單克隆抗體的制備和應用

單克隆抗體的

制備和應用基礎部免疫教研室金伯泉20世紀有關(guān)抗體的生理學和醫(yī)學諾貝爾獎項獲獎年代學者獲獎成就1901E.A.Behring發(fā)現(xiàn)抗毒素，開創(chuàng)免疫血清療法1908P.Ehrlich抗體生成的側(cè)鏈學說E.Metchnikoff細胞吞噬作用1913C.Richet發(fā)現(xiàn)過敏現(xiàn)象1960F.M.Burnet抗體生成的克隆選擇學說P.B.Medawar1972G.M.Edelman抗體的化學結(jié)構(gòu)R.M.Porter1977R.S.Yalow創(chuàng)立放射免疫測定法1984G.K?hlerB細胞雜交瘤和單克隆抗體C.MilsteinN.Jerne免疫網(wǎng)絡學說1987Tonegawa抗體多樣性的遺傳學基礎NielsK.JerneGeorgesJ.F.K?hlerCésarMilsteinB淋巴細胞雜交瘤技術(shù)是如何創(chuàng)立的應用SRBC為免疫原免疫小鼠為模型,觀察抗體產(chǎn)生細胞的體細胞突變(Somaticmutation)Hybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495導致了在生命科學領域中的一場革命克?。–lone）又名無性繁殖系，指由一個祖

先細胞經(jīng)分化、增殖所產(chǎn)生的遺傳性狀完全相

同的細胞群

多克隆抗體（Polyclonalantibody,pAb）

用包含多種抗原決定基的抗原物質(zhì)免疫動

物，從而刺激多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗

原表位的不同抗體的總和，稱為多克隆抗體單克隆抗體（MonoclonalAntibody,mAb）

由一個雜交瘤細胞克隆所產(chǎn)生的，針對單一抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體單克隆抗體的優(yōu)點單特異性和均一性無限供應用混合的抗原制備出識別一個抗原決定簇的抗體McAbPcAb雜交細胞（hybridcell）

在外界某些條件干預下（如PEG、電穿孔），當兩個細胞緊密地接觸的時候,其細胞膜可能發(fā)生融合，產(chǎn)生具有原來兩個細胞染色體/基因的單個細胞，稱為雜交細胞

雜交瘤細胞（Hybridomas）

若用一種腫瘤細胞與另一種體細胞（如淋巴細胞）融合，所形成的雜交細胞稱為雜交瘤細胞，簡稱雜交瘤。其既具有腫瘤細胞無限增殖的能力，也具有淋巴細胞的一些特性

B淋巴細胞雜交瘤

骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的基本原理B細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞抗原制備免疫動物骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備細胞融合雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞的篩選及克隆化單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的制備單克隆抗體制備的主要步驟一、抗原細胞、細菌和病毒等，一般具有較強的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射1~2×107個細胞。顆粒性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細胞內(nèi)表達。可溶性抗原需與弗氏完全或不完全佐劑混勻，進行免疫。可溶性抗原：B淋巴細胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特異性抗體的B淋巴細胞，有利于細胞融合形成分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。多次免疫可通過抗體親和力成熟機制，使B細胞分泌高親和力抗體，由此形成的雜交瘤往往可分泌高親和力抗體，有更高的應用價值。

二、免疫動物免疫目的：采用與骨髓瘤供體同一品系的動物

免疫動物品系（脾細胞供體）和骨髓瘤細胞

在種系發(fā)生上距離越遠則產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，獲得的雜交瘤不能在該品系小鼠體內(nèi)誘生腹水。動物的選擇：動物對抗原刺激易產(chǎn)生免疫應答反應8~12周齡雌性小鼠（最常用BALB/c）第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后檢測血清效價加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠腹腔注射細胞融合3天后免疫程序：

脾（spleen）抗原脾（spleen）所選擇的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物

品系相同三、骨髓瘤細胞及飼養(yǎng)細胞的制備骨髓瘤細胞系的選擇要點：自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈對氨基碟呤敏感與免疫脾細胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌Ig雜交瘤細胞飼養(yǎng)細胞的作用：

小鼠腹腔巨噬細胞小鼠脾細胞飼養(yǎng)細胞（feedercell）：增加細胞密度，滿足新生的雜交瘤細胞對細胞密度的要求吞噬清除死亡的細胞分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長飼養(yǎng)細胞的種類和制備方法：四、細胞融合融合前的準備工作準備HAT、HT培養(yǎng)液、融合劑PEG準備飼養(yǎng)細胞準備骨髓瘤細胞準備免疫脾細胞拉頸處死小鼠無菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細胞離心洗滌細胞計數(shù)脾細胞的準備收集細胞離心洗滌活細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度骨髓瘤細胞的準備細胞融合

骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例混合1:10或1:5加入促融劑PEGPEG在聚乙二醇作用下B淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞五、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細胞的DNA生物合成有主要途徑和補償途徑。當有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，需通過補償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。用于雜交瘤融合的骨髓細胞缺乏HGPRT和TK，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT和TK，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的B淋巴細胞雖具有HGPRT和TK，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有骨髓瘤細胞與免疫B細胞融合的雜交瘤既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又從免疫B細胞得到HGPRT和TK的基因產(chǎn)物，因此，能夠克服氨基碟呤的阻斷作用，通過次黃嘌呤的補償途徑合成DNA，而在HAT選擇培養(yǎng)液中生長繁殖。融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養(yǎng)上清，檢測特異性抗體。細胞生長情況

六、雜交瘤細胞的篩選及克隆化雜交瘤分泌單克隆抗體的檢測方法免疫酶技術(shù)——間接ELISA

包被抗原、培養(yǎng)上清、酶標抗體、加底物顯色

陰性對照：骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清

陽性對照：免疫鼠血清

免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光（或酶）測定法：靶細胞鋪片、固定細胞、加待測樣品、加熒光標記抗體（或加酶標抗體和顯色底物）、鏡檢活細胞免疫熒光技術(shù)：流式細胞術(shù)分析雜交瘤細胞的克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化?？寺』窗雅囵B(yǎng)孔中的細胞從單個細胞進行培養(yǎng)繁殖，使之成為單克隆，其分泌的抗體達到均一性。有限稀釋法軟瓊脂培養(yǎng)法以適當濃度雜交瘤細胞加入軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成由一個細胞增殖而成的細胞集落。雜交瘤細胞的克隆化篩選：免疫球蛋白類別及亞類的鑒定

七、單克隆抗體的鑒定小鼠免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞，其分泌的特異性McAb的本質(zhì)仍是小鼠的不同類型及其亞類的免疫球蛋白（Ig），其中以IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3等亞類）最常見，其次為IgM?？贵w親和力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的強度，其高低主要是由抗體分子結(jié)合表位部位和抗原決定簇之間的互補程度決定。特異性是否與其他抗原有交叉反應敏感性對腹水和培養(yǎng)上清進行效價測定親和力測定八、單克隆抗體的制備

動物體內(nèi)誘生法

取Balb/c小鼠,首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1~2周后,腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體約1~2周,可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶（或灌）中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體。收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體，不含無關(guān)Ig，但成本髙。體外培養(yǎng)法我國單克隆抗體的發(fā)展歷史和前景早期研究階段全軍單克隆抗體研究協(xié)作組（單克隆抗體通迅）應用和市場化HLDA

HCDM功能基因組研究中的重要地位國家重大科技項目（973、863等）主要研究內(nèi)容之一單克隆抗體的應用基礎理論研究（生命科學）發(fā)病機理的研究疾病的預防（緊急預防）疾病的診斷（傳染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、過敏性疾病、免疫缺陷?。┘膊〉闹委煟ㄖ委熜钥贵w）

——一項重要的生物技術(shù)和一類生物高科技產(chǎn)品單克隆抗體在生命科學和醫(yī)學中的廣泛應用從醫(yī)學到生命科學的各個領域從基礎研究到臨床應用從診斷到預防和治療MHC細胞表面分子血型腫瘤相關(guān)抗原和分子抗Ig的同種異型激素、細胞因子和血漿成分純化干擾素病原生物

傳染性疾病

HIV:急性感染期和晚期:核心抗原p24升高;檢測抗HIV抗體初篩;免疫印跡進一步確認;CD4+T細胞<200/l病情嚴重

HAV、HBV、HCV:抗體

HFRS:免疫熒光，ELISA（特異性IgM）

腫瘤

多種腫瘤的標志物

直腸結(jié)腸癌:CEA

前列腺癌:PSA原發(fā)性肝癌:AFP淋巴瘤和白血病:CD分子

自身免疫性和過敏性疾病自身抗體（抗核抗體、類風濕因子）放射免疫測定法（RIA）檢測特異性IgE

甲狀腺素、胰島素、生長激素

其他

血型檢測：凝集反應（直接和間接）早孕:人絨毛膜促性腺激素（hCG）男性不育:抗精子抗體單克隆抗體在臨床診斷中應用FabmurineantibodychimericmouseantibodyFvdAbengineeredbispecific

AbScFvHumanizedF(ab)2HumanizedantibodyScFv-toxinintrabodyNumberoftherapeuticmAbsenteringclinicalstudyperyearTherapeuticcategoriesformAbsinclinicalstudy通用名批準時間類型識別抗原適應癥Muromonab-CD31986mouseCD3急性腎移植移植排斥Daclizumab;Basiliximab1997;1998humanized/chimericIL-2R(CD25)急性腎移植移植排斥Rituximab;Tositumomab;Ibritumomab1997;2002;2003mouse/chimericCD20B細胞-非何杰金氏淋巴瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎Alemtuzumab2001humanizedCD52慢性B淋巴細胞性白血病Gemtuzumabozogamicin2000chimericCD33急性粒細胞性白血病Edrecolomab*1995mouseEP-CAM結(jié)、直腸癌Trastuzumab1998humanizedHER-2HER-2過表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌Cetuximab2004humanizedEGFR轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、頭頸部癌癥Bevacizumab2004;2006humanizedVEGF轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌,年齡相關(guān)性黃斑病變Infliximab1998;2002chimeric/humanTNF-α節(jié)段性回腸炎、類風濕關(guān)節(jié)炎,銀屑病性關(guān)節(jié)炎;強直性脊柱炎Efalizumab2003humanizedCD11a銀屑病Natalizumab2004humanα4整合素多發(fā)性硬化癥Omalizumab2003humanizedIgE過敏性哮喘Abciximab

