治時，可利用mNGS進一步確認(rèn)。鼓勵臨床在排除常見病原微生物后有目的選擇mNGS狀體征、治療經(jīng)過、現(xiàn)病史、流行病學(xué)史及既往史等。測序?qū)嶒炇覒?yīng)讓申請者知曉不同類型感染性疾病的標(biāo)本選擇、狀體征、治療經(jīng)過、現(xiàn)病史、流行病學(xué)史及既往史等。測序?qū)嶒炇覒?yīng)讓申請者知曉不同類型感染性疾病的標(biāo)本選擇、采集時機、采集方式、送檢量、轉(zhuǎn)運及儲存條件、不同mNGS檢測策略的適用范圍。疑為傳染病應(yīng)符合國家相關(guān)生物安全標(biāo)本采集及轉(zhuǎn)運要求。申請者可提出重點關(guān)注的病原體，如呼吸道病毒、結(jié)核分枝桿菌、真菌及寄生蟲等。實驗室應(yīng)提供適宜臨床使用的申請單，內(nèi)容應(yīng)包括不同mNGS測序策略及對應(yīng)的適應(yīng)證。實驗室應(yīng)提供適宜臨床使用的申請單，內(nèi)容應(yīng)包括不同mNGS測序策略及對應(yīng)的適應(yīng)證。（三）報告解讀原則目前病原微生物的確認(rèn)依然遵循Koch法則，即：（1）該微生物存在并可從被接種的動物體內(nèi)分離到此微生物。 （4）該微生物可引起每一個個體發(fā)病［25］。但是，作為一種臨床檢驗方法，利用mNGS確于同類疾病患者中，健康個體則無此微生物。（2）該微生物必須能夠并可從被接種的動物體內(nèi)分離到此微生物。 （4）該微生物可引起每一個個體發(fā)?。?5］。但是，作為一種臨床檢驗方法，利用mNGS確認(rèn)的感染病例并不能夠完全滿足傳統(tǒng)Koch法則，作為該法則的補充，mNGS具有如下特征。1.mNGS結(jié)果分析：理論上，凡存在于標(biāo)本中的微生物均可檢出，但因不同類型微生物基因組長度和測序平臺等差異，導(dǎo)致無法針對所有1.mNGS結(jié)果分析：理論上，凡存在于標(biāo)本中的微生物均可檢出，但因不同類型微生物基因組長度和測序平臺等差異，導(dǎo)致無法針對所有微生物建立統(tǒng)一的陰陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)［7262728］。實驗室應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途、標(biāo)本類型、檢測目標(biāo)和技術(shù)特點，建立并驗證陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)。原則上mNGS的臨床意義同核酸檢測。另外，決定一個序列是否來自于某種微生物，很大程度上取決于用于比較的參考微生物序列數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中未包括該物種以及與其進化距離較近物種列是否來自于某種微生物，很大程度上取決于用于比較的參考微生物序列數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中未包括該物種以及與其進化距離較近物種的基因組序列可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。 2.mNGS結(jié)果確認(rèn)：如果檢出的微生物符合疾病特征則可能是引起感 染的病原微生物，但不能只從序列數(shù)多少確認(rèn)，需考慮序列在基因組上的覆蓋度、特異性及保守性［染的病原微生物，但不能只從序列數(shù)多少確認(rèn)，需考慮序列在基因組上的覆蓋度、特異性及保守性［1114］。該病原微生物可通過PCR等方法得到驗證，如呼吸道標(biāo)本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；糞便標(biāo)本中的志賀菌、沙門菌及諾如病毒等； CSF中的腸病毒、單純皰疹病毒及西尼羅河病毒等；血液中的布魯菌、巴爾通體及人類免疫 缺陷病毒等。如果檢出高序列數(shù)的某種未命名微生物，應(yīng)高度警惕新 物種的出現(xiàn)。3.mNGS陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)：報告單中的陽性閾值以百萬分子序列3.mNGS陽性閾值及判讀標(biāo)準(zhǔn)：報告單中的陽性閾值以百萬分子序列（如少于3避免報出與臨床不相關(guān)的環(huán)境菌、共生菌及條件致病菌等。一般序列數(shù)確定。陽性閾值的確定不依賴某個單一的指標(biāo)，包括但不限于特定微生物的檢出序列數(shù)、歸一化每百萬序列（readspermillion，RPM（如少于3避免報出與臨床不相關(guān)的環(huán)境菌、共生菌及條件致病菌等。一般序列數(shù)越高病原微生物的可能性越大（數(shù)十條特異性序列）。對于結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌等臨床關(guān)注度高、且較難檢測的病原菌可采用獨立的判讀標(biāo)準(zhǔn)，即檢出1條特異序列即可判為陽性［7，［7，28］。寄生蟲基因組因較為復(fù)雜，且與人源基因組相似，應(yīng)在嚴(yán)格確認(rèn)序列特異性之后再行判讀 ［14］如果檢出序列為新發(fā)物種，則可不受閾值限制，但需給出同源性比對結(jié)果。 4.微生物種群致?。簾o菌部位膿腫標(biāo)本可見多種病原微生物共檢出現(xiàn) 象。如腦膿腫、頸間隙膿腫、咽旁膿腫、口腔膿腫等，所檢出的微生物序列數(shù)均可能達(dá)到陽性閾值，多數(shù)為嚴(yán)格厭氧菌與兼性厭氧菌共生。這種因微生物種群而致病的現(xiàn)象稱為一個種群或一個微生物生態(tài)系統(tǒng)象。如腦膿腫、頸間隙膿腫、咽旁膿腫、口腔膿腫等，所檢出的微生物序列數(shù)均可能達(dá)到陽性閾值，多數(shù)為嚴(yán)格厭氧菌與兼性厭氧菌共生。這種因微生物種群而致病的現(xiàn)象稱為一個種群或一個微生物生態(tài)系統(tǒng)引起一種疾病，而非 Koch法則的一種病原菌引起一種疾病。盡管種群致病的理論還需進行深入探討，但隨著深度測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用， 這種現(xiàn)象在臨床上將得到更多驗證［ 29］。5.不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的結(jié)果驗證：mNGS針對標(biāo)本中所有病原5.不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物的結(jié)果驗證：mNGS針對標(biāo)本中所有病原微生物核酸序列，不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物不能通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法再現(xiàn)，且這類病原微生物同樣缺乏血清學(xué)或抗原檢測。除病毒、螺旋體、立克次體、寄生蟲外，這些微生物可通過核酸檢測驗證，測序同樣是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。6.致病菌、定植菌和污染菌：當(dāng)確定條件致病菌為病原菌時應(yīng)考慮患6.致病菌、定植菌和污染菌：當(dāng)確定條件致病菌為病原菌時應(yīng)考慮患者免疫狀態(tài)、基礎(chǔ)疾病及標(biāo)本來源。若出現(xiàn)大量背景菌或雜菌序列而無主導(dǎo)微生物應(yīng)首先考慮污染，其次考慮條件致病菌。如果外科手術(shù)或其他有創(chuàng)操作后，無菌部位來源的標(biāo)本，表現(xiàn)為細(xì)菌單一，序列數(shù)可能不高，應(yīng)結(jié)合臨床考慮醫(yī)院感染，此時應(yīng)與背景菌區(qū)分，不可一味認(rèn)為污染可能不高，應(yīng)結(jié)合臨床考慮醫(yī)院感染，此時應(yīng)與背景菌區(qū)分，不可一味認(rèn)為污染。mNGS不能區(qū)分微生物是定植還是感染。 mNGS檢測陰性對排除感染有意義，但也應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)作出正確的診斷［14，28］。7.高度傳染性微生物：針對具有高度傳染性的特殊病原微生物，實驗室應(yīng)根據(jù)相關(guān)衛(wèi)生行政部門的規(guī)定制定特殊報告程序，標(biāo)本上傳疾病7.高度傳染性微生物：針對具有高度傳染性的特殊病原微生物，實驗室應(yīng)根據(jù)相關(guān)衛(wèi)生行政部門的規(guī)定制定特殊報告程序，標(biāo)本上傳疾病（CenterforDiseaseControlandPreventionC，如當(dāng)出現(xiàn)像疑似O1群或O139群霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等，應(yīng)盡快采用其他方法驗證，如 PCR、血清學(xué)等，如果支持測序結(jié)果應(yīng)迅速反饋臨床和 CDC系統(tǒng)。8.提高測序深度：mNGS常規(guī)數(shù)據(jù)量對耐藥和毒力基因檢測有局限性［8.提高測序深度：mNGS常規(guī)數(shù)據(jù)量對耐藥和毒力基因檢測有局限性［8，30］，因其得到的微生物序列數(shù)不足樣本總序列的5%，特異性序列覆蓋度不到微生物基因組1%，在這種情況下進行耐藥基因、毒力島基因、轉(zhuǎn)錄組及代謝通路分析幾乎不可能。目前，有以下幾種做法可提高測序深度：（1）在常規(guī)測序深度下已明確了病原微生物，再提高測序數(shù)據(jù)量至可覆蓋該物種基因組80再提高測序數(shù)據(jù)量至可覆蓋該物種基因組80在宏基因組基礎(chǔ)上疊加固定的若干種耐藥基因進行靶向測序。研發(fā)降低人源核酸比例的創(chuàng)新方法， 獲得更多微生物測序數(shù)據(jù)量 ［4，7，31］。建議2mNGS作為一種新型檢測方法，其臨床意義仍未超出核酸檢測范疇，它補充了傳統(tǒng)病原微生物確認(rèn)的建議2mNGS作為一種新型檢測方法，其臨床意義仍未超出核酸檢測范疇，它補充了傳統(tǒng)病原微生物確認(rèn)的Koch法則。mNGS可檢測難培養(yǎng)、罕見或新發(fā)病原微生物，可同時給出多種病原微生物信息，因 此，在一份無菌部位來源的臨床標(biāo)本（尤其膿腫）中檢出微生物種群 （包括不同類別或同類不同種屬）不應(yīng)輕易視為污染。如果這些微生物的存在符合臨床診斷，應(yīng)給予抗菌藥物全覆蓋，這恰好體現(xiàn)了該技術(shù)對全面認(rèn)識病原微生物的優(yōu)越性。 mNGS物的存在符合臨床診斷，應(yīng)給予抗菌藥物全覆蓋，這恰好體現(xiàn)了該技術(shù)對全面認(rèn)識病原微生物的優(yōu)越性。 mNGS常規(guī)數(shù)據(jù)量對耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數(shù)據(jù)量。建議3如果檢出的病原微生物符合臨床預(yù)期， 應(yīng)確認(rèn)序列結(jié)果的準(zhǔn)確蓋度上。臨床醫(yī)生在解讀條件致病菌時，應(yīng)排除污染和背景微生物，考慮患者免疫狀態(tài)及與臨床表現(xiàn)的符合性。mNGS結(jié)果不能作為臨床性和特異性。為提高結(jié)果的特異性，降低錯誤率，即使病原微生物也 應(yīng)建立陽性閾值。陽性閾值建立在微生物特異序列數(shù)及其在基因組覆 蓋度上。臨床醫(yī)生在解讀條件致病菌時，應(yīng)排除污染和背景微生物，考慮患者免疫狀態(tài)及與臨床表現(xiàn)的符合性。mNGS結(jié)果不能作為臨床決策的唯一依據(jù)，結(jié)果陰性也需結(jié)合臨床排除感染。 二、mNGS檢測病原微生物的實驗室要求 mNGSmNGS是S［2該方法使單個DNA分子擴增成大量相同的 DNA，然后同步復(fù)制，以此增強熒光信號強度，從而讀出DNA序列。因此，mNGS具有通量高、讀長短、流程復(fù)雜、操作環(huán)節(jié)多、對實驗環(huán)境及人員要求高的特點。因此，對實驗室設(shè)施要求高，需要嚴(yán)格遵守臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法的相關(guān)規(guī)定。驗室管理暫行辦法的相關(guān)規(guī)定。（一）實驗室分區(qū)及人員要求 基本原則：即各區(qū)獨立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作，以達(dá)到 工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時［16］mNGS檢測分“干濕實驗”，“濕實驗”指從樣本處理到測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的整個測序過程，需要在標(biāo)準(zhǔn)的測序分區(qū)實驗室完成。一般“測試分區(qū)實驗室”分試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理與核酸提取區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)及測序區(qū)。“干實驗”指測序濕實驗”，“濕實驗”指從樣本處理到測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的整個測序過程，需要在標(biāo)準(zhǔn)的測序分區(qū)實驗室完成。一般“測試分區(qū)實驗室”分試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理與核酸提取區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)及測序區(qū)。“干實驗”指測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。擾，DNA和RNA操作（核酸提?。?yīng)分開。如在同一實驗室應(yīng)分兩個區(qū)域，主要儀器耗材包括生物安全柜、核酸提取儀、移液槍、離心單向工作流程：若實驗室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。 若未設(shè)緩沖間，從試劑準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)壓力依次遞減。為避免相互干 擾，DNA和RNA操作（核酸提?。?yīng)分開。如在同一實驗室應(yīng)分兩個區(qū)域，主要儀器耗材包括生物安全柜、核酸提取儀、移液槍、離心機、試劑及耗材等不可混用。如使用瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸及文庫 質(zhì)量，則需有單獨的電泳區(qū)。靶向測序 PCR應(yīng)在單獨的擴增區(qū)進行［33］。3.污染防控：應(yīng)定期進行環(huán)境評估，為了監(jiān)控污染需制定試劑、儀器3.污染防控：應(yīng)定期進行環(huán)境評估，為了監(jiān)控污染需制定試劑、儀器和實驗室物表定期消毒的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（standardoperationprocedureSOP）。