Western blotting實驗所需的試劑器材和操作流程

三、Westernblotting所需：1、 lxSDSLysisbuffer：Tris-HCl(pH=6.8) 0.757gSDS 2g甘油 10ml加去離子水定容至100ml。2、 RIPALysisbuffer:儲備(1000ul)50mMTris/HCL(PH8.0)150mMNaCL1%Nonidet-P401%Sodiumdeoxycholate0.1%SDS0.1mMDTT(二硫蘇糖醇)0.05mMPMSF1xCocktail(PMSF:Phenylmethanesulfonylfluoride,中文名為苯甲基磺酰氟。現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后應(yīng)在30分鐘內(nèi)使用。)3、 5xSDS電泳緩沖液儲存液：甘氨酸 72.05gTris堿 15.15g加入去離子水定容至1000ml。4、 5xSDS上樣緩沖液Tris-HCl(PH6.8) 250mMDTT 500mMSDS 10.0%溴酚藍(lán) 1.0%甘油 50%加去離子水定容至100ml分裝至1.5mlEP管中，4°C保存。5、 30%丙烯酰胺Solution1：Acrylamide(丙烯酰胺) 29.0gBis-Acrylamide 1.0g加去離子水定容至100ml。6、 pH8.8Solution2：(分離)1.5MTris-HCl(PH8.8) 18.15g調(diào)PH至8.8,加去離子水定容至100ml,4C保存。7、 pH6.8Solution3：(積層)0.5MTris-HCl(PH6.8) 3.0g調(diào)PH至6.8，加去離子水定容至50ml,4°C保存。8、 10%過硫酸胺(APS)：稱取0.1g過硫酸銨(APS)，加入lml去離子水溶解。9、 10%SDS溶液：稱取1OgSDS，加入去離子水定容至100ml，室溫保存。10、 Blockingbuffer(封閉液)：TOC\o"1-5"\h\z脫脂牛奶 2.5g加去離子水定容至50ml。11、10xTBS：\o"CurrentDocument"Tris-HCl(PH7.6) 200mMNaCl 1500mM加去離子水定容至1000ml。12、 洗脫抗體緩沖液：(TBST)\o"CurrentDocument"Tris-HCl (PH7.6) 20mMNaCl 150mMTween20 0.05%加去離子水定容至1000ml。13、 1MTris-HClTris 121.1g定容至1000ml，用HCl調(diào)定PH值。14、 考馬斯亮藍(lán)R-250染色液TOC\o"1-5"\h\z考馬斯亮藍(lán)R-250 1.0g異丙醇 250ml冰醋酸 100ml加去離子水定容至1000ml。15、 考馬斯亮藍(lán)R-250脫色液冰醋酸 100ml乙醇 50ml加去離子水定容至1000ml。六、Westernblotting實驗流程1、蛋白提?。囵B(yǎng)細(xì)胞。.棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1XPBS漂洗細(xì)胞3次，去盡殘留培養(yǎng)基。.加入1XSDS樣品緩沖液(6-wellplate,100pl/w或75cm2plate,500-1000pl/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。.離心12000g,15min，取上清。.95°C加熱煮沸樣品5minutes。2、 蛋白含量測定(BCA法).工作溶液(WorkingReagent,WR)配制：將50體積試劑BCAReagent與1體積CuReagent混合后即為標(biāo)準(zhǔn)工作試劑，呈嫩綠色。此WR工作溶液在室溫穩(wěn)定，1周內(nèi)使用不明顯影響測定精度。.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制：用雙蒸水、0.9%生理鹽水、PBS、或用待蛋白樣品之緩沖液進(jìn)行倍比稀釋：100卩14000卩g/mlBSA+100卩1稀釋溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl)=200卩1(BSA=2000卩g/ml)取100卩1連續(xù)倍比稀釋7次，得到BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625卩g/ml。.蛋白測定微板測定用96孔板，反應(yīng)終體積250pl，用酶標(biāo)儀測定。