雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的運(yùn)用,農(nóng)藝學(xué)論文

雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的運(yùn)用,農(nóng)藝學(xué)論文近年來，隨著蛋白質(zhì)組概念的提出[1]，蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)越來越遭到大家的關(guān)注，該技術(shù)尤其是在作物雄性不育研究方面應(yīng)用較多。蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)是雙向凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，該技術(shù)通過雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的定量研究，后期與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)蛋白的定性分析，最后還可利用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白進(jìn)行詳細(xì)的鑒定，確定蛋白的種類、功能等[2-3]。因而，結(jié)合雙向電泳技術(shù)，從蛋白質(zhì)組水平研究作物雄性不育機(jī)理，尋找與育性相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而找到相應(yīng)的不育基因，對(duì)研究作物雄性不育具有重要的理論和實(shí)踐意義。1蛋白質(zhì)組學(xué)研究方式方法蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常規(guī)方式方法是提取全蛋白，經(jīng)雙向電泳分離構(gòu)成一個(gè)蛋白質(zhì)組的二維圖譜，通過計(jì)算機(jī)圖像分析得到各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、表示出量等，再用質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，建立正常生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)。在這里基礎(chǔ)上，能夠比擬分析不同條件下的蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化，如蛋白質(zhì)表示出量的變化、翻譯后的加工修飾、蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上定位的改變等，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特定功能的蛋白質(zhì)及其基因[2，3]。蛋白質(zhì)組研究分析通常有3個(gè)步驟，第一步，運(yùn)用雙向電泳技術(shù)分離樣品中的蛋白質(zhì)；第二步，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)或N端測(cè)序技術(shù)鑒定雙向電泳分離的蛋白質(zhì)；第三步，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)儲(chǔ)存、處理比擬獲得的數(shù)據(jù)。1.1蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)1956年，Smithiea和Poulik發(fā)明了雙向電泳，1975年，OFarrell對(duì)其做了改良，并建立起了雙向凝膠電泳技術(shù)體系[4]，1975年Gasparic等合成了固相pH介質(zhì)[5]，通過近40年的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)已逐步成熟完善，但其基本原理并未改變，即根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異，進(jìn)行雙向電泳，第一向是等電聚焦〔isoelectricfocusing,IEF〕,第二向是聚丙烯酰胺凝膠電泳〔SDS〕,這樣各個(gè)蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上，從左到右是等電點(diǎn)的增加，從上到下是分子量的增加。雙向電泳一次能夠分辨出1000～2000個(gè)蛋白質(zhì)，有些甚至能夠分辨出5000～10000個(gè)斑點(diǎn)[6-9]，而且同時(shí)獲得該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量。固向化pH梯度〔ImmobilizedpHgradient,IPG〕的發(fā)明和完善，使雙向凝膠電泳的重復(fù)性和上樣量得到了改善，而與雙向凝膠電泳相結(jié)合的新型凝膠染色技術(shù)，如熒光染色的開發(fā)，使其分辨率大大增加。1.2質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的技術(shù)突破之一，其原理是將樣品分子離子化，根據(jù)離子間質(zhì)荷比〔m/z〕的差異來分離并確定質(zhì)量。質(zhì)譜測(cè)定中首先將通過2-DE分離到的蛋白質(zhì)用特定的蛋白質(zhì)酶消化成肽段，然后用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析[2,3]?