還應(yīng)對無模板參考品或陽性對照中可能出現(xiàn)的污染物進行連續(xù)跟蹤，并使用保守的閾值標(biāo)準(zhǔn)（見第一章第三部分報告解讀原則3），最大程度減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生［告解讀原則3），最大程度減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生［9］。4.實驗室人員能力：實驗室人員應(yīng)參加相關(guān)培訓(xùn)，并獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)［27，34］。檢驗人員應(yīng)具備mNGS項目制定和質(zhì)量控制能力。報告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)背景，掌握相關(guān)臨床診療指南。疑難報告的簽發(fā)及結(jié)果解釋需咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。開展mNGS實驗室自建檢測項目（掌握相關(guān)臨床診療指南。疑難報告的簽發(fā)及結(jié)果解釋需咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。開展mNGS實驗室自建檢測項目（laboratory-developedtestsLDT）的實驗室同時還應(yīng)具備生物信息學(xué)分析的專業(yè)人員，生物信息學(xué)分析人員需熟練掌握 mNGS檢測原理及生物信息軟件，具備數(shù)據(jù)信息維護和管理、開發(fā)新算法及更新數(shù)據(jù)庫的能力。 建議建議4微生物檢測非靶向 mNGS實驗室至少應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)及測序區(qū)。實驗室工作流程應(yīng)為單向。若實驗室設(shè)有緩沖間，緩沖間統(tǒng)一為正壓或負(fù)壓。若未設(shè)緩沖間，壓力從試劑準(zhǔn)備區(qū)到測序區(qū)依次遞減。DNA和RNA核酸提取分區(qū)域進行。若開展靶向擴增NGS測序，應(yīng)額外增加擴增區(qū)及電泳區(qū)。若同時開展遺傳及腫瘤NGS，核酸提取及建庫過程不宜與之混用。報告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、病原微生物或分子生物學(xué)背景，罕見病原微生物結(jié)遺傳及腫瘤NGS，核酸提取及建庫過程不宜與之混用。報告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、病原微生物或分子生物學(xué)背景，罕見病原微生物結(jié)果解釋可咨詢相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?。若配備有生物信息學(xué)分析人員，需掌握mNGS微生物檢測軟件應(yīng)用，具備數(shù)據(jù)信息維護和管理、開發(fā)新算法及更新數(shù)據(jù)庫的能力。（二）檢測平臺（二）檢測平臺1.建立標(biāo)本前處理及核酸提取方法：標(biāo)本預(yù)處理方法和核酸提取技術(shù) 在使用前需經(jīng)過驗證。2.測序平臺的選擇：包括儀器設(shè)備的選擇、測序平臺質(zhì)量的評價及主流測序平臺類型3個方面。2.測序平臺的選擇：包括儀器設(shè)備的選擇、測序平臺質(zhì)量的評價及主流測序平臺類型3個方面。配備開展高通量測序檢測項目所需的所有儀器設(shè)備：優(yōu)先選擇國家藥配備開展高通量測序檢測項目所需的所有儀器設(shè)備：優(yōu)先選擇國家藥品監(jiān)品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批準(zhǔn)的測序平臺和配套試劑。測序平臺應(yīng)達(dá)到臨床預(yù)期：除開展?jié)M足臨床需求的項目外，測序通量、序列的準(zhǔn)確率、支持讀長、儀器性能驗證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及批量檢測能力等也是評價測序平臺質(zhì)量的重要指標(biāo)。測序平臺應(yīng)達(dá)到臨床預(yù)期：除開展?jié)M足臨床需求的項目外，測序通量、序列的準(zhǔn)確率、支持讀長、儀器性能驗證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及批量檢測能力等也是評價測序平臺質(zhì)量的重要指標(biāo)。主流測序平臺：目前， mNGS主流測序方法有邊合成邊測序、DNA主流測序平臺：目前， mNGS主流測序方法有邊合成邊測序、DNA納米球測序及半導(dǎo)體測序［ 3，32］。實驗室根據(jù)需要選擇適宜的檢測平臺，使用模擬樣本或臨床已知微生物樣本驗證測序全流程。表2列出了不同類型測序平臺的技術(shù)特點及環(huán)境要求。3.自動化測序平臺：mNGS微生物檢測的靈敏度與標(biāo)本背景有關(guān)，如組織標(biāo)本中含有大量人源基因組，導(dǎo)致微生物序列數(shù)占比減少，通過高效自動化測序平臺，增加測序深度可提高檢測靈敏度。自動化過程組織標(biāo)本中含有大量人源基因組，導(dǎo)致微生物序列數(shù)占比減少，通過高效自動化測序平臺，增加測序深度可提高檢測靈敏度。自動化過程降低人工操作、減低外源污染，實驗室分區(qū)簡化。已有文獻(xiàn)報道實現(xiàn) 生物信息分析和報告發(fā)送。了血液F尿液等標(biāo)本從文庫構(gòu)建到報告發(fā)放全自動化過程［6自動化平臺應(yīng)包括標(biāo)本前處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測序、 生物信息分析和報告發(fā)送。（三）生物信息平臺序列比對過濾、微生物物種檢測等過程［35,36,37］。目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析程序及軟件［ 3］。數(shù)據(jù)分析流程由多種分析軟件生物信息學(xué)分析（也稱“干實驗”）是 mNGS檢測中的重要部分，是對測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行處理和分析，包括但不限于數(shù)據(jù)質(zhì)控、人源 序列比對過濾、微生物物種檢測等過程［35,36,37］。目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析程序及軟件［ 3］。數(shù)據(jù)分析流程由多種分析軟件配套完成，包括數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件（如Fastp、Trimmomatic、FastQC等）、比對軟件（如Bowtie2BWAMAQSOAP2Blast等）、物種分析軟件（如SURPI、Taxonomer、MegaBLAST等）［26，38,39］。人源基因組和微生物基因組檢測數(shù)據(jù)庫有美國國家［26，38,39］。人源基因組和微生物基因組檢測數(shù)據(jù)庫有美國國家生物技術(shù)信息中心、美國病原體系統(tǒng)資源整合中心［生物技術(shù)信息中心、美國病原體系統(tǒng)資源整合中心［40］、真核生物病原體數(shù)據(jù)庫［41］及病毒病原數(shù)據(jù)分析資源庫［42］等，在構(gòu)建物種比對數(shù)據(jù)庫時可予以選擇，還有耐藥基因分析可考慮抗性基因數(shù)據(jù)［434445［46,47］等。