巨噬細(xì)胞IL-10和TNF-α在人慢性牙周炎牙齦組織中表達(dá)的研究分析 醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文題名（中英對(duì)照）：巨噬細(xì)胞IL-10和TNF-α在人慢性牙周炎牙齦組織中表達(dá)的研究IL-10andTNF-αexpressiononmacrophageingingivaltissueofhumanchronicperiodontiti中文摘要背景及目的：牙周?。╬eriodontitisdiseases）是發(fā)生于牙齒周?chē)M織的炎癥性疾病，為口腔兩大疾病之一，是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因。牙周炎被認(rèn)為是多因素疾病，目前認(rèn)為牙周病的始動(dòng)因子為牙菌斑生物膜。牙周致病菌不僅對(duì)牙周組織造成直接損傷，還可以通過(guò)刺激、調(diào)控宿主的免疫防御系統(tǒng)間接損傷牙周組織，目前認(rèn)為這種免疫炎癥反應(yīng)對(duì)牙周組織的損傷遠(yuǎn)超過(guò)了微生物對(duì)組織的直接作用。巨噬細(xì)胞（microphage,Mφ）是機(jī)體防御反應(yīng)的第一道防線，是固有免疫的重要組成部分，能對(duì)細(xì)菌或異物進(jìn)行識(shí)別、吞噬以及清除。IL-10（interleukin-10）是一種多功能細(xì)胞因子，可抑制T淋巴細(xì)胞功能以及單核/巨噬細(xì)胞的活化和效應(yīng)作用，對(duì)不同類(lèi)型的造血細(xì)胞也發(fā)揮不同的作用。IL-10主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，能有效抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF（tumornecrosisfactor）等Th1細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抑炎作用。TNF-α主要由活化的Mφ和Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其合成黏附因子，進(jìn)而使白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞（neutrophil）以及單核細(xì)胞（monocytes）向血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelialcells，EC）黏附以及向組織內(nèi)游出，從而發(fā)揮抗炎的作用。IL-10、TNF-α參與了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程。目前有關(guān)Mφ表達(dá)IL-10、TNF-α在慢性牙周炎領(lǐng)域尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察慢性牙周炎的牙齦組織中Mφ表達(dá)IL-10、TNF-α的情況，分析Mφ分泌的IL-10、TNF-α在牙周感染中的作用及其作用機(jī)制。研究結(jié)果將對(duì)后續(xù)以MφIL-10、TNF-α為靶點(diǎn)研究慢性牙周炎的免疫預(yù)防提供分子理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：選取自愿接受研究的80名慢性牙周炎患者，依據(jù)慢性牙周炎的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分為4組：1)正常對(duì)照組20例；2)輕度慢性牙周炎組20例；3)中度慢性牙周炎組20例；4)重度慢性牙周炎組20例。牙齦標(biāo)本采用10%中性福爾馬林固定液浸泡處理，浸泡時(shí)間超過(guò)48h，制作頰舌向5μm的牙齦組織切片。H&E染色后光學(xué)顯微鏡下觀察其組織學(xué)變化。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry,IHC)，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織中Mφ（CD14+）募集以及CD14+、IL-10+、TNF-α+的表達(dá)，并計(jì)算出平均陽(yáng)性細(xì)胞率；然后采用免疫熒光雙染色（doubleimmunofluorescence,DIF）進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡下觀察牙齦組織標(biāo)本中的CD14+-IL-10+及CD14+-TNF-α+，并計(jì)算CD14+-IL-10+、CD14+-TNF-α+的細(xì)胞密度(cells/mm2)。采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)計(jì)算所得數(shù)據(jù)作分析和處理，采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)、Nemenyi法檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-wayANOVA)和Pearson相關(guān)分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1、組織學(xué)觀察結(jié)果1）與正常對(duì)照組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的牙齦組織中炎癥細(xì)胞均顯著增加(P＜0.01)；2）隨著牙周炎病變程度的加重，牙齦組織中炎癥細(xì)胞顯著增加(P＜0.01)。2、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的CD14平均陽(yáng)性細(xì)胞率均顯著上升(P＜0.01）；2）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的IL-10平均陽(yáng)性細(xì)胞率表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.01)；3）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率表達(dá)水平均顯著上升(P＜0.01)。3、免疫熒光雙染色結(jié)果1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+細(xì)胞密度均顯著下降(P＜0.01)；2）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者CD14+-TNF-α+細(xì)胞密度均顯著上升(P＜0.01)。4、慢性牙周炎的病變程度與Mφ平均陽(yáng)性細(xì)胞率、CD14+-IL-10+細(xì)胞以及CD14+-TNF-α+細(xì)胞三者之間的相關(guān)性經(jīng)Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示：1）慢性牙周炎的病變程度與各組Mφ平均陽(yáng)性細(xì)胞率、CD14+-TNF-α+細(xì)胞密度之間的相關(guān)性為顯著的正相關(guān)的關(guān)系；2）慢性牙周炎的病變程度與CD14+-IL-10+細(xì)胞密度之間的相關(guān)性為顯著的負(fù)相關(guān)的關(guān)系。結(jié)論：1、Mφ平均陽(yáng)性細(xì)胞率隨著牙周炎的嚴(yán)重程度的加重而顯著上升。2、CD14+-TNF-α+細(xì)胞密度隨著牙周炎的嚴(yán)重程度的加重而顯著上升。3、CD14+-IL-10+細(xì)胞密度隨著牙周炎的嚴(yán)重程度的加重而顯著下降。在牙周炎的過(guò)程中，牙齦組織中的Mφ參與了牙周的抗感染免疫應(yīng)答；Mφ分泌的IL-10、TNF-α在慢性牙周炎過(guò)程中，通過(guò)抑炎和抗炎作用在免疫調(diào)控中可能起到關(guān)鍵性因子的作用。關(guān)鍵詞：慢性牙周炎；巨噬細(xì)胞；IL-10；TNF-αAbstractBackgroundandobjectivePeriodontitisareinflammatorydiseasesthatoccurinperiodontaltissues,leadingtothelossofteeth.Periodontitisisconsideredtobeamultifactorialdisease,anditiscurrentlybelievedthattheplaquebiofilmisafactorinthepathogenesisofperiodontaldisease.Periodontalpathogensnotonlycausedirectdamagetotheperiodontaltissues,butalsoindirectlydamagetheperiodontaltissuesbystimulatingandregulatingthehost'simmunedefensesystem.Atpresent,itisbelievedthatthedamageoftheperiodontaltissuebythisimmuneandinflammatoryreactionfarexceedsthedirecteffectofthemicroorganismonthetissue.Althoughmuchresearchhasbeenconductedontheimmunemechanismsofperiodontaldisease,thetypeofimmunecellsinvolvedinperiodontaldiseaseandtheimmunemechanismshasnotbeenelucidated.Mφ(Macrophage)isthefirstlineofdefenseofthebody'sdefenseresponsewhichisanimportantcomponentofinnateimmunity.Itcanrecognize,phagocytose,andremovebacteriaorforeignbodies.IL-10(interleukin-10)isamultifunctionalcytokinethatinhibitsTlymphocytefunctionandtheactivationofmonocytes/macrop-ages.Therearealsodifferencesintheeffectsofdifferenttypesofhematopoieticcells.IL-10ismainlyproducedbyTh2cellsandcaneffectivelyinhibitIL-1α,IL-1β,IL-6,IL-12,GM-CSF,TNF(tumornecrosisfactor)andothercytokines,thusplayingananti-inflammatoryrole.TNF-αismainlycomposedofactivationofMφandTh1cellssecretecytokinesecretioninvascularendothelialcells,inducingthesynthesisadhesionfactor,thusmakesleucocyteespeciallyneutrophilsandmononuclearcells,monocytestovascularendothelialcells(EC)adhesionandswamouttotheorganization,soastoplaytheroleofanti-inflammatory.Il-10andTNF-αwereinvolvedintheregulationofThcellimmuneresponse.Atpresent,thereisnoreportontheexpressionofIl-10andTNF-αMφinchronicperiodontitis.Inthisstudy,WeobservedtheexpressionofIl-10andTNF-αMφinchronicperiodontitisgingivaltissue,andanalyzedtheroleandmechanismofIL-10andTNF-αinperiodontalinfection.Theresultsofthestudywillprovidetheoreticalbasisandexperimentalbasisforthefollow-upstudyontheimmunecontrolofchronicperiodontitis,whichistargetedbyMφIL-10andMφTNF-α.MethodsEightypatientswithchronicperiodontitiswhovolunteeredtoreceivethestudyweredividedintofourgroupsaccordingtotheclassificationcriteriaofchronicperiodontitis:1)20patientsinthenormalcontrolgroup;2)20patientsinthemildchronicperiodontitis;3)20patientsinthemoderatechronicperiodontitis;4)20patientsintheseverechronicperiodontitis.Gingivalspecimensweresoakedin10%neutralformalinandsoakedformorethan48hours,andthebuccaltonguewasmadetothegingivaltissueof5μm.AfterH&Estaining,histologicalchangeswereobservedunderalightmicroscope.ImmunohistochemicalstainingwasusedtoobservetherecruitmentofMφ(CD14+)andtheexpressionofCD14+,IL-10+andTNF-α+inthetissueunderanopticalmicroscope,andtheaveragepositivecellratewascalculated.TheCD14+-IL-10+andCD14+-TNF-α+inthetissuesamplesofthegingivaltissuewereobservedunderfluorescencemicroscopeandconfocalmicroscopy,andthedensityofCD14+-IL-10+andCD14+-TNF-α+(cells/mm2)wascalculated.ThestatisticalsoftwareSPSS13.0wasusedtoanalyzeanddealwiththecomputeddata,usingWilcoxonsymbolranktest,Kruskal-wallisHtest,Nemenyimethodtest,Singlefactorvarianceanalysis(one-wayANOVA)andPearsoncorrelationanalysis,P＜0.05thedifferencewasregardasstatisticallysignificant.Results1.Histologicalobservations1)Comparedtothenormalcontrolgroup,inflammatorycellsinthegingivaltissuesofthreegroupsofchronicperiodontitisweresignificantlyincreased(P<0.01);2)inflammatorycellsinthegingivaltissueincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontitis(P<0.01).2.Immunohistochemicalstainingresults1)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofCD14averagepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisremarkablyincreased(P<0.01);2)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofIL-10averagepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisreducedremarkably(P<0.01);3)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofTNF-αaveragepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisincreasedsignificantly(P<0.01).3.Immunofluorescencedoublestainingresults1)Comparedwiththenormalgroup,theCD14+-IL-10+cellsdensityinthethreegroupsofchronicperiodontitiswassignificantlyreduced(P<0.01);2)Comparedwiththenormalgroup,thedensityofCD14+-TNF-α+cellsinthethreegroupsofpatientswithchronicperiodontitisincreasedsignificantly(P<0.01).4.CorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositiverateofMφ,CD14+-IL-10+cellsandCD14+-TNF-α+cellsByPearsoncorrelationanalysis,theresultsshowedthat:1)ThecorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositivecellrateofMφandCD14+-TNF-α+celldensitywasasignificantpositivecorrelation;2)ThecorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositivecellrateofCD14+-IL-10+celldensitywasasignificantnegativelycorrelation.Conclusion1.TheaveragepositivecellrateofMφincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.2.TheCD14+-TNF-α+celldensityincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.3.TheCD14+-IL-10+celldensitydecreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.Theprocessofperiodontitis,Mφingingivaltissueparticipatesintheperiodontalanti-infectiousimmuneresponse.IL-10andTNF-αsecretedbyMφmayplayakeyroleinimmuneregulationthroughanti-inflammatoryandanti-inflammatoryeffectsduringchronicperiodontitis.KeywordsChronicperiodontitis;Macrophage;IL-10;TNF-α目錄中文摘要……………..