葉綠體色素的提取

CHZICHZICHIIC——ch3<CH2>3葉綠體色素的提取、分離、定量及理化性質(zhì)的鑒定【實驗目的】掌握提取和分離葉綠體色素的方法；掌握測定葉綠體色素含量的方法；熟悉葉綠體色素的理化性質(zhì)及吸光特性；了解植物葉綠體色素組成及其與生境的相關性?！緦嶒炘怼咳~綠體色素是植物進行光合作用的重要物質(zhì)，葉綠體色素包含綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類，這兩類色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色層分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當用適當?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，便將混合色素分離。葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開HC——CH3<CH2)3HC——CH3I(CH2)3CHCH^CHa葉綠素的結構葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光。

第二單線態(tài)第一單線態(tài)4.葉綠素中的綠素?；鶓B(tài)分子內(nèi)能量傳遞第二單線態(tài)第一單線態(tài)4.葉綠素中的綠素?；鶓B(tài)分子內(nèi)能量傳遞轉(zhuǎn)向反應中心三第一三線態(tài)的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。葉綠體色素具有吸光特性，可利用分光光度計在某一特定波長下測定色素溶液光密度，即可用公式計算出其中各色素的含量。各種色素含量計算如下：Chla（pg/ml）=12.7OD663—2.69OD645Chlb（pg/ml）=22.9OD645—4.68OD663ChlT（pg/ml）=Chla+Chlb0.1ml提取液Chla含量（pg）=Chla（pg/ml）*0.1ml*稀釋倍數(shù)0.1ml提取液Chlb含量（pg）=Chlb（pg/ml）*0.1ml*稀釋倍數(shù)0.1ml提取液ChlT含量（pg）=ChlT（pg/ml）*0.1ml*稀釋倍數(shù)（菠菜：稀釋倍數(shù)=0.1ml/3ml=30，玉米：稀釋倍數(shù)=0.3ml/3ml=10）每種葉綠素含量計算（以Chla為例）:FWChla含量(瞄/g)=1ml提取液Chla含量(瞄)xV總FW其中FW為樣品總重(2.0g菠菜葉片，0.2g玉米葉片)，V總=10ml葉綠體色素易受光氧化，提取色素應在弱光中進行，并避光保存色素。光照下葉綠體色素會被破壞?！緦嶒灢牧稀坎牧希翰げ巳~片，玉米葉片試劑：9丙酮(100%及80%)；石英砂；碳酸鈣粉；四氯化碳；醋酸銅；HCl(6N)乙醚，KOH-甲醇器材：研缽，培養(yǎng)皿，量筒，試管，滴管，定性濾紙，分光光度計，比色皿【實驗內(nèi)容】1.葉綠素的提取與定量取菠菜新鮮葉片2g，玉米新鮮葉片0.2g。洗凈，擦干，去掉中脈(玉米葉片可直接剪碎)，剪碎，放入研缽中。研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，取10ml丙酮，分幾次加入研缽，充分研磨后過濾，定容至10,mL。將兩種植物的葉綠素提取液置于試管中，避光保存。備用。取0.1ml菠菜葉片色素提取液及0.3ml玉米葉片色素提取液，用丙酮稀釋到3ml，測定吸收光譜（400nm-700nm）,測定663、645nm處的吸光值，根據(jù)公式計算葉綠素a、葉綠素b的含量。葉綠體色素的分離：取圓形定性濾紙一張，用毛細管吸取葉綠體色素提取滴在圓形濾紙中心，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，保證葉綠素擴展速度均勻，保證色素擴展清晰，風干后，應多點樣幾次，大約20次左右.在圓形濾紙中心戳一圓形小孔（直徑約3mm），將紙捻一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿突出）。長形濾紙一條，也點樣后層析分離（用于測定吸收光譜）培養(yǎng)皿中加入適量的四氯化碳，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在培養(yǎng)皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿。此時，推動劑借毛細管引力順紙捻擴散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應相同，且應略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。長形濾紙放入盛有四氯化碳大試管中，進行層析后獲得線形不同色素條帶，分別剪下后測定吸收光譜。葉綠素的理化性質(zhì)部分3熒光現(xiàn)象的觀察用反射光和透射光觀察提取液的顏色有何不同，反射光下觀察到的提取液顏色即為葉綠素產(chǎn)生的熒光顏色。4光對葉綠素的破壞作用：取葉綠體色素提取液少許，分裝兩支試管中，一支放在黑暗處（或用黑紙?zhí)装┝硪恢Х旁趶姽庀拢柟庀拢?，?jīng)過2-3h后，觀察兩支試管中溶液的顏色有何不同。銅代反應：取色素提取液少許于試管中，一滴一滴加濃鹽酸，直至溶液顏色出現(xiàn)褐綠色，此時葉綠素分子已遭破壞，形成去鎂葉綠素。然后加醋酸銅晶體少許，慢慢加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色。此即形成了銅代葉綠素。皂化反應：取葉綠體色素提取液2mL于大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中。加入30%KOH一甲醇溶液，充分搖勻，再加入蒸餾水約3-5mL，搖勻靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層上層是黃色素，下層是綠色素?！緦嶒灲Y果】1.各吸收光譜的測定波總光和色素色色色色長/、第一第二AA-―*第二平均素1素2素3素4(nm)次次次4000.40.40.40.40.00.00.50.264067147405334244100.50.40.50.50.00.00.60.066966241436344234200.60.50.60.60.00.00.60.333602707476667314300.70.60.70.70.00.00.70.4