隨著mNGS產(chǎn)品的體外診斷化發(fā)展，結(jié)合人工智能技術(shù)的自動化的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)已經(jīng)能夠提供給臨床實驗室。等。隨著mNGS產(chǎn)品的體外診斷化發(fā)展，結(jié)合人工智能技術(shù)的自動化的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)已經(jīng)能夠提供給臨床實驗室。建議5實驗室構(gòu)建mNGS技術(shù)平臺以擬開展的檢測項目及科研工作庫）、高通量測序、核酸擴增、產(chǎn)物分析、數(shù)據(jù)分析等全流程。采用模擬樣本或臨床已知病原體樣本對所有技術(shù)環(huán)節(jié)進行驗證，包括檢測為依據(jù)，充分論證不同檢測平臺的適用性，包括生物信息平臺。技術(shù)平臺的建設(shè)應(yīng)包含標(biāo)本處理、核酸提取、文庫構(gòu)建（DNA和RNA文庫）、高通量測序、核酸擴增、產(chǎn)物分析、數(shù)據(jù)分析等全流程。采用模擬樣本或臨床已知病原體樣本對所有技術(shù)環(huán)節(jié)進行驗證，包括檢測靈敏性、測序通量、序列質(zhì)量、讀取準(zhǔn)確率、支持讀長、儀器性能驗證、內(nèi)部質(zhì)控、測序周期及生物學(xué)信息分析能力。比對數(shù)據(jù)庫應(yīng)滿足各類微生物檢測需求。三、mNGS微生物檢測方法的建立三、mNGS微生物檢測方法的建立（一）標(biāo)本前處理染。根據(jù)申請要求提前準(zhǔn)備被檢測微生物所需的文庫資料及生物信息分析軟件。建立臨床標(biāo)本的前處理程序，包括復(fù)雜標(biāo)本、微量標(biāo)本和標(biāo)本液化、濃縮及去除宿主核酸等前處理方法和設(shè)備使用應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。 所有標(biāo)本應(yīng)具有唯一標(biāo)識，防止在信息錄入和標(biāo)本分揀過程中交叉污 染。根據(jù)申請要求提前準(zhǔn)備被檢測微生物所需的文庫資料及生物信息分析軟件。建立臨床標(biāo)本的前處理程序，包括復(fù)雜標(biāo)本、微量標(biāo)本和/或分枝桿菌等特殊微生物的破壁處理程序。建立RNA病毒、微生物游離核酸測序的前處理方法。建立組織標(biāo)本研磨方法，具體方法見表3。（二）核酸提?。ǘ┖怂崽崛?.使用經(jīng)性能確認(rèn)的核酸提取試劑：臨床標(biāo)本中存在不同類型的病原微生物，核酸提取方法的可重復(fù)性和提取效率對保證核酸的完整性及純度至關(guān)重要。實驗室應(yīng)根據(jù)臨床標(biāo)本類型和微生物種類建立針對性的標(biāo)準(zhǔn)化提取程序。建議使用經(jīng)性能驗證的商品化提取試劑及設(shè)備。的標(biāo)準(zhǔn)化提取程序。建議使用經(jīng)性能驗證的商品化提取試劑及設(shè)備。Bioanalyzer檢測如果大部分片段在 200血漿游離DNA除外140 nt）以下說明 DNA 降解嚴(yán)重，需重提。（3）Bioanalyzer檢測如果大部分片段在 200血漿游離DNA除外140 nt）以下說明 DNA 降解嚴(yán)重，需重提。（3）高質(zhì)量的RNAA260/A280應(yīng)在1.8~2.0，A260/A230應(yīng)>2。（4）微量的核酸采用Qubit熒光染料法進行定量測定［15］。3CSF50ATL（DX）研磨珠，低頻震蕩 10min，離心后取150μl。加入150裂解液和8裂解液和8蛋白酶30℃恒溫震蕩15min（若無恒溫震蕩儀，可用金屬浴代替，期間每3min混勻1次）；取裂解后的樣本300加入磁珠240震蕩混勻室溫靜置5min，上清提核酸。按照商品化的操作說明進行。 4.去除人源DNA的方法：多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低。因此，在核酸提取環(huán)節(jié)中可考慮建4.去除人源DNA的方法：多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低。因此，在核酸提取環(huán)節(jié)中可考慮建立高效去宿主DNA方法提高mNGS微生物檢測的靈敏度［4，48去除人源核酸的方法選擇需要結(jié)合臨床檢測目的，舉例如下。 去污劑處理：因人源細(xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂苷）裂解宿主細(xì)胞釋放DNA酶Ⅰ降解人源DNA，通常可使微生物富集效率提高 1000倍［49］低滲溶液破壞宿主細(xì)胞：使用細(xì)胞膜不透性的疊氮碘化丙錠結(jié)合暴露去污劑處理：因人源細(xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂苷）裂解宿主細(xì)胞釋放DNA在溶液中的宿主在溶液中的宿主DNA［48］?？辜谆疍NA磁珠：因人源DNA組中缺乏甲基化DNADNA磁珠可有效去除人源DNA3~5倍富集［26］。使用使用CRISPR-Cas9（基因編輯技術(shù)）RNA文庫較為有利，可提高非編碼rRNA序列含量，但對DNA文庫構(gòu)建意義不大，不推薦花費更大財力去除全部人源DNA5.qPCR預(yù)估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，對宿主及微生5.qPCR預(yù)估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，對宿主及微生物常用的標(biāo)志基因，如β肌動蛋白基因、甘油醛-316SrRNA基因等，進行實時熒光定量PCR（quantitativereal-timePCR）定量檢測，通過經(jīng)驗積累大概預(yù)估宿主殘余比例及有效數(shù)據(jù)比例，必要時可提高測序數(shù)據(jù)量。（三）文庫制備（三）文庫制備文庫制備是將基因組DNA片段化并在片段末端連接寡核苷酸接頭的過程，文庫質(zhì)量直接影響測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。目前常用的建庫方法有超聲波打斷建庫、酶切建庫及轉(zhuǎn)座酶建庫等，選用操作簡單的方法對降低污染有利。污染有利。1.明確核酸質(zhì)量及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)：實驗室根據(jù)文庫制備方法及測序平 臺明確起始核酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（純度、濃度）及文庫產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)（文庫濃度、 片段大小等）。2.建議使用配套試劑：若起始2.建議使用配套試劑：若起始DNA在10ng以上，可采用普通建庫試劑盒；若DNA在100pg~10ng之間，則采用超微量 DNA建庫試劑盒；若DNA量低于下限，應(yīng)先行全基因組擴增，再進行建庫。 3.構(gòu)建RNA文庫：逆轉(zhuǎn)錄前需在冰上操作，防止RNA降解。應(yīng)添加3.構(gòu)建RNA文庫：逆轉(zhuǎn)錄前需在冰上操作，防止RNA降解。應(yīng)添加RNA酶抑制劑，必要時在建庫前采用雜交捕獲法或核糖體分離法去除rRNA［15］。4.文庫質(zhì)量：可采用 Qubit熒光染料法檢測文庫濃度， qPCR檢測文庫中有效連接接頭的核酸濃度。上機前需根據(jù)不同的測序平臺對文庫濃度庫中有效連接接頭的核酸濃度。