Ⅰ英文摘要………….Ⅳ目錄…………………..Ⅷ前言…………………...11.牙周病的病因和發(fā)病機(jī)制………..12.Mφ分泌的IL-10與牙周炎關(guān)系的研究進(jìn)展…….33.Mφ分泌的TNF-α與牙周炎關(guān)系的研究進(jìn)展…………………...84.本課題的研究目的和意義……….10材料與方法…………..121.實(shí)驗(yàn)器材…………122.病例選擇、分組及標(biāo)本收集…………………….143.實(shí)驗(yàn)操作方法…………………….154.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析……………………….20結(jié)果…………………..21組織學(xué)觀察結(jié)果…………………21免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果……………………22免疫熒光雙染色染色觀察結(jié)果……………...….25免疫陽(yáng)性細(xì)胞與慢性牙周炎程度相關(guān)性分析結(jié)果……………28討論…………………..31巨噬細(xì)胞參與人慢性牙周炎的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程…………………31雙陽(yáng)性巨噬細(xì)胞在慢性牙周炎牙齦組織中的表達(dá)及意義……32結(jié)論…………………..35參考文獻(xiàn)……………..36附錄一………....……………………..45附錄二（附圖）……………………..48附錄三知情同意書(shū)…....……………..72前言1.牙周病的病因和發(fā)病機(jī)制牙周病（periodontitisdiseases）是發(fā)生于牙齒周?chē)M織的炎癥性疾病，為口腔兩大疾病之一，是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因。依據(jù)累及部位的不同分為累及牙齦組織的牙齦病，以及累及牙周支持組織的牙周病兩種ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[1]。牙周炎被認(rèn)為是多因素疾病，目前認(rèn)為牙周病的始動(dòng)因子為牙菌斑生物膜及其產(chǎn)物，部分牙周致病菌所形成的抗原成分以及在其代謝的過(guò)程中所生成的酶以及毒素均可直接對(duì)牙周組織造成損傷，因此牙菌斑與牙周炎病程的進(jìn)展密切相關(guān)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[2]。牙周致病菌不僅對(duì)組織造成直接損傷，還可以通過(guò)刺激、調(diào)控宿主的免疫防御系統(tǒng)間接損傷牙周組織。牙周致病菌本身無(wú)法誘發(fā)產(chǎn)生牙周炎，已經(jīng)有越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，在疾病的發(fā)展過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)處理感染因子的過(guò)程起到主要的作用。Th1以細(xì)胞免疫為主而Th2細(xì)胞以體液免疫為主，Th1、Th2之間的平衡狀態(tài)被認(rèn)為是維持全身免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)穩(wěn)定的重要因素，它們的異常分泌將引起炎癥過(guò)程的失衡ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[3-8]。在相關(guān)的慢性牙周炎的臨床資料中以及實(shí)驗(yàn)中顯示，在牙周炎的早期穩(wěn)定階段，Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子起到主要的作用，在牙周組織病變程度加重時(shí)，Th2細(xì)胞起到主要作用ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[9-11]。通過(guò)對(duì)牙齦溝液中所含的細(xì)胞因子的濃度加以分析對(duì)比，研究顯示前列腺素2(prostaglandin,PGE2)、IL-1α、干擾素γ（interferon-γ,IFN-γ）以及IL-2的濃度是增加的，IL-4、IL-6的濃度是減少的，可以推斷在牙周組織的病變過(guò)程中，Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)水平比Th2型細(xì)胞高ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[12]。在牙周炎形成、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中，以IFN-γ、TNF-α為代表的Th1型細(xì)胞因子和以IL-4、IL-10為代表的Th2型細(xì)胞因子起到十分重要的作用。根據(jù)醫(yī)學(xué)調(diào)查相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)輕度或重度牙周炎的成年人患者達(dá)80%-97%ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[13]。研究表明，牙周炎不僅僅是引起牙齒脫落的重要因素，并且易影響全身健康而引起呼吸道疾病、心血管疾病以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[14-15]。有學(xué)者研究認(rèn)為慢性牙周炎產(chǎn)生的細(xì)菌酶可能破壞了口腔粘膜表面，改變了呼吸道上皮通透性，從而降低宿主非特異性防御機(jī)制對(duì)潛在呼吸道病原菌的抵抗作用ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[16-17]。根據(jù)相關(guān)醫(yī)學(xué)調(diào)查報(bào)告中的數(shù)據(jù)，口腔的衛(wèi)生情況對(duì)于口腔疾病和呼吸道疾病有著較大的影響，其中口腔衛(wèi)生狀況差的患病幾率要比有著良好口腔衛(wèi)生習(xí)慣的人群的患病幾率高出450%。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致呼吸道疾病的因素可能是因?yàn)檠乐苎椎难装Y介質(zhì)進(jìn)一步感染。此外，當(dāng)前有研究認(rèn)為其他疾病也可能導(dǎo)致牙周炎的發(fā)生，如糖尿病患者病程后期多伴隨牙周炎，因此牙周炎被認(rèn)為是糖尿病的并發(fā)癥之一ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[18]。牙周炎是由多類(lèi)牙周致病菌、大量的炎性介質(zhì)和多種不同的免疫細(xì)胞之間共同作用的結(jié)果，主要特點(diǎn)為牙周結(jié)締組織的破壞、牙槽骨的吸收以及牙周附著水平的喪失。當(dāng)前，在牙周炎的免疫應(yīng)答機(jī)制上盡管已經(jīng)作了大量的實(shí)驗(yàn)研究，但是，在引起牙周炎的感染的細(xì)胞因子以及相關(guān)的免疫機(jī)制仍未明確。2、Mφ分泌的IL-10與牙周炎關(guān)系的研究進(jìn)展2.1IL-10的結(jié)構(gòu)IL-10是一種多功能細(xì)胞因子，可以抑制T淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞、Mφ的活化與效應(yīng)，對(duì)不同類(lèi)型的造血細(xì)胞的作用也存在差異ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[19]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)IL-10最早是由Th2細(xì)胞所誘導(dǎo)生成的，其抑制IL-2、TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。有研究報(bào)道，B細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-10，由此可推斷在對(duì)宿主的免疫應(yīng)答機(jī)制的抑制作用上，IL-10以及其同源物起到關(guān)鍵性作用。人類(lèi)hIL-10基因由相應(yīng)染色體上的5個(gè)外顯子編碼，激活的IL-10基因?qū)е?kbhIL-10mRNAs表達(dá)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[20-25]。IL-10可以由多種細(xì)胞表達(dá)，它的表達(dá)受到不同細(xì)胞類(lèi)型不同機(jī)制的調(diào)控，在T細(xì)胞、單核細(xì)胞及Mφ中，IL-10轉(zhuǎn)錄可以被轉(zhuǎn)錄信號(hào)肽1(signalpetide,SP)和轉(zhuǎn)錄因信號(hào)肽3調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子SP1和SP3由許多不同的細(xì)胞類(lèi)型組成表達(dá)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[26-27]。