49243503496896210.70.60.70.60.00.00.50.418480691507841270.50.40.50.40.00.00.20.403460986536693960.40.40.40.40.00.00.20.593379976405124430.40.30.40.40.00.00.20.348955834406730890.30.20.30.30.00.00.10.122803813384564920.10.10.20.10.00.00.00.072450072251791840.00.00.10.00.00.00.00.082651688140757630.00.00.00.00.00.00.00.041267648080545310.00.00.00.00.00.00.00.027156335050447350.00.00.00.00.00.00.00.024105831030250350.00.00.00.00.00.00.00.028156335030252390.00.00.00.00.00.00.00.027156235030353420.00.00.00.00.00.00.00.030176437020363450.00.00.00.00.00.00.00.046317852030484500.00.00.00.00.00.00.10.056408560081101560.00.00.00.00.00.00.00.054408560030596630.00.00.00.00.00.00.10.062489869030510690.00.00.10.00.00.00.10.081661387010540690.00.00.10.00.00.00.10.091772497030551700.00.00.10.00.00.00.10.081701789020632830.10.00.10.10.00.00.10.111984719050938590.10.10.20.10.00.00.20.2440450460470480490500510520530540550560570580590600610620630640650

91722295071256026600.30.30.30.30.00.00.50.163328359051941696700.30.30.30.30.00.00.40.141116238021436076800.00.00.10.00.00.00.10.079691086000526326900.00.00.00.0-0.0.00.00.0140946230020000327000.00.00.00.0-0.-0.0.00.00400361300300314036450.10.10.10.10.00.00.10.146318052061076946630.30.30.40.30.00.00.50.19660139003188355總光合色素吸收光譜如圖:總光合色素吸收光譜應有兩個峰，分別位于430nm處（藍紫光）和660nm處（紅橙光）。總葉綠素吸光圖譜350 400 450 500 550 600 650 700 750