1994chimeric

GPⅡb/Ⅲa冠心病血小板Palivizumab

1998humanizedRSV呼吸道合胞病毒感染CharacteriztionofmAbsagainstEpCAMbyIHC

andIF腫瘤

器官移植排斥自身免疫性疾病其他CD20,CD52,CD33,HER-2EGFR,VEGF,EP-CAMCD3,IL-2R（CD25）TNF-α,CD11a,α4整合素,CD20

GPⅡb/Ⅲa,IgE,RSVgpFMechanismsofmAb-mediatedkilling

CD20

表達于B淋巴細胞，其抗體可促進細胞對化療的敏感性，誘導細胞凋亡、ADCC、CDC

CD33

表達于90%以上的急性髓樣白血病(AML)細胞，但不表達于骨髓CD34+造血干細胞，其抗體可誘導雙鏈DNA斷裂和細胞死亡

CD52

可誘導ADCC和CDC，治療慢性B淋巴細胞白血病、T細胞白血病和T細胞淋巴瘤白血病及淋巴瘤

抗HER2/CD340ADCC，抑制腫瘤細胞增殖和血管形成

抗EGFR

阻斷EGFR與EGF結(jié)合，誘導ADCC，抑制細胞增殖，抑制腫瘤血管形成，誘導凋亡

抗VEGF阻斷VEGF與VEGF受體結(jié)合，抑制腫瘤的血管生長和轉(zhuǎn)移部位的發(fā)展實質(zhì)性腫瘤

抗CD3

補體依賴的細胞毒作用（CDC），清除T細胞，阻斷T細胞功能

抗CD25補體依賴的細胞毒作用（CDC），阻斷IL-2受體預防腎移植急性排斥反應

抗TNF

阻斷TNF-與受體結(jié)合,降低或消除由TNF-刺激細胞所發(fā)生的炎癥反應

抗CD11a抑制LFA-1與配體結(jié)合,抑制白細胞黏附,治療斑狀牛皮癬

抗4整合素

抑制VLA-4與配體結(jié)合,抑制白細胞黏附

CD20治療RA自身免疫性疾病

抗IgE

阻斷IgE與IgE受體結(jié)合,抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒和釋放介質(zhì)，治療持續(xù)性哮喘

抗gpⅡb/Ⅲa

抑制血小板凝血，止血，預防冠狀動脈血管形成術(shù)中血栓

抗RSVgpF

中和病毒，抑制病毒融合和復制，預防兒童在高危期RSV感染其他疾病抗IgE

mAb

治療過敏性疾病的信號傳導途徑通用名類型識別抗原治療疾病CatumaxomabRomovab

雙特異性anti-CD3/Epcam結(jié)腸癌ZanolimumabHumax-CD4人抗體,IgGCD4皮膚性T細胞淋巴瘤EpratuzumabLymphocide人源,IgG1CD22非何杰金淋巴瘤和某些自身免疫性疾病(如SLE),與CD20mAb聯(lián)用可能會提高臨床效果MDX-010ipilimumab人抗體,IgGCTLA-4黑素瘤WX-G250Rencarex嵌合,IgG1抗碳酸酐酶Ⅸ晚期腎癌AMG-162denosumab人抗體,IgG2RANKL絕期后骨質(zhì)疏松癥和防止治療腫瘤過程中激素部分切除治療引起的骨丟失Anti-MRSAmAbAurograb人抗體,scFv抗甲氧芐青鏈素的金黃色葡萄球菌(MRSA)金黃色葡萄球菌感染PexelizumabAlexion;Eculizumab人源,單鏈可變區(qū),scFv補體C5治療心血管術(shù)后合并癥,膜性腎炎,急性心肌梗塞,RAMepolizumab人源,IgG1IL-5特應性皮炎,嗜酸細胞過多綜合征FDA批準進入Ⅲ期臨床驗證的治療性抗體（9種新的靶分子）靶分子抗體種類治療疾病商品名公司批準時間CD分子

IL-6R人源化抗體（IgG1）阻斷IL-6與IL-6R結(jié)合，治療RA,Castelman病RoActemra/TocilizumabChugai/Roche2009(US2009(EU)日本CD80/CD86CTLA4-Fc阻斷T細胞活化，治療RAOrencia/abataceptBMS2005(US)200