研究顯示，IL-10抑制Mφ的信號(hào)通路需要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signaltransducerandactivatoroftranscription3，stat3），IL-10受體末端15個(gè)氨基酸片段與Stat3一起在IL-10發(fā)揮作用，抑制Mφ的活化，目前認(rèn)為stat3是所有IL-10應(yīng)答細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)所必須的，但必須激活一種或多種途徑實(shí)現(xiàn)IL-10對(duì)Mφ活化的抑制ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[28-30]。2.2IL-10的生物學(xué)效應(yīng)IL-10對(duì)于單核細(xì)胞、Mφ以及樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcells,DCs）都存在影響。IL-10能有效抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF等細(xì)胞因子的表達(dá)。在抗炎過(guò)程中，IL-10占據(jù)主要的作用，并且能夠抑制TNF和IL-1的產(chǎn)生。在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，以上的細(xì)胞因子起到相互協(xié)同的作用，并且能夠誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)前列腺素（prostaglandin,PGE）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocytechemoattractantprotein1,MCP1）、Mφ炎癥蛋白1α（macrophageinflammatoryproteins1α,Mip-1α）、Mip-1β、Mφ衍生趨化因子（macrophage-deprivedchemokine,MDC），由此可推斷IL-10抑制大多數(shù)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[31-32]。IL-10通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2生成的作用從而抑制單核細(xì)胞及Mφ外基質(zhì)轉(zhuǎn)換的能力，反而使金屬蛋白酶組織抑制劑以及透明質(zhì)酸（hyaluronicacid）的作用增加，進(jìn)而促使血管的生成以及遷移。IL-10上調(diào)FcγR(fc-gammareceptors)的表達(dá)可增強(qiáng)單核細(xì)胞及Mφ吞噬細(xì)菌和真菌的能力ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[33-35]。IL-10還可下調(diào)了Toll樣受體細(xì)胞4（toll-likereceptors,TLR4）的表達(dá)，并增強(qiáng)了CD14、CD16、CD64和CD13的表達(dá)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[36-37]。以上結(jié)果可推斷，IL-10可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，并且限制正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)和炎癥，同時(shí)有助于增強(qiáng)吞噬作用消除感染。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在缺乏IL-10小鼠中發(fā)現(xiàn)自發(fā)性小腸炎、結(jié)腸炎等癥狀，也可說(shuō)明IL-10主要功能是限制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[38-39]。2.3Mφ分泌的IL-10在牙周免疫病理中的作用IL-10的主要由Th2細(xì)胞、活化B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、Mφ生成，另外，還存在一些其他的細(xì)胞也可以誘導(dǎo)分泌IL-10，如CD8+T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞（Keratinocyte）以及肥大細(xì)胞（mastcell）等。IL-10的抑制作用主要是針對(duì)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、Mφ以及肥大細(xì)胞，通過(guò)對(duì)促炎因子的抑制作用進(jìn)而抑制CD4+T細(xì)胞合成、從而抑制TNF-α、IL-1β產(chǎn)生。Mφ首先通過(guò)對(duì)TNF-α、IL-1β的釋放促使免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，再通過(guò)調(diào)節(jié)IL-10的釋放，反饋性抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而達(dá)到免疫反應(yīng)的平衡ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[40-41]。IL-10對(duì)牙周所起到的保護(hù)機(jī)制可能是由于抑制促炎因子及粘附因子、趨化因子的生成，減少了中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞遷移到炎癥組織從而促使牙周修復(fù)。牙周炎中IL-10呈彌散式分布，且分布的十分廣泛，在正常牙齦組織的Mφ中檢出IL-10表達(dá)明顯，在牙周炎組織的Mφ中只能檢出少量的IL-10表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究顯示，在牙周炎中，IL-10mRNA細(xì)胞呈陽(yáng)性的較少，且一般情況下以牙齦的固有層的分布為主，其中有的著色清晰易識(shí)別，有的集中分布在血管的周?chē)?，于上皮層無(wú)法見(jiàn)到較為明顯的陽(yáng)性表達(dá)的信號(hào)。Lappin等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[42]認(rèn)為IL-10細(xì)胞在牙周組織中的表達(dá)增多即為牙周炎靜止期的組織損傷特征，通過(guò)使用刮治及根面平整等對(duì)牙周炎進(jìn)行治療，使得IL-10表達(dá)增加，表明其促使了牙周的修復(fù)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)對(duì)牙齦健康組以及牙周炎組中IL-10mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比研究，可知牙周炎組的IL-10mRNA表達(dá)水平較健康組顯著減少ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[43]。通過(guò)采取多克隆抗體檢測(cè)法對(duì)牙周炎的炎癥組織中的IL-10的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞在牙周炎的早期穩(wěn)定期以及成人牙周炎的炎癥組織中的表達(dá)水平較高ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[42]。因?yàn)闆](méi)有系統(tǒng)性的對(duì)Mφ中的IL-10的表達(dá)情況作出研究，所以，對(duì)于牙周組織中Mφ的IL-10對(duì)牙周致病菌抗原的識(shí)別過(guò)程以及對(duì)牙周病的調(diào)節(jié)免疫機(jī)制的闡述仍不明確。3、Mφ分泌的TNF-α與牙周炎關(guān)系的研究進(jìn)展3.1TNF-α的結(jié)構(gòu)Carswell等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[44]于1975年在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）。在此之后，通過(guò)對(duì)TNF的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其不僅具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，還可以參與免疫調(diào)節(jié)以及多個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程。依據(jù)不同的來(lái)源以及結(jié)構(gòu)組成，TNF分為T(mén)NF-α和TNF-β。其中，TNF-α即惡液素（cachectin），生成部位為活化的單核巨噬細(xì)胞；TNF-β即淋巴毒素（lytnphotoxin），生成部位是淋巴細(xì)胞。在宿主的免疫防御系統(tǒng)中，TNF具有廣泛的致炎作用以及免疫調(diào)節(jié)作用，并且在病理狀態(tài)下如敗血癥、牙周炎等皆出現(xiàn)表達(dá)過(guò)度的情況。TNF基因與主要組織相容性復(fù)合物基因緊密連鎖。