3葉綠素分離由圖中可以看出，色素3和色素4在藍紫光和紅橙光處均由吸收峰，可判斷出其為葉綠素a或葉綠素b。由于色素3的吸收峰在430nm處而色素4的吸收峰在460nm處，因而色素3為葉綠素a，色素4為葉綠素b。3葉綠素分離胡蘿卜素類色素在植物葉片中含量較少，因而吸光值較低，二者吸光圖譜很相似，吸收峰均在藍紫光內(nèi)，并無法準確判斷二者。通過濾紙上條帶的顏色及前后順序，可以判斷，光和色素1?4分別為胡蘿卜素，葉黃素，葉綠素a，葉綠素b。4葉綠素定量菠菜（稀釋30倍）玉米（稀釋10倍）吸光值645nm0.1520.045663nm0.3900.163Chla濃度(pg/ml)4.5441.950Chlb濃度(pg/ml)1.6560.268ChlT濃度(pg/ml)6.2002.2180.1ml提取液Chla含量(pg)13.6321.9500.1ml提取液Chlb含量(pg)4.9680.2680.1ml提取液ChlT含量(pg)18.6002.218材料中Chla含量（pg/g）681.6889.19材料中Chlb含量（pg/g）248.4122.21材料中ChlT含量（pg/g）930.01011.395葉綠素的熒光現(xiàn)象：透射光觀察：綠色反射光觀察：紅色6光對葉綠素的破壞作用：置于暗處的葉綠素提取液仍為鮮綠色置于光下的葉綠素提取液為黃色結果見附圖17銅代反應：實驗結果見附圖2及附圖38皂化反應：實驗結果見附圖4【實驗討論】由實驗結果一可以看出，葉片中葉綠素有兩個吸收峰，分別位于在處的吸收峰主要為，在處的吸收峰主要為。而計算葉綠素的含量主要是計算在處的吸收峰。對于兩種葉綠素而言，在645nm和663nm處均有吸收峰，且在這兩處的比例吸收系數(shù)K均已知，由lambert-beer定律，可列出濃度C與光密度D之間的關系式：A663=82.04Chla+9.27Chlb（1）A645=16.76Chla+45.60Chlb（2）解方程（1）（2）即得：Chla含量（）=12.7Aq—2.69Ag663 645Chlb含量（）=22.9A645—4.68A663lambert-beer定律是光吸收基本定律，反應的是光吸收值與液層厚度與濃度之間的關系。其關系式為：A=-lgT=K.b.c，其中K只與某物質(zhì)自身的結構相關，是物質(zhì)的特征常數(shù)。本實驗所用的比色皿厚度為1cm，因此直接將K值帶入公式A=Kc計算濃度。幾種光合色素均含有多環(huán)共軛結構，該種結構使得其帶有不同的顏色，在不同波長處有吸收值。一般植物葉片中的葉綠素a/b的理論比值應接近3:1，但實驗結果看出，，所得菠菜中的葉綠素a/b的比值接近3：1，而玉米則大于3:1?？赡茉蚴且驗闇y定過程中，經(jīng)過一段時間的光照，材料中葉綠素減少一定量，剩余的葉綠素比值與最初植物材料中提取的葉綠素比值相比會發(fā)生一定改變（若兩種葉綠素減少量相同，則比值會變大）。從葉綠素a和b的吸收光譜可以看到，它們在藍紫區(qū)橙紅區(qū)各有一個強的吸收峰，這說明葉綠素主要吸收橙紅光和藍光。因此，這兩種光對光合作用最有效。葉綠素對光譜中段的綠光吸收得很少，綠光被反射出來，這就是為什么植物葉片通常都呈綠色的原因。還可以看到，葉綠素b的兩個吸收峰比葉綠素a的兩個吸收峰更為靠近，因此，葉綠素b的存在使得葉片的吸收光譜縮短了一些“綠色空檔”，從而提高了葉片對不同波長光的利用效率。因此陰生植物葉綠體中有更高比例的葉綠素b。因為陰生植物所處的光環(huán)境比陽生植物差，要吸收不同波長的光才能獲得足夠的光能來滿足光合作用的需要。葉綠素a/b的值在生理學上的意義最重要的就是判定植物為陰生植物還是陽生植物。光破壞的機理：葉綠素在光下接受電子會迅速從基態(tài)竄升至激發(fā)態(tài)，雖然還會馬上回落成基態(tài)，但這個過程中會有90%的能量以熱能的形式散失掉，并用剩余的10%左右的能量發(fā)出紅色的熒光.經(jīng)過一段時間的陽光照射，能量達到一定程度的損失，使剩余的能量所對應的波長不足以發(fā)出綠光,只夠發(fā)出黃光。因此在實驗過程中是要盡量避光進行實驗，否則光對葉綠素的破壞作用會導致測量結果出現(xiàn)較大誤差。若當熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學儀器還可在短時間內(nèi)看到紅色“余暉”，這就是磷光。從葉綠素a和b的吸收光譜可以看到，它們在藍紫區(qū)橙紅區(qū)各