上機前需根據(jù)不同的測序平臺對文庫濃度的要求進行。高質(zhì)量的文庫DNA，其A260/A280 通常在1.75~2.00文庫片段大小為插入片段和接頭序列的總長度，合格文庫插入片段長度大于0p［5建議6實驗室應(yīng)具備針對不同類型臨床標(biāo)本的前處理方法，尤其針對建議6實驗室應(yīng)具備針對不同類型臨床標(biāo)本的前處理方法，尤其針對復(fù)雜和極微量標(biāo)本應(yīng)具備經(jīng)驗證的靈敏的手段。無論DNARNA核酸提取質(zhì)量應(yīng)滿足測序要求。在核酸提取的過程中應(yīng)引入經(jīng)驗證的降低人源核酸處理方法。推薦使用配套試劑構(gòu)建文庫，根據(jù)初始核酸 和宏基因組測序）要求。文庫制備方法需用已知臨床標(biāo)本或模擬樣品或質(zhì)控品進行驗證或開展實驗室間比對，合格后方可用于臨床。濃度選擇文庫建庫試劑盒，若 DNA量低于下限應(yīng)先行全基因組擴增 再進行建庫，文庫核酸濃度、純度及長度應(yīng)達(dá)到測序（包括靶向測序 和宏基因組測序）要求。文庫制備方法需用已知臨床標(biāo)本或模擬樣品或質(zhì)控品進行驗證或開展實驗室間比對，合格后方可用于臨床。（四）上機測序微生物檢測、耐藥基因檢測、微生物組學(xué)分析、宏基因組學(xué)分析等）、測序數(shù)據(jù)量指每個樣本測序所得的序列數(shù)或堿基數(shù)（ nt），二者可相微生物檢測、耐藥基因檢測、微生物組學(xué)分析、宏基因組學(xué)分析等）、互轉(zhuǎn)換，一般宏基因組測序用序列數(shù)表示。測序數(shù)據(jù)量與預(yù)期用途（如互轉(zhuǎn)換，一般宏基因組測序用序列數(shù)表示。測序數(shù)據(jù)量與預(yù)期用途（如樣本中微生物與人源核酸占比、測序靈敏度以及測序成本等因素相關(guān)。mNGS微生物檢測的靈敏度與標(biāo)本人源核酸含量有關(guān)，不同類型臨床樣本人源核酸平均含量不一樣，為保證結(jié)果可靠性，在相同樣本處理和核酸提取方法時，通常不同類型臨床標(biāo)本推薦不同測序數(shù)據(jù)量，原樣本人源核酸平均含量不一樣，為保證結(jié)果可靠性，在相同樣本處理和核酸提取方法時，通常不同類型臨床標(biāo)本推薦不同測序數(shù)據(jù)量，原則上背景簡單的標(biāo)本如CSF（人源核酸含量低）較低的測序數(shù)據(jù)量即可滿足病原微生物檢出。在條件允許的情況下可增加測序數(shù)據(jù)量以（如20M）隨機抽取15隨機抽取15M組成一個模擬的15M測序數(shù)據(jù)集模擬分析不同測序數(shù)據(jù)量、不同物種的檢測限，從而最終確定不同標(biāo)本類型的最佳測序數(shù)據(jù)量。通常靶向測序的數(shù)據(jù)量應(yīng)≥ 3萬條序列，宏基因組測序鳥槍法測序數(shù)據(jù)量應(yīng)≥2000萬（20million20M）高質(zhì)量序列，準(zhǔn)確度Q3085CSF600（6［26，35、0M［2每個標(biāo)本平均24M序列時，總體靈敏度達(dá)到 48%［50］，當(dāng)每個標(biāo)血液游離A20（40M［2每個標(biāo)本平均24M序列時，總體靈敏度達(dá)到 48%［50］，當(dāng)每個標(biāo)本平均數(shù)據(jù)量達(dá)到 33M序列時，總體靈敏度達(dá)到 71%［53］。（五）生物信息學(xué)分析生物信息分析是對測序得到的原始序列進行數(shù)據(jù)分析和處理的過程，以預(yù)定程序執(zhí)行。該流程由多個軟件組成，包括去除人源序列、處理生物信息分析是對測序得到的原始序列進行數(shù)據(jù)分析和處理的過程，以預(yù)定程序執(zhí)行。該流程由多個軟件組成，包括去除人源序列、處理微生物序列及相關(guān)元數(shù)據(jù)、檢測候選目標(biāo)微生物，實現(xiàn)檢測與數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析中應(yīng)考慮預(yù)期用途、軟硬件功能、數(shù)據(jù)存儲位置、版本號及信息備份等。同時應(yīng)確保患者信息安全，設(shè)置讀取規(guī)則、人員權(quán)限、數(shù)據(jù)異常提取的警報。目前已經(jīng)具有商業(yè)化的自動分析系統(tǒng)可以選擇，實驗室也可選擇與國際同步的算法和軟件，搭建實驗室自己權(quán)限、數(shù)據(jù)異常提取的警報。目前已經(jīng)具有商業(yè)化的自動分析系統(tǒng)可以選擇，實驗室也可選擇與國際同步的算法和軟件，搭建實驗室自己的分析流程，搭建過程中應(yīng)選已知陰陽性樣本或質(zhì)控品進行生物信息 學(xué)分析能力模擬測試。1.序列質(zhì)量：堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，用于評估下機序列數(shù)的準(zhǔn)確度。質(zhì)量值（Q）1.序列質(zhì)量：堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，用于評估下機序列數(shù)的準(zhǔn)確度。質(zhì)量值（Q）越高代表堿基被測錯的概率（P）兩者關(guān)系為 Q=-10lgP。Q20對應(yīng)的測序錯誤概率為1%、準(zhǔn)確率99%。Q30對應(yīng)的測序錯誤概率為 1‰、準(zhǔn)確率99.9%。常用Q20和Q30分別代表質(zhì)量值≥20或30的堿基所占百分比。實驗室應(yīng)要求 的高質(zhì)量序列再與人源基因組比對去除，剩余序列進入后續(xù)的微生物檢測分析［11，14,15］。保證Q30至少達(dá)到85%［54］。在對測序數(shù)據(jù)進行分析之前，應(yīng)首 先進行質(zhì)量控制，去除讀長過短（如 <50bp）和低質(zhì)量的序列，獲得的高質(zhì)量序列再與人源基因組比對去除，剩余序列進入后續(xù)的微生物檢測分析［11，14,15］。2.判讀標(biāo)準(zhǔn)：判讀標(biāo)準(zhǔn)與測序數(shù)據(jù)量密切相關(guān)，在生物信息學(xué)分析流 程搭建和優(yōu)化過程中，應(yīng)確定判讀標(biāo)準(zhǔn)，以區(qū)分陰陽性結(jié)果。實驗室應(yīng)對不同類型的臨床標(biāo)本和不同類型微生物建立不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)。判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括但不限于檢出序列數(shù)、基因組覆蓋度、微生物豐度、測應(yīng)對不同類型的臨床標(biāo)本和不同類型微生物建立不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)。判讀標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括但不限于檢出序列數(shù)、基因組覆蓋度、微生物豐度、測序深度、離散度、RPM比值等技術(shù)指標(biāo)［7，11142635］。高通量測序得到的是大量短序列（通常在100bp以內(nèi)），因此，當(dāng)序列比對到參考序列時，如同時出現(xiàn)人源和某種微生物，則優(yōu)先判為宿主序列。判讀為某微生物屬水平的序列數(shù)應(yīng)大于種水平。當(dāng)種水平序列比對到參考序列時，如同時出現(xiàn)人源和某種微生物，則優(yōu)先判為宿主序列。判讀為某微生物屬水平的序列數(shù)應(yīng)大于種水平。當(dāng)種水平序列數(shù)越接近屬水平，則該物種的可能性越高。