TNF-α基因位于HLA-DR（humanleukocyteantigens,HLA）和HLA-B位點(diǎn)之間的HLA-Ⅲ抗原基因簇，即染色體6p21.4區(qū)域ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[44-46]。TNF-α與TNF-β基因的組成均是3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，除了第四個(gè)外顯子之間高度同源之外，其余內(nèi)含子及外顯子都是不同源的ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[47]。TNF基因簇具備多中類(lèi)型的多態(tài)性，如單個(gè)核苷酸的多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）、限制片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）以及微衛(wèi)星的多態(tài)性ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[48-49]。Udalova等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[45]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在TNF中存在五種微衛(wèi)星即TNFa～e，TNFa、b、d是多等位基因，具有高度的多態(tài)性，TNFc是雙等位基因，TNFe是三等位基因，此外有研究表明，上述等位基因和人類(lèi)的MHCⅠ、Ⅱ位點(diǎn)之間存在著連鎖不平衡性。有實(shí)驗(yàn)研究顯示，TNF-α的含量與個(gè)體的牙周炎的患病易感性以及病變的程度相關(guān)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[50-51]。Calbraith等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[52-53]研究認(rèn)為在重度牙周炎的患者中存在的TNF2（G/A）基因型人數(shù)比例較大。TNF通過(guò)與TNF受體（TNFR）進(jìn)行結(jié)合發(fā)揮作用，TNF-α家族中最早被發(fā)現(xiàn)的TNF受體為T(mén)NFR1及TNFR2，TNFR1參與了TNF-α所有的活性功能，包括細(xì)胞凋亡、分化、增殖、抗菌和PGE的合成，TNFR2則介導(dǎo)部分特定細(xì)胞的功能如胸腺T細(xì)胞的增殖以及胰島素的拮抗作用等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[54-56]。3.2TNF-α的生物學(xué)效應(yīng)TNF-α通過(guò)與其受體相結(jié)合，從而啟動(dòng)鞘磷脂酶-神經(jīng)酞胺（Sphingomyelinase-ceramide）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、激活轉(zhuǎn)錄因子NF-Kβ（nuclearfactor-Kβ）的信號(hào)通路、蛋白激酶（proteinkinases）通路等，促進(jìn)單核細(xì)胞及Mφ對(duì)IL-1、IL-6、IL-8、以及TNF-α的分泌，形成細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)。依據(jù)有關(guān)研究可知，TNF還能夠通過(guò)增強(qiáng)激活中性粒細(xì)胞，從而使其表達(dá)的白細(xì)胞分化出抗原復(fù)合物CD11+/CD18+。另外TNF-α還能激活EC使其表達(dá)細(xì)胞間粘附分子1與內(nèi)皮細(xì)胞豁附分子1，使白細(xì)胞與EC之間產(chǎn)生作用，促進(jìn)活性氧以及彈性蛋白酶的大量釋放，并將損傷EC以及器官組織細(xì)胞，刺激EC細(xì)胞釋放凝血因子III（bloodcoagulationfactorIII），進(jìn)而啟動(dòng)凝血機(jī)制ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[57-58]。3.3Mφ分泌的TNF-α在牙周免疫病理中的作用目前，通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究均可顯示TNF-α是由活化Mφ分泌，但在中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercells,NK）、成纖維細(xì)胞（fibroblast）以及肥大細(xì)胞中也可誘導(dǎo)分泌TNF-αADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[59]。在牙周炎中，TNF-α作用于EC，誘導(dǎo)其合成黏附因子，進(jìn)而使白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞向EC黏附以及向組織內(nèi)游出。TNF-α還能介導(dǎo)生成各類(lèi)效應(yīng)T細(xì)胞、抗體以及促進(jìn)B細(xì)胞的分化，通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞的刺激而進(jìn)一步生成PGE以及膠原酶，提升破骨細(xì)胞的活性ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[60]。TNF-α的骨吸收的機(jī)制為使破骨細(xì)胞含量增多，同時(shí)降低骨基質(zhì)的鈣化程度。TNF-α還能夠通過(guò)對(duì)纖維細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，從而重組細(xì)胞骨架，并且介導(dǎo)合成膠原酶（collagenase）而促進(jìn)膠原纖維(collagenfibers)的降解，因此可知，TNF-α是促進(jìn)牙槽骨吸收的一個(gè)重要的細(xì)胞因子ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[61]。有報(bào)道稱(chēng)：如果對(duì)牙周組織中TNF-α及其受體的結(jié)合過(guò)程加以抑制，那么可以降低牙槽骨炎癥部分的骨吸收能力ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[62]。4、本課題的研究目的和意義本次研究通過(guò)收集病變程度不同的牙周炎患者牙齦組織樣本，制作組織學(xué)切片，采用H&E染色法、免疫組織化學(xué)以及免疫熒光雙染色法，對(duì)牙齦組織的炎癥程度、Mφ以及雙陽(yáng)性Mφ的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。通過(guò)對(duì)牙周炎牙齦組織的炎癥程度等級(jí)評(píng)分、計(jì)算Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α雙陽(yáng)性Mφ的表達(dá)密度。分析Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α雙陽(yáng)性Mφ與慢性牙周炎的病變程度的相關(guān)性及其在牙周感染中的作用和作用機(jī)制；闡明Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α雙陽(yáng)性Mφ在宿主免疫反應(yīng)中的功能特征。研究結(jié)果將對(duì)后續(xù)以CD14-IL-10和CD14-TNF-α雙陽(yáng)性Mφ為靶點(diǎn)的研究慢性牙周炎的免疫預(yù)防提供分子基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)器材1．1主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備（表1）1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥品（表2）2.病例選擇、分組及標(biāo)本收集2.1牙周炎病例選擇收集2015年12月-2016年6月就診于中山市人民醫(yī)院的牙周科門(mén)診并自愿加入本研究的80例患者，年齡在20~60歲，其中男47例（46歲±15歲），女33例(39歲±13歲)，患者年齡以及性別均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：一年內(nèi)未進(jìn)行過(guò)牙周手術(shù)的治療；患有糖尿病的患者要被排除；排除處于妊娠期者；患有其他系統(tǒng)性疾病的患者也不能參與研究；短時(shí)間內(nèi)服用過(guò)避孕藥的患者要進(jìn)行排除；同時(shí)，研究對(duì)象需要滿(mǎn)足三個(gè)月內(nèi)沒(méi)有服用過(guò)抗生素類(lèi)的藥品的條件；在進(jìn)行收集中重度慢性牙周炎患者牙齦組織之前，其必須作牙周基礎(chǔ)治療，且在療程結(jié)束后牙周袋底仍存在出血（bleedingonprobing，BOP）現(xiàn)象者。2.2分組及標(biāo)本收集2.2.1分組依據(jù)依據(jù)于1999年的美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)制定的牙周病新分類(lèi)作為標(biāo)準(zhǔn)ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[63]，將本次研究的80例患者平均分為四組，分別通過(guò)牙齦指數(shù)（GI）、牙周附著水平(AL)、牙周探診深度（PD)作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。