；|(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜技術(shù)〔Matrix-assistedLaserDes-orptionIonization,MALDI〕和電噴霧質(zhì)譜技術(shù)〔Elec-trosprayIonization,ESI〕的發(fā)明，使得傳統(tǒng)的主要介于小分子物質(zhì)的有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)獲得了突破性進(jìn)展。這兩項(xiàng)技術(shù)具有高靈敏度高通量和高質(zhì)量的檢測(cè)范圍等特點(diǎn)，使得在pmol〔10-12〕甚至fmol〔10-15〕的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能[2]。1.3生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)由于Interent、大型服務(wù)器和廣泛的計(jì)算機(jī)的介入，蛋白質(zhì)組的研究效率和精到準(zhǔn)確度大大提高[2]。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向凝膠-質(zhì)譜分析后，如需最終確定蛋白的種類，則需要查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[3]，當(dāng)前已有MELANIE、PDGVEST等軟件，可自動(dòng)迅速地完成2-DE凝膠圖像，進(jìn)行圖形處理，斑點(diǎn)檢查與量化、背景過濾、2-DE的匹配與比擬，以及統(tǒng)計(jì)分析工作。這些1預(yù)測(cè)潛在的翻譯后調(diào)節(jié)方式和三維構(gòu)造[2,7,9]。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平和能力的標(biāo)志。到當(dāng)前為止，與蛋白質(zhì)有關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)占生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)總數(shù)的半數(shù)以上，由此可見，生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)組研究關(guān)系密切。2雙向電泳技術(shù)在作物雄性不育研究中的應(yīng)用當(dāng)前，雙向電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用到作物雄性不育研究中，并找到了一些與育性相關(guān)的蛋白。水稻、小麥、大豆等作物的不育相關(guān)蛋白研究表示清楚，不育系與保持系的葉片之間的蛋白質(zhì)幾乎沒有差異,種子間僅有少量差異，而花藥之間有比擬大的差異,講明不育基因表示出具有時(shí)空性和器官特異性。即與育性有關(guān)的蛋白不在營(yíng)養(yǎng)器官中表示出，而主要在花藥中表示出[10]。2.1雙向電泳技術(shù)在水稻雄性不育研究中的應(yīng)用曹以誠(chéng)等對(duì)光敏核不育水稻花藥蛋白雙向電泳表示清楚，處于14h長(zhǎng)日照下的光敏核不育農(nóng)墾58S二核花粉期蛋白比處于9h短日照育性正常二核花粉期蛋白缺少一組蛋白，這組蛋白很可能與育性表示出有關(guān)[11]。王臺(tái)等對(duì)光周期敏感核不育水稻葉綠體的特異性蛋白研究發(fā)現(xiàn)，無論內(nèi)外環(huán)境怎樣，農(nóng)墾58S的葉綠體內(nèi)均有45kDa和61kDa的特異性蛋白質(zhì)，而農(nóng)墾58沒有，以為這兩種特異蛋白可能和育性轉(zhuǎn)換有關(guān)[12]。謝錦云等對(duì)溫敏核不育水稻的不育和可育花藥樣品進(jìn)行雙向電泳分離、質(zhì)量指紋圖譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，在不育到可育圖譜上，明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)包括幾丁質(zhì)酶、酸性磷酸酶、谷蛋白前體等，明顯下調(diào)的蛋白有谷氨酸氨甲酞轉(zhuǎn)移酶等[13]。文李等對(duì)紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻的不育系〔YTA〕和保持系〔YTT3〕單核花粉總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，得到85個(gè)差異表示出蛋白質(zhì)，初步鑒定出9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些蛋白的缺失或表示出量降低可能導(dǎo)致能量供給缺乏、淀粉合成受阻，因此花粉不能正常發(fā)育[14－15]。2.2雙向電泳技術(shù)在小麥雄性不育研究中的應(yīng)用門淑珍等取小麥京411不育株〔Ms2〕和可育株處于減數(shù)分裂期的花藥進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)不育花藥比可育花藥缺少相對(duì)分子量分別為15.8,17,17.8,38,81.3kD的幾個(gè)多肽，不育系花藥比可育花藥多一個(gè)相對(duì)分子量為16.2kD的酸性蛋白,其等電點(diǎn)約174.1kD〕的多肽上，可育花藥的蛋白斑點(diǎn)濃于不育花，講明可育花藥中這幾種蛋白的含量高于不育花藥[16]。范寶莉等在小麥T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系蛋白質(zhì)雙向電泳比擬研究中發(fā)如今花粉敗育的關(guān)鍵時(shí)期一二核小孢子期，小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系有53kD/pI5.550kD/pI5.7,48kD/pI5.6和20kD/pI7.5共4種蛋白組分存在，而保持系中沒有[17]。