比對到微生物的序列數(shù)與基因組測序覆蓋度呈正相關(guān)。實驗室可根據(jù)基因組覆蓋度、序列特異性等參數(shù)計算出病原微生物檢測可信度（%），便于臨床判斷。其他判讀方法：有文獻(xiàn)通過自建參考品先設(shè)定判讀標(biāo)準(zhǔn)，再采用臨床標(biāo)本進行判讀標(biāo)準(zhǔn)的確認(rèn)。也有文獻(xiàn)通過檢測一定數(shù)量的已知陰陽性其他判讀方法：有文獻(xiàn)通過自建參考品先設(shè)定判讀標(biāo)準(zhǔn)，再采用臨床標(biāo)本進行判讀標(biāo)準(zhǔn)的確認(rèn)。也有文獻(xiàn)通過檢測一定數(shù)量的已知陰陽性樣本，采用統(tǒng)計學(xué)方法，如受試者工作特征曲線或準(zhǔn)確率-召回率（precision-recall，PR）曲線來確定合理的判讀標(biāo)準(zhǔn)［ 27］。3.陽性閾值：判讀為陽性的界值即為陽性閾值。閾值的設(shè)置與檢出序列數(shù)、檢出序列的特異性、特異序列的基因覆蓋度、該物種同源性復(fù)3.陽性閾值：判讀為陽性的界值即為陽性閾值。閾值的設(shè)置與檢出序列數(shù)、檢出序列的特異性、特異序列的基因覆蓋度、該物種同源性復(fù)雜程度以及檢測靈敏度有關(guān)。即使病原微生物也應(yīng)制定陽性閾值。針對某些特殊傳染病病原微生物，在排除污染的前提下，即使檢出1條序列也應(yīng)視為陽性，如MTB［7［7，2955］。數(shù)據(jù)庫：包含兩個部分，即微生物檢測數(shù)據(jù)庫和人源數(shù)據(jù)庫。微生物檢測數(shù)據(jù)庫包含細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲基因組序列信息，其中支原體、衣原體、螺旋體、立克次體視情況可獨立也可并入細(xì)菌類別中。公共數(shù)據(jù)庫需經(jīng)驗證方可使用。構(gòu)建微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)優(yōu)先選擇全長參考基因組以及測序質(zhì)量高、樣本來源、臨床信息完整的序列。臨中。公共數(shù)據(jù)庫需經(jīng)驗證方可使用。構(gòu)建微生物數(shù)據(jù)庫應(yīng)優(yōu)先選擇全長參考基因組以及測序質(zhì)量高、樣本來源、臨床信息完整的序列。臨床重要的病原微生物應(yīng)入選具有時間和地域代表性的毒菌株基因組。有條件應(yīng)構(gòu)建科研數(shù)據(jù)庫二級數(shù)據(jù)，以確保重要的病原微生物不錯報、不漏報。人源數(shù)據(jù)庫是為去除人源序列干擾而設(shè)計，包含染色體基因組、線粒體基因組及轉(zhuǎn)錄組等序列信息。收錄的信息應(yīng)確保準(zhǔn)確、完整、有詳細(xì)注釋，不是越多越好。推薦采用模擬數(shù)據(jù)對數(shù)據(jù)庫的有效性進行驗證（見本文第四章第三節(jié)分析性能確認(rèn)）［組、線粒體基因組及轉(zhuǎn)錄組等序列信息。收錄的信息應(yīng)確保準(zhǔn)確、完整、有詳細(xì)注釋，不是越多越好。推薦采用模擬數(shù)據(jù)對數(shù)據(jù)庫的有效性進行驗證（見本文第四章第三節(jié)分析性能確認(rèn)）［56］。具備數(shù)據(jù)庫更新能力：實驗室應(yīng)持續(xù)跟蹤使用版本的數(shù)據(jù)庫。應(yīng)使 用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集對更新后的數(shù)據(jù)庫進行驗證，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可 重復(fù)性。6.建立背景微生物數(shù)據(jù)庫：mNGS可能含有多種微生物信息，其中不6.建立背景微生物數(shù)據(jù)庫：mNGS可能含有多種微生物信息，其中不乏正常菌群、污染微生物及背景微生物［57］。應(yīng)建立人體不同部位正常種群數(shù)據(jù)庫，并納入報告分析解讀流程。雖然有些微生物存在于標(biāo)本中，但與疾病無關(guān)，應(yīng)在報告中去除或說明。此外，mNGS流程中所用的各種試劑中也可能存在微生物個體或核酸，應(yīng)建立試劑背景微生物序列數(shù)據(jù)庫，在報告中予以去除。中所用的各種試劑中也可能存在微生物個體或核酸，應(yīng)建立試劑背景微生物序列數(shù)據(jù)庫，在報告中予以去除。值低的序列及短重復(fù)序列等。由于mNGS為批量標(biāo)本平行上機測序，難以完全避免標(biāo)簽跳躍，應(yīng)通過技術(shù)手段與分析流程防止高拷貝微生7.建立錯誤數(shù)據(jù)修正機制：mNGS同樣存在測序錯誤的情況，因此需去除原始下機數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，包括測序接頭污染的序列、質(zhì)量值低的序列及短重復(fù)序列等。由于mNGS為批量標(biāo)本平行上機測序，難以完全避免標(biāo)簽跳躍，應(yīng)通過技術(shù)手段與分析流程防止高拷貝微生物序列污染平行上機樣本。 建議7實驗室需通過已知標(biāo)本確立不同類型標(biāo)本個性化的測序數(shù)據(jù) 量、驗證序列質(zhì)量值、確定判讀標(biāo)準(zhǔn)及不同類型微生物陽性閾值。在進行序列比對時掌握如下原則：序列比對一致性相同優(yōu)先考慮人源序列，該序列與數(shù)據(jù)庫中微生物種屬匹配度高、屬水平序列數(shù)大于種水量、驗證序列質(zhì)量值、確定判讀標(biāo)準(zhǔn)及不同類型微生物陽性閾值。在進行序列比對時掌握如下原則：序列比對一致性相同優(yōu)先考慮人源序列，該序列與數(shù)據(jù)庫中微生物種屬匹配度高、屬水平序列數(shù)大于種水平、種序列數(shù)越接近屬水平則確認(rèn)該種的可能性越大、結(jié)果的可靠性與基因組覆蓋度成正比、低于陽性閾值的病原微生物不可輕易放過， 需結(jié)合臨床或復(fù)檢或重留標(biāo)本再測。 建議8實驗室應(yīng)使用國際公認(rèn)或經(jīng)驗證或文獻(xiàn)推薦的公共數(shù)據(jù)庫，包建議8實驗室應(yīng)使用國際公認(rèn)或經(jīng)驗證或文獻(xiàn)推薦的公共數(shù)據(jù)庫，包括人源數(shù)據(jù)庫與微生物數(shù)據(jù)庫。實驗室可在臨床用庫的基礎(chǔ)上建立二級科研數(shù)據(jù)庫，以便應(yīng)對罕見或新發(fā)微生物。建立生物信息學(xué)分析程序并進行性能確認(rèn)，確定測序數(shù)據(jù)量與不同類型微生物的判讀標(biāo)準(zhǔn)。生物信息學(xué)分析程序滿足預(yù)期檢測性能參數(shù)，結(jié)果應(yīng)符合預(yù)期要求。實驗室應(yīng)建立監(jiān)測生物信息學(xué)分析程序，記錄分析流程中各組分改變或版本更新（如軟件升級、數(shù)據(jù)庫更新、腳本更改等），定義流程及實驗室應(yīng)建立監(jiān)測生物信息學(xué)分析程序，記錄分析流程中各組分改變或版本更新（如軟件升級、數(shù)據(jù)庫更新、腳本更改等），定義流程及數(shù)據(jù)庫的版本號，以保證報告的可溯源性。 （六）檢驗報告1.基本要求：過濾后的序列才可用于微生物檢測報告，用于種屬檢測的短序列應(yīng)為特異序列，特異序列作為最后報告的陽性閾值。正式報1.基本要求：過濾后的序列才可用于微生物檢測報告，用于種屬檢測的短序列應(yīng)為特異序列，特異序列作為最后報告的陽性閾值。