微板測定：將25pl標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本與200plWR工作溶液混合。反應(yīng)條件：37°C30min。將反應(yīng)板溫度冷卻至室溫。測定562nm光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算蛋白濃度。3、 SDS電泳.制膠組裝膠架將潔凈、無水的玻片對齊，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭頭向上，并確保下端平齊。放于制膠架上夾緊，下端緊貼密封條。分離膠的配置(配置前要用熱水將所用試劑進(jìn)行預(yù)熱)a.10%分離膠配方如下表：10%膠蒸餾水30%Acr-Bis(29:1)1.5MTris-HclPH&810%SDS10%AP(過硫酸銨)TEMED15ml6.0ml4.95ml3.75ml0.015ml0.015ml0.006mlC.灌膠混勻后用移液槍將凝膠溶液小心注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm)。液封在凝膠表面沿玻板輕輕加一層無水乙醇以隔絕空氣(注意加乙醇時要慢些順著瓶沿加)，使膠面平整。靜置約30min觀察膠面變化，當(dāng)看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限時，表明膠已完全凝固，倒掉上層無水乙醇，并用濾紙吸干殘留的液體。E.濃縮膠的配置a.5%濃縮膠配方下表：5%膠蒸餾水30%Acr-Bis(29:1)0.5MTris-HclPH6.810%SDS10%AP(過硫酸銨)TEMED7ml4.8ml1.04ml2ml0.080ml0.080ml0.010mlb.插入制膠梳混勻后用移液槍將凝膠溶液注入到長、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(分離膠上方)，輕輕加入樣品模板梳，小心避免氣泡的出現(xiàn)。約30分鐘，聚合完全。.電泳A.安裝電泳槽將制備好的凝膠板取下，小心拔下梳子。兩塊10%的凝膠板分別插到U形橡膠框的兩邊凹形槽中，可往上提起使凝膠板緊貼橡膠。將裝好玻璃板的膠模框平放在仰放的貯槽框上，其下緣與貯槽框下緣對齊，放入電泳槽內(nèi)。倒入lXtris-gly電泳緩沖液。B.樣品處理對于蛋白樣品直接取相應(yīng)體積的樣品，依次加上適量的5xbuffer(加了B-巰基乙醇)，混勻。95°C加熱煮5-10min。加樣用移液槍取處理過的樣品溶液，小心地依次加入到各凝膠凹形樣品槽內(nèi)，marker加入到其中一個槽內(nèi)，為區(qū)別兩塊板，marker可加在不同的孔槽中。電泳將電泳槽放置電泳儀上，接通電源，正負(fù)極對好。積層膠用60V電壓，分離膠用120v電壓，待溴酚藍(lán)標(biāo)記移動到凝膠底部時，關(guān)電源，把電泳緩沖液倒回瓶中。剝離膠把電泳槽取出，兩塊板拿下來，用刮片從長短玻片中間翹起，再把濃縮膠刮掉，取下。留待轉(zhuǎn)膜。4、轉(zhuǎn)膜.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿-3層濾紙-膠-膜-3層濾紙-海綿，每層放好后，趕去夾層中的氣泡切記：一定要將三明治的順序弄對。檢查電源正負(fù)極連接是否正確。.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，250mA,lh-2h(具體時間因情況而定)。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。PVDU-?■才.■才■■才4=?■U-?■才.■才■■才4=?■廣.J-?■點.J■4■丿4-匸二海三明治示意圖5、 封閉配置5%的脫脂牛奶，室溫封閉lh,搖床上緩慢勻速搖晃。6、 免疫反應(yīng).一抗孵育配置適宜濃度的一抗，依據(jù)Marker用剪刀將相應(yīng)的條帶剪出，在15ml或50ml離心管中孵育，4°C,過夜。.熒光二抗或酶標(biāo)二抗的孵育熒光二抗的濃度1:5000，酶標(biāo)二抗?jié)舛?:5000(可以依據(jù)自己的實驗適當(dāng)調(diào)整二抗的濃度)。室溫孵育1-2h。7、 化學(xué)發(fā)光顯影定影.配置EC1發(fā)光液，兩種液體按照1:1的比例配置。.攜帶物品：剪刀、鑷子、曝光夾、吸水紙、定影液、顯影液、膠片。.將膠片裁剪成需要的大小，放置一旁備用。⑷?將PVDF膜放置于曝光夾中，在膜上均勻滴加ECL發(fā)光液，查看發(fā)光