劉衛(wèi)等對(duì)遺傳型不育系ms〔S〕-西農(nóng)1376、對(duì)應(yīng)的保持系〔A〕-西農(nóng)1376和生理型〔化學(xué)殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)〕雄性不育系ms〔A〕-西農(nóng)1376為材料,利用IEF/SDS凝膠電泳技術(shù),對(duì)發(fā)育到單核后期的花藥全蛋白特異性進(jìn)行了比擬分析,得到320～350個(gè)清楚明晰的蛋白點(diǎn)，以為遺傳型和SQ-1誘導(dǎo)的生理型不育系蛋白質(zhì)圖譜與正常保持系在蛋白質(zhì)〔多肽〕表示出量上存在一定的差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)有幾種蛋白質(zhì)的表示出有明顯的特異性,兩個(gè)不育材料2D膠上共有幾個(gè)明顯的特異蛋白點(diǎn),而在保持系中未發(fā)現(xiàn);兩個(gè)不育材料又分別具有自個(gè)的特異蛋白表示出,不育機(jī)理不同;不育系中某些蛋白的表示出遭到了抑制,并開啟了與花藥敗育有關(guān)的特定蛋白的表示出[18]。2.3雙向電泳技術(shù)在大豆雄性不育研究中的應(yīng)用曾維英利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)大顯質(zhì)核互作雄性不育系NJCMS2A及其同型保持系NJCMS2B花藥進(jìn)行蛋白質(zhì)組比擬分析,在二胞花粉期花藥2-DE圖譜上分別檢測(cè)到約217、214個(gè)蛋白點(diǎn)，兩系間有25個(gè)差異表示出蛋白點(diǎn)，華而不實(shí)13個(gè)在NJCMS2A中表示出，而在NJCMS2B中缺失，10個(gè)在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中表示出，2個(gè)在NJCMS2A中表示出量明顯下調(diào)。在NJCMS2A與NJCMS2B的單核小孢子期花藥2-DE圖譜上分別檢測(cè)到約193、192個(gè)蛋白點(diǎn)，兩系間有16個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中9個(gè)在NJCMS2A中表達(dá)而在NJCMS2B中缺失，7個(gè)在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中表示出[19,20]。3存在問題蛋白質(zhì)樣品制備的優(yōu)劣將直接影響2-DE結(jié)果，是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵步驟之一。由于植物細(xì)胞含有很厚的細(xì)胞壁和多種次生代謝物質(zhì)，因而，蛋白的提取相比照較復(fù)雜。當(dāng)前常用的蛋白質(zhì)提取和沉淀方式方法主要有尿素/硫脈法、TCA/丙酮、醋酸銨沉淀法、酚提取等方式方法，華而不實(shí)TCA-丙酮沉淀蛋白是利用雙向電泳技術(shù)分離植物蛋白質(zhì)最常用的方式方法。它的優(yōu)點(diǎn)在于在沉淀蛋白的同時(shí)，抑制了蛋白酶的活性，并去除一些干擾物質(zhì)。但2-DE還是有很多缺乏之處，它不易檢測(cè)出低拷貝的蛋白、極酸或極堿的蛋白質(zhì)、分子量極大或極小的蛋白質(zhì)以及難溶的蛋白質(zhì)，有時(shí)一個(gè)蛋白點(diǎn)含有不止一種蛋白，重復(fù)性仍然不理想等，需要進(jìn)一步的改良。4瞻望蛋白質(zhì)組研究不僅能夠作為現(xiàn)有基因組功能研究的鑒定和補(bǔ)充，也為不育基因的研究開拓了新的道路。植物雄性不育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果講明了雄性不育的育性轉(zhuǎn)換與某些特異蛋白相關(guān)，包括蛋白質(zhì)的表示出上調(diào)、下降、缺失或者一些蛋白的新增，也獲得了一些與雄性不育育性轉(zhuǎn)換相關(guān)的蛋白，并運(yùn)用質(zhì)譜分析初步確定了蛋白，但對(duì)這些蛋白在作物雄性不育的育性轉(zhuǎn)換經(jīng)過中的作用機(jī)理還不清楚，因而，需要與轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果相結(jié)合，把蛋白質(zhì)與基因聯(lián)絡(luò)起來，能更好地揭示植物雄性不育的分子機(jī)理。以下為參考文獻(xiàn)[1]HerbertBR,MolloyMP,GooleyAA,etal.Improvedproteinsolubilityintwo-dimensionalelectrophoresisusingtributephosphineasreducingagent[J].Electrophoresis,1998,19〔5〕:845-846.[2]孫正娟.太谷核不育小麥Ms2基因蛋白質(zhì)的表示出差異[D].碩士學(xué)位論文，泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.[3]楊軍，張小莉.蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展以及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用大概情況[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2020,10〔10〕:19-20.[4]OFarrellPH.HighResolutionTwo-DimensionalElec-trophoresisofProteins[J].TheJou