正式報告單應(yīng)包括測序總序列數(shù)、內(nèi)標(biāo)檢測數(shù)據(jù)量、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、檢測方法及檢測技術(shù)說明。同時對相關(guān)專業(yè)術(shù)語進行解釋說明，并注明檢測方法的局限性、檢測的靈敏度和特異性以及疑似背景微生物等。由于測序可檢出以往罕見的病原菌，需解釋物種來源、致病性、流行病學(xué)特點及最新研究結(jié)論等［的局限性、檢測的靈敏度和特異性以及疑似背景微生物等。由于測序可檢出以往罕見的病原菌，需解釋物種來源、致病性、流行病學(xué)特點及最新研究結(jié)論等［58］?？蒲?mNGS報告應(yīng)滿足用戶要求。實驗室應(yīng)保留所有檢出的微生物參數(shù)，包括但不限于比對序列數(shù)、相對豐 度、基因組覆蓋度和測序深度等。 2.報告單的使用：從技術(shù)角度講， mNGS2.報告單的使用：從技術(shù)角度講， mNGS陽性或陰性結(jié)果不能作為臨床診療決策的唯一依據(jù)，即使無菌部位標(biāo)本的 mNGS結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他檢查結(jié)果進行綜合判斷。mNGS檢出或未檢出某物種的核酸片段，提示患者標(biāo)本中含有或不含有該物種核酸，但不能明確該物種與感染的關(guān)系，即mNGS陽性不一定是病原微生物。另一方面，受取樣及病程變化、測序策略本身的靈敏度局限、實驗室檢測能力和生物信息學(xué)分析水平的影響，mNGS檢測陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床進行受取樣及病程變化、測序策略本身的靈敏度局限、實驗室檢測能力和生物信息學(xué)分析水平的影響，mNGS檢測陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床進行判定。從法律角度講，無認(rèn)證實驗室的檢測結(jié)果不能成為診斷依據(jù)，僅做研究所用。因此目前國內(nèi)任何實驗室出具的mNGS微生物檢測報告均不可直接用于臨床診斷，也不應(yīng)成為醫(yī)療文書［59］。建議建議9用于臨床輔助診斷的 mNGS報告應(yīng)包括測序總序列數(shù)、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數(shù)量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術(shù)說明。mNGS結(jié)果的本質(zhì)與PCR相似，代表臨床標(biāo)本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，不能明確該物種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢查結(jié)果進行綜合判斷。物種與感染的關(guān)系，即使陰性結(jié)果也需結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他檢查結(jié)果進行綜合判斷。四、性能確認(rèn)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的儀器與試劑，如果改變獲批試劑制定的預(yù)期用 分析軟件均需進行性能確認(rèn)［ 16］。途、試劑組分、操作流程等，則按照 LDT試劑要求進行管理，在開展臨床服務(wù)之前所有與 mNGS有關(guān)的儀器、試劑、檢測流程、數(shù)據(jù)庫及分析軟件均需進行性能確認(rèn)［ 16］。（一）測序平臺的性能確認(rèn) 照說明書所注明的儀器性能指標(biāo)逐項驗證，達(dá)到廠方聲稱的指標(biāo)并滿足臨床預(yù)期用途為合格。依據(jù)檢測項目及臨床預(yù)期用途，綜合考慮測序讀長和通量、測序準(zhǔn)確 率、運行時間、測序成本等選擇測序平臺。安裝時，由廠方工程師按 照說明書所注明的儀器性能指標(biāo)逐項驗證，達(dá)到廠方聲稱的指標(biāo)并滿足臨床預(yù)期用途為合格。（二）生物信息分析平臺的性能確認(rèn) 實驗室可以選擇商業(yè)化的自動分析系統(tǒng)，也可需根據(jù)檢測項目和預(yù)期 用途選擇合適的算法和軟件，搭建本實驗室的生物信息學(xué)分析流程，并進行必要的性能確認(rèn)，以保證對病原微生物檢測的準(zhǔn)確性。性能確用途選擇合適的算法和軟件，搭建本實驗室的生物信息學(xué)分析流程，并進行必要的性能確認(rèn)，以保證對病原微生物檢測的準(zhǔn)確性。性能確認(rèn)包括但不限于最低測序數(shù)據(jù)量及堿基識別質(zhì)量值等，實驗室應(yīng)根據(jù)國際上本領(lǐng)域發(fā)展不斷優(yōu)化分析平臺。臨床標(biāo)本的測序數(shù)據(jù)是進行性能確認(rèn)時最重要的數(shù)據(jù)，即臨床標(biāo)本mNGS全流程檢測后得到的測序數(shù)據(jù)。計算機模擬的測序數(shù)據(jù)可通過數(shù)據(jù)模擬軟件ART等軟件生成［59,60］。但是計算機模擬和參考物質(zhì)的測序數(shù)據(jù)只能作為補充數(shù)數(shù)據(jù)。計算機模擬的測序數(shù)據(jù)可通過數(shù)據(jù)模擬軟件ART等軟件生成［59,60］。但是計算機模擬和參考物質(zhì)的測序數(shù)據(jù)只能作為補充數(shù)據(jù)，不能完全替代臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)。（三）分析性能確認(rèn)分析性能確認(rèn)包括從臨床樣本前處理到生物信息學(xué)分析的全過程，觀 察指標(biāo)至少應(yīng)包含精密度、準(zhǔn)確度、可報告范圍、分析敏感性、分析特異性等。特異性等。同日間、不同人員、不同儀器（相同型號）至少進行3次以上檢測，評價再現(xiàn)性精密度?？蛇x擇高、低2個不同梯度的參考品進行驗證，精密度：指在規(guī)定條件下所獲得的多次獨立檢測結(jié)果的一致度，評價檢測方法的重復(fù)性。包括對同一批樣本在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）至少進行3同日間、不同人員、不同儀器（相同型號）至少進行3次以上檢測，評價再現(xiàn)性精密度?？蛇x擇高、低2個不同梯度的參考品進行驗證，>90［13］。準(zhǔn)確度：是指與真陽樣本、真陰樣本結(jié)果或金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果的 符合率。對準(zhǔn)確度的評價可通過兩部分進行。符合率。對準(zhǔn)確度的評價可通過兩部分進行。NMPA已獲批或被普遍接受的金標(biāo)準(zhǔn)方法與mNGSmNGS與金標(biāo)準(zhǔn)方法之間的差異，不一致的結(jié)果再用第3合率評價定性測定的準(zhǔn)確度［ 合率評價定性測定的準(zhǔn)確度［ 16，35，61,62］。通過參考品驗證：mNGS目前尚無國際或國家參考品，實驗室可自制通過參考品驗證：mNGS目前尚無國際或國家參考品，實驗室可自制企業(yè)參考品進行驗證。如在明確陰性或健康人標(biāo)本中摻入不同類型病原體的標(biāo)準(zhǔn)參考品（如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等）制備模擬陽性 率應(yīng)大于90［26，62］。樣本，建議使用 8~10種病原微生物（包括 RNA率應(yīng)大于90［26，62］。