2.2.2確定分組，收集標(biāo)本1)正常對(duì)照組：收集由于口腔正畸治療需拔除但健康的前磨牙牙齦組織：無(wú)炎癥、附著喪失、牙周袋以及牙槽骨吸收且BOP(-)。2)輕度慢性牙周炎組：收集臨床牙冠延長(zhǎng)術(shù)治療的牙齦組織：輕度炎癥、附著喪失不超過(guò)3mm、牙周袋深度不超過(guò)4mm以及X線片可見(jiàn)牙槽骨吸收程度在根長(zhǎng)為1/3以?xún)?nèi)且BOP(+)。3)中度慢性牙周炎組：收集需進(jìn)行牙周翻瓣術(shù)治療的內(nèi)斜切口牙齦組織：炎癥較為明顯、牙周袋深度在4-6mm、附著喪失水平在3-5mm且X線片可見(jiàn)牙槽骨吸收程度超過(guò)根長(zhǎng)的1/3但在根長(zhǎng)的2/3以?xún)?nèi)、患牙根部存在輕度松動(dòng)以及分叉處輕度病損的可能且BOP（+）。4)重度慢性牙周炎組：收集必須拔除的患牙或預(yù)后不良的患牙的牙齦組織：明顯炎癥、附著喪失水平超過(guò)5mm、牙周袋深度超過(guò)6mm、X線片可見(jiàn)牙槽骨吸收程度超過(guò)根長(zhǎng)的2/3、患牙根分叉區(qū)域存在較嚴(yán)重的病損，其牙齒有多數(shù)松動(dòng)且BOP(+)。3.實(shí)驗(yàn)操作方法3.1配制濃度為10%中性福爾馬林固定液使用電子天平進(jìn)行稱(chēng)重獲得16.4g的NaH2P04.12H20以及5.2g的NaH2P04.2H20，采用100ml40%甲醛溶液溶解配置好的NaH2P04.12H20、NaH2P04.2H20，再倒入純凈蒸餾水900ml，而后通過(guò)精準(zhǔn)度高的pH計(jì)對(duì)溶液的酸堿度進(jìn)行測(cè)定，且依據(jù)測(cè)定的pH值逐滴加入高濃度的NaOH或者HCl溶液，進(jìn)而將溶液逐漸調(diào)至中性。3.2標(biāo)本的處理將所收集的牙齦組織標(biāo)本加以處理，使用生理鹽水對(duì)標(biāo)本進(jìn)行蕩洗2-3次，每次2-3sec，然后再將制備完成的標(biāo)本于10%中性福爾馬林固定液即pH=7.0至少放置48h。3.3制備組織切片玻片的處理：首先將載玻片與蓋玻片在清潔液中放置24h，再使用蒸餾水沖洗3min，共沖洗5次，之后置于95%酒精中進(jìn)行浸泡2h,干燥后放置在干燥箱中以作備用。1)脫水：將使用梯度酒精對(duì)已制備好的標(biāo)本進(jìn)行脫水處理，過(guò)程依次為：流動(dòng)水進(jìn)行漂洗4-5h，再依次置于75%酒精3h、80%酒精2h、90%酒精1h、95%酒精(I)1h、95%酒精(II)1h、無(wú)水乙醇(I)1h以及無(wú)水乙醇(II)1h浸泡處理；2)透明：運(yùn)用二甲苯處理，使切片呈透明狀態(tài)，過(guò)程依次為：二甲苯乙醇(1：1)浸漬15min、二甲苯(I)浸漬20min、二甲苯(II)浸漬20min；3)浸蠟以及包埋，過(guò)程為：將組織置入熔點(diǎn)65℃的石蠟浸漬1h，然后再采用熔點(diǎn)62℃的石蠟進(jìn)行包埋。3.4組織學(xué)染色及觀察1)將石蠟切片加以常規(guī)脫蠟：先將切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸漬15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精對(duì)切片作復(fù)水，過(guò)程依次為：分別浸漬在無(wú)水乙醇(I)15min、無(wú)水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸餾水進(jìn)行沖洗3min后將水分甩干；3)蘇木素染色：先將切片放在蘇木素液中浸漬10-15min，取出后再使用流動(dòng)水對(duì)其進(jìn)行漂洗3min，再使用1%鹽酸酒精快速分化1～2sec，然后使用蒸餾水進(jìn)行對(duì)切片繼續(xù)漂洗1min，再把甩干水分，并且放在中和堿溶液中浸漬1min，最后使用流動(dòng)水漂洗3min后將水分甩干；4)酒精脫水，過(guò)程依次為：分別置于80%酒精3～5min、95%酒精（Ⅰ）3～5min、95%酒精（Ⅱ）3～5min進(jìn)行脫水處理；5)伊紅染色：先將切片放在1%酒精伊紅液浸漬10min，然后依次繼續(xù)使用無(wú)水乙醇（Ⅰ）5sec、無(wú)水乙醇（Ⅱ）5sec、無(wú)水乙醇（Ⅲ）5sec加以洗滌，將水分甩干；6)透明、封片：先使用二甲苯（Ⅰ）以及二甲苯（Ⅱ）對(duì)切片進(jìn)行作透明處理各3min，再使用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片；3.5免疫組織化學(xué)染色及觀察1)將石蠟切片加以常規(guī)脫蠟：先將切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸漬15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精對(duì)切片作復(fù)水，過(guò)程依次為：分別浸漬在無(wú)水乙醇(I)15min、無(wú)水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸餾水進(jìn)行沖洗3min后將水分甩干；3)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；4)微波輻射抗原修復(fù)：在檸檬酸鹽緩沖液中將切片完全浸沒(méi)，使用微波爐高火加熱至100℃，改用中火繼續(xù)加熱切片20min，然后放在室溫下冷卻至常溫；5)再次使用PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；6)內(nèi)源性過(guò)氧化物：在全部的組織切片上滴加3%H2O2去離子水（SP免疫組化檢測(cè)試劑盒），在室溫下對(duì)切片進(jìn)行孵育10min；7)PBS緩沖液洗滌3次，每次3min；8)封閉：將組織切片上的PBS磷酸鹽緩沖液傾除，在全部的切片組織上滴加正常山羊血清工作液(SP免疫組化檢測(cè)試劑盒A液)，然后再將切片放在濕盒中，并在室溫下將其孵育15min，然后再倒出工作液，且使用干凈的濾紙將多余封閉液吸干，不用清洗；9)一抗孵育：稀釋比例按照1：100的Mouse-Anti-CD14+（SantaCruz,USA）、RabbitAnti-TNF-α+(Abcam,UK)、Rabbit-Anti-IL-10+（Abcam,UK）滴加于組織切片上，于濕盒中進(jìn)行孵育，置入4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜（12～18h）；10）復(fù)溫：將濕盒復(fù)溫30min到室溫后，PBS磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10min；11)二抗孵育：在全部的切片標(biāo)本上滴加生物素化二抗工作液IgG(SP免疫組化檢測(cè)試劑盒B液)，然后將切片放在濕盒中，于室溫下降切片孵育15min；12)PBS緩沖液洗滌3次，每次3min；13)鏈霉卵白素：在全部的切片組織上均滴加工作液(SP免疫組化檢測(cè)試劑盒C液)，然后將切片放在溫盒中，于室溫下降切片孵育15min；14)PBS緩沖液洗滌3次，每次3min；15)顯色劑進(jìn)行顯色：選取DAB顯色試劑盒，從中取得1ml試劑2(DAB底物液)，再倒入50μL試劑1(DAB濃縮液)，混合均勻后配置成DAB工作液，在切片上滴加DAB工作液，放置在顯微鏡下，且處于室溫下，進(jìn)行觀察切片，如若發(fā)現(xiàn)顯色，則控制切片的顯色時(shí)間，在顯色反應(yīng)5min后，繼續(xù)使用蒸餾水對(duì)切片進(jìn)行沖洗以終止顯色反應(yīng)；16)流動(dòng)水進(jìn)行漂洗20min；17)Mayor's蘇木素再一次輕度染色10min；18)流動(dòng)水再次進(jìn)行漂洗20min；19)蒸餾水進(jìn)行洗滌3min；20)采用梯度酒精對(duì)切片作復(fù)水，過(guò)程依次為：分別浸漬在無(wú)水乙醇(I)15min、無(wú)水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸餾水進(jìn)行沖洗3min后將水分甩干；21)透明以及封片：首先選擇二甲苯（Ⅰ）以及二甲苯（Ⅱ）對(duì)切片進(jìn)行作透明處理各3min，在使用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片；22)放置在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)各組牙齦標(biāo)本IHC染色情況進(jìn)行觀察。