最低檢測限（limitofdetection，LoD）：用于描述測序方法的分析敏感性，它是指能夠通過測序獲得準(zhǔn)確目標(biāo)微生物的最低濃度，一般要求可信度≥9510103計算出LoD值，并在該LoD濃度進行20次以上重復(fù)，確保 95%的檢出。實驗室需要建立不同樣本類型、不同代表物種的LoD［63］。分析特異性：分析特異性主要評價樣本中潛在干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果 的影響。mNGS最大的干擾物是人源核酸，高濃度的宿主背景可嚴(yán)重降低檢測靈敏度。痰標(biāo)本需增加黏蛋白對結(jié)果干擾程度的評估。血液的影響。mNGS最大的干擾物是人源核酸，高濃度的宿主背景可嚴(yán)重降低檢測靈敏度。痰標(biāo)本需增加黏蛋白對結(jié)果干擾程度的評估。血液標(biāo)本需增加血紅蛋白干擾程度評估。應(yīng)使用接近臨床真值的干擾物濃度進行驗證，建議包含每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度。可將不同含量的干擾物質(zhì)分別添加到陽性樣本中，以評估干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾程度。mNGS分析特異性還需考慮近源物種的交叉反應(yīng)，即鑒別不同亞種、亞型的能力［擾程度。mNGS分析特異性還需考慮近源物種的交叉反應(yīng)，即鑒別不同亞種、亞型的能力［4，2650］?？蓤蟾娣秶簃NGS的可報告范圍理論上應(yīng)為參考數(shù)據(jù)庫中包含的 重新進行確認(rèn)。在準(zhǔn)確度驗證中，應(yīng)確認(rèn)可報告范圍，實驗室在日常檢測中，應(yīng)對可報告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)［26］。所有微生物，在對參考數(shù)據(jù)庫進行更新升級時，可報告范圍也相應(yīng)發(fā) 生變化。實驗室應(yīng)在數(shù)據(jù)庫升級時對可報告范圍和上述各項性能指標(biāo) 重新進行確認(rèn)。在準(zhǔn)確度驗證中，應(yīng)確認(rèn)可報告范圍，實驗室在日常檢測中，應(yīng)對可報告范圍持續(xù)關(guān)注和確認(rèn)［26］。（四）性能確認(rèn)的樣本要求 1.代表性：涵蓋不同類型微生物的各類感染標(biāo)本是理想的性能驗證樣 本。未經(jīng)性能驗證的標(biāo)本類型應(yīng)被視為無法準(zhǔn)確得到結(jié)果的樣本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模擬樣本代替。不同類型微本。未經(jīng)性能驗證的標(biāo)本類型應(yīng)被視為無法準(zhǔn)確得到結(jié)果的樣本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模擬樣本代替。不同類型微生物應(yīng)特別強調(diào)結(jié)核分枝桿菌、絲狀真菌、RNA病毒及寄生蟲。不同類型的臨床標(biāo)本特別強調(diào)血液、CSFBALF腔積液。2.樣本量：進行分析性能驗證的樣本量需達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。有文獻(xiàn)建2.樣本量：進行分析性能驗證的樣本量需達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。有文獻(xiàn)建議精密度確認(rèn)至少需3份樣本，準(zhǔn)確度評價至少檢測59份樣本，進行LoD評價時至少需要檢測20次。如果短時間內(nèi)無法獲得豐富的樣PCR已知微生物的人源DNA（CSF及血漿）及高含人源 DNA樣本（痰及及血漿）及高含人源 DNA樣本（痰及BALF）各2份進行驗證，如果可準(zhǔn)確檢出，則認(rèn)為系統(tǒng)滿足mNGS使用。其他類型樣本可在實踐中逐步補充完善［62，64］。（五）臨床性能確認(rèn)床醫(yī)生的判斷等。如果疾病種類、標(biāo)本類型及病原微生物的覆蓋度無法達(dá)到臨床性能確認(rèn)的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實驗室可從無癥狀對照組獲得臨臨床性能確認(rèn)包括臨床敏感性和特異性。實驗室需結(jié)合臨床信息對檢 測結(jié)果進行臨床性能確認(rèn)，如常規(guī)檢查、影像學(xué)檢查、臨床表現(xiàn)及臨 床醫(yī)生的判斷等。如果疾病種類、標(biāo)本類型及病原微生物的覆蓋度無法達(dá)到臨床性能確認(rèn)的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實驗室可從無癥狀對照組獲得臨床特異性的指標(biāo)。此外，也可根據(jù)文獻(xiàn)建立臨床性能確認(rèn)指標(biāo)［7，2635］。建議建議10使用NMPA批準(zhǔn)的mNGS試劑應(yīng)進行分析性能驗證， LDT試劑應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途進行方法設(shè)計和優(yōu)化，并對檢測全流程進行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)包含不同類型樣本及重要病原微生物，如果沒有足夠的臨床樣本可用模擬樣本代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、分析特異性和可報告范圍等。在確認(rèn)分析性能后建立“濕實驗”和“干實驗”的SOP分析性能后建立“濕實驗”和“干實驗”的SOP限性。若實驗室流程改變需進行全面或部分性能再確認(rèn)。五、質(zhì)量保證（一）質(zhì)量要素質(zhì)量要素包括核酸提取的濃度和純度、文庫構(gòu)建所需的核酸量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序數(shù)據(jù)量、符合要求質(zhì)量值的堿基百分比（質(zhì)量要素包括核酸提取的濃度和純度、文庫構(gòu)建所需的核酸量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序數(shù)據(jù)量、符合要求質(zhì)量值的堿基百分比（如Q30）以及檢測的局限性、檢測全過程SOP（采樣要求、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機測序、生物信息學(xué)分析等）及其他參數(shù)（內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控品、分析參數(shù)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫等）。若試劑、 軟件及其版本、參數(shù)和數(shù)據(jù)庫發(fā)生改變，實驗室應(yīng)根據(jù)影響程度進行 全流程或部分環(huán)節(jié)的再確認(rèn)［ 26，64,65,66］。（二）分析前（二）分析前實驗室應(yīng)針對不同樣本類型（如肺泡灌洗液、痰液、血液、CSF腫、組織等）、采集方法、采集容器、采樣量、運送及保存條件等制定SOP文件并進行確認(rèn)，保證標(biāo)本質(zhì)量，避免交叉污染。應(yīng)制定臨床標(biāo)本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，對不滿足接收標(biāo)準(zhǔn)又無法重新取樣的標(biāo)本，實驗室與臨床溝通后實施讓步檢測（雖然標(biāo)本不合格，但難以再次獲得，標(biāo)本接收和拒收