3.6免疫熒光雙染色及觀察1)將石蠟切片加以常規(guī)脫蠟：先將切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸漬15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精對(duì)切片作復(fù)水，過(guò)程依次為：分別浸漬在無(wú)水乙醇(I)15min、無(wú)水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸餾水進(jìn)行沖洗3min后將水分甩干；3)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；4)微波輻射抗原修復(fù)：在檸檬酸鹽緩沖液中將切片完全浸沒(méi)，使用微波爐高火加熱至100℃，改用中火繼續(xù)加熱切片20min，然后放在室溫下冷卻至常溫；5)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；6)內(nèi)源性過(guò)氧化物：在全部的組織切片上滴加3%H2O2去離子水（SP免疫組化檢測(cè)試劑盒），在室溫下對(duì)切片進(jìn)行孵育10min；7)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；8)封閉：將組織切片上的PBS磷酸鹽緩沖液傾除，在全部的切片組織上滴加正常山羊血清工作液，然后再將切片放在濕盒中，并在室溫下將其孵育15min，然后再倒出工作液，且使用干凈的濾紙將多余封閉液吸干，不用清洗；9)一抗孵育：將所有的組織切片均分為三組即①按照1：100稀釋的Mouse-Anti-CD14+、1：100稀釋的Rabbit-Anti-TNF-α+；②按照1：200稀釋的Mouse-Anti-CD14+、1：100稀釋的Rabbit-Anti-IL10+；③陰性對(duì)照組：PBS磷酸鹽緩沖液，并且分別滴入適量的稀釋濃度的一抗溶液；在置于濕盒中，放置在4℃的冰箱內(nèi)過(guò)夜即12h-18h；10)復(fù)溫：將濕盒復(fù)溫30min到室溫，再用PBS磷酸鹽緩沖液蕩洗3次，每次10min；11)二抗孵育：將1：200稀釋的抗HRP標(biāo)記山羊抗兔鼠二抗液滴加于每張組織切片上，然后將切片放在濕盒中，于室溫下降切片孵育15min；12)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；13)核染：以PBS為稀釋液，在全部的組織切片上滴加按照1：500比例稀釋的DAPI溶液，進(jìn)行避光處理，并在于室溫下對(duì)切片進(jìn)行孵育15min；14)PBS緩沖液對(duì)切片進(jìn)行洗滌3次，每次3min；15)封片：使用抗熒光淬滅的封片劑對(duì)切片以封片處理。16)免疫熒光雙染的切片進(jìn)行封片后進(jìn)行避光處理，并且放在4℃冰箱中，一周內(nèi)分別將切片放在熒光顯微鏡以及共聚焦顯微鏡下對(duì)標(biāo)本中的陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，選取己知CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+細(xì)胞熒光組織切片作為陽(yáng)性對(duì)，PBS為一抗的陰性對(duì)照；3.7牙齦組織組織學(xué)染色結(jié)果的處理選取H&E染色法進(jìn)行染色，在顯微鏡下對(duì)各組切片組織的變化進(jìn)行觀察。選擇2名病理醫(yī)師以盲法進(jìn)行觀察標(biāo)本，按照炎癥的等級(jí)方法，并且依據(jù)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度計(jì)分并取均值。炎癥的程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：1）無(wú)明顯炎癥；2）輕度炎癥：炎癥細(xì)胞呈局灶狀浸潤(rùn)；3）中度炎癥：炎癥細(xì)胞呈片狀或灶狀浸潤(rùn)；4）重度炎癥：炎癥細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)。3.8牙齦組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的處理選取IHC染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察到牙齦組織切片中CD14、IL-10、TNF-α陽(yáng)性信號(hào)為棕褐色或黑褐色。光學(xué)顯微鏡(x400)下，選擇2名病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行盲法觀察，選取CD14、IL-10、TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目最多的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別記錄細(xì)胞總數(shù)、CD14、IL-10、TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)算CD14、IL-10、TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率（%），取平均值。3.9牙齦組織免疫熒光雙染色結(jié)果的處理一抗分別選取鼠來(lái)源的抗-Mφ-CD14和兔來(lái)源的抗-TNF-α以及抗-IL-10，二抗分別選用抗-鼠和抗-兔進(jìn)行種屬間相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)標(biāo)記。MφCD14+免疫熒光信號(hào)表達(dá)是綠色熒光，TNF-α+以及IL-10+的免疫熒光信號(hào)表達(dá)是紅色熒光。采用DAPI染核，使細(xì)胞核在熒光顯微鏡下表達(dá)是藍(lán)色熒光。在同一個(gè)視野范圍內(nèi)，綠光、紅光以及藍(lán)光三個(gè)顏色重合在一塊后即呈現(xiàn)為橘黃色熒光。選擇2位病理醫(yī)師于熒光顯微鏡下盲法觀察組織切片，對(duì)CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過(guò)測(cè)量組織切片的面積，獲得CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+細(xì)胞密度，并取平均值。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)的表達(dá)方式即均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)加以處理和分析：1)各組牙齦組織的炎癥程度評(píng)分將采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，因其為原始數(shù)據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行對(duì)比，若結(jié)果顯示4組的炎癥程度存在差異性，那么將采用多樣本兩兩進(jìn)行對(duì)比的Nemenyi法進(jìn)行檢驗(yàn)。2)各組之間平均陽(yáng)性細(xì)胞率、CD14+-TNF-α+以及CD14+-IL-10+細(xì)胞平均密度，均使用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-wayANOVA)以及Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊性時(shí)，多個(gè)樣本均數(shù)間每?jī)蓚€(gè)均數(shù)的對(duì)比則將使用Bonferroni法，方差不齊時(shí)則使用Tamahane＇sT2法。3)各組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的Mφ平均陽(yáng)性細(xì)胞率與慢性牙周炎病變程度之間，CD14+-TNF-α+細(xì)胞、CD14+-IL-10+細(xì)胞平均密度和慢性牙周炎病變程度之間，將分別采取Pearson相關(guān)分析。4)檢驗(yàn)水準(zhǔn)是雙側(cè)a=0.05，P＜0.05時(shí)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異性，則存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)果1.組織學(xué)觀察結(jié)果1）正常對(duì)照組：膠原纖維多見(jiàn)（附圖1A）；2）輕度慢性牙周炎：上皮下纖維結(jié)締組織呈束狀增生，只有較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（附圖1B）；3）中度慢性牙周炎：上皮下纖維結(jié)締組織水解破壞，束間見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（附圖1C）；4）重度慢性牙周炎：上皮下纖維組織出現(xiàn)溶解以及變形，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞（附圖1D）。各組慢性牙周炎牙齦組織的炎癥程度見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示：1）與正常對(duì)照組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的牙齦組織中炎癥細(xì)胞均顯著增加(P＜0.01)；2）隨著牙周炎病變程度的加重，牙齦組織中炎癥細(xì)胞顯著增加(P＜0.01)。Fig.1Gingivalinflammationscoreineachgroup.Dataarerepresentedasmean±SD.Kruskal-WallisHandNemenyitestanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtomildchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtomildandmoderateperiodontitis.2．免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果2.1牙齦組織CD14免疫組織化學(xué)結(jié)果1）正常組：可見(jiàn)散在分布數(shù)量較少的CD14表達(dá)（附圖2A）；2）輕度牙周炎組：可見(jiàn)少量CD14陽(yáng)性細(xì)胞（附圖2B）；3）中度牙周炎組：CD14陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加（附圖2C）；4）重度牙周炎組：CD14廣泛表達(dá)（附圖2D）；陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性，基本未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（附圖3）。各組慢性牙周炎組織的CD14平均陽(yáng)性細(xì)胞率見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示：1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的CD14平均陽(yáng)性細(xì)胞率均顯著上升(P＜0.01)；2）CD14平均陽(yáng)性細(xì)胞率隨著牙周炎的嚴(yán)重程度增加顯著上升(P＜0.01)。Fig.2TheaverageratioofCD14+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtomildchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtomildandmoderateperiodontitis.2.2牙齦組織IL-10免疫組織化學(xué)結(jié)果1）正常組牙齦組織可見(jiàn)大量分布的IL-10表達(dá)(附圖4A)；2）輕度牙周炎組牙齦組織中IL-10陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所減少(附圖4B)；3）中度牙周炎組織中IL-10陽(yáng)性細(xì)胞顯著降低(附圖4C)；4）重度牙周炎組牙齦組織僅見(jiàn)少量的IL-10陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(附圖4D)。各組慢性牙周炎組織的IL-10平均陽(yáng)性細(xì)胞率見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示：1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的IL-10平均陽(yáng)性細(xì)胞率表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.01)；2）隨著慢性牙周炎的病變程度加重，IL-10平均陽(yáng)性細(xì)胞率水平隨之顯著下降(P＜0.01)。Fig.3TheaverageratioofIL-10+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.2.3牙齦組織TNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果1）正常組：可見(jiàn)散在分布數(shù)量較少的TNF-α表達(dá)（附圖5A）；2）輕度牙周炎組：TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目少量增加（附圖5B）；3）中度牙周炎組：TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加（附圖5C）；4）重度牙周炎組：TNF-α廣泛的表達(dá)（附圖5D）。各組慢性牙周炎組織的TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示：1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率表達(dá)水平均顯著上升(P＜0.01)；2）隨著慢性牙周炎的病變程度加重，TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率水平隨之顯著上升(P＜0.01)。Fig.4TheaverageratioofTNF-α+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.3.免疫熒光雙染色觀察結(jié)果3.1Mφ-IL-10免疫熒光雙染色結(jié)果CD14+免疫熒光信號(hào)表達(dá)是綠色熒光，IL-10+免疫熒光信號(hào)表達(dá)為紅色熒光，在細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜例均觀察到綠色以及紅色的熒光的定位，細(xì)胞核熒光信號(hào)表達(dá)為藍(lán)色熒光，同一視野中的紅光與綠光重疊后為橙黃色熒光。免疫熒光雙染色結(jié)果顯示：1）正常對(duì)照組：牙齦組織觀察到廣泛分布的CD14+-IL-10+細(xì)胞，特異性橙黃色熒光為強(qiáng)陽(yáng)性，觀察到CD14+-IL-10+主要在牙齦結(jié)締組織區(qū)表達(dá)（附圖6，附圖15）；2）輕度慢性牙周炎組：相較于正常對(duì)照組，觀察到牙齦組織中CD14+-IL-10+細(xì)胞數(shù)量稍下降，特異性橙黃色熒光染色強(qiáng)度是中等陽(yáng)性（附圖7）；3）中度慢性牙周炎組：可見(jiàn)稀少的CD14+-IL-10+細(xì)胞，特異性橙黃色熒光著色強(qiáng)度是弱陽(yáng)性（附圖8）；4）重度慢性牙周炎組：CD14+-IL-10+細(xì)胞幾乎不可見(jiàn)，特異性橙黃色熒光著色強(qiáng)度微弱（附圖9）。陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性，基本未見(jiàn)熒光表達(dá)（附圖10）。各組慢性牙周炎牙齦組織的CD14+-IL-10+細(xì)胞的密度見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示：1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+細(xì)胞的密度顯著下降(P＜0.01)；2）隨著慢性牙周炎的病變程度加重，CD14+-IL-10+細(xì)胞的密度隨之顯著下降(P＜0.01)。Fig.5ThedensityofCD14+-IL-10+cellsineachgingivaltissuewasanalyzed.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane'sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.3.2Mφ-TNF-α免疫熒光雙染色結(jié)果CD14+免疫熒光信號(hào)表達(dá)是綠色熒光，TNF-α+表達(dá)為紅色熒光，在細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜例均觀察到綠色以及紅色的熒光的定位，細(xì)胞核熒光信號(hào)表達(dá)為藍(lán)色熒光，同一視野中的紅光與綠光重疊后為橙黃色熒光。免疫熒光雙染色結(jié)果顯示：1）正常對(duì)照組：牙齦組織中可見(jiàn)少量不均勻分布的CD14+-TNF-α+細(xì)胞，特異性橙黃色熒光著色幾乎不可見(jiàn)(附圖11)；2）輕度慢性牙周炎組：相較于正常對(duì)照組，牙齦組織中CD14+-TNF-α+細(xì)胞數(shù)量稍上升，特異性橙黃色熒光染色的強(qiáng)度呈現(xiàn)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性(附圖12)；3）中度慢性牙周炎組：可見(jiàn)CD14+-TNF-α+細(xì)胞數(shù)量顯著上升，特異性橙黃色熒光染色的強(qiáng)度呈現(xiàn)陽(yáng)性(附圖13)；4）重度慢性牙周炎組：可見(jiàn)廣泛分布的CD14+-TNF-α+細(xì)胞，特異性橙黃色熒光著色強(qiáng)度呈強(qiáng)陽(yáng)性，并且Mφ存在顯著的脫顆?，F(xiàn)象(附圖14，附圖16)。各組慢性牙周炎牙齦組織的CD14+-TNF-α+細(xì)胞的密度見(jiàn)圖6，結(jié)果顯示：1）與正常組對(duì)比，三組慢性牙周炎患者牙齦組織CD14+-TNF-α+細(xì)胞的密度顯著升高(P＜0.01)；2）隨著慢性牙周炎的病變程度加重，CD14+-TNF-α+細(xì)胞的密度隨之顯著升高(P＜0.01)。Fig.6ThedensityofCD14+-TNF-α+cellsineachgingivaltissuewasanalyzed.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane'sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.4.免疫陽(yáng)性細(xì)胞與慢性牙周炎病變程度相關(guān)性分析結(jié)果在進(jìn)行Pearson相關(guān)分析后，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，各個(gè)慢性牙周炎組CD14、TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率顯著上升，慢性牙周炎組IL-10平均陽(yáng)性細(xì)胞率顯著下降，依據(jù)圖7的統(tǒng)計(jì)圖分析結(jié)果可知CD14的相關(guān)系數(shù)：r=0.972，P=0.000；TNF-α的相關(guān)系數(shù)：r=0.968，P=0.000；IL-10的相關(guān)系數(shù)：r=-0.964，P=0.001結(jié)果顯示CD14、TNF-α平均陽(yáng)性細(xì)胞率與慢性牙周炎的病變程度存在正相關(guān)關(guān)系，IL-10平均陽(yáng)性