核磁共振內(nèi)標(biāo)法定量分析肝素鈉中多硫酸軟骨素

核磁共振內(nèi)標(biāo)法定量分析肝素鈉中多硫酸軟骨素高照明;張玉冰;于永良@@1rn,L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖D證明,肝素鈉還具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒,抗癌等多種生物學(xué)功能.200881FDAOSCSOSCSquantitativeanalysisofOversulfatedChondroitinSulfateby1H-NMRinternalstandardmethodhasbeendevelopedinthispaper.Theoptimumexperimentalconditionshavebeendescribed.Thelinearrangeofthemethodwasfoundtobe0.1％-5％.Theregressionequationderivedwasy＝2.7929x-0.0317(r＝0.9994).Thelimitofdetectionwas0.1％.Theaveragerecoveryratewasshowntobe98.1％(n＝6),andtheRSDwas0.35％(n＝6).Theresultsshowedthat1H-NMRcanbeusedforthequantitativedeterminationofcontaminantsinheparin.【期刊名稱】《分析化學(xué)》【年(卷),期】2011(039)004【總頁(yè)數(shù)】2頁(yè)(P601-602)【作者】高照明;張玉冰;于永良【作者單位】生態(tài)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島科技大學(xué)化工學(xué)院,青島,266042;生態(tài)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島科技大學(xué)化工學(xué)院,青島,266042;生態(tài)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島科技大學(xué)化工學(xué)院,青島,266042【正文語(yǔ)種】中文肝素鈉是一種由葡萄糖胺,L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸脂鈉鹽,是臨床大量應(yīng)用的抗凝血藥。研究證明,肝素鈉還具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能。2008年初,歐美各國(guó)發(fā)生了肝素鈉注射液事件,致使81人死亡。隨后,美國(guó)FDA應(yīng)用核磁共振方法在肝素鈉原料藥中定性查出雜質(zhì)多硫酸軟骨素(OSCS),并認(rèn)為OSCS是引起用藥異常的雜質(zhì)。肝素與OSCSOSCS;國(guó)內(nèi)將多糖全水解,然后衍生,采用液相色譜法分析[5]。但上述方法都具有局限:液相色譜法樣品前處理復(fù)雜,水解時(shí)間長(zhǎng)(4h),且肝素OSCS1h);而核磁共振氫譜方法大多用于常量定性分析。隨著核磁共振儀器分辨率的提高、價(jià)格的降低和單次測(cè)試成本降低,核磁共振氫譜定量分析在工業(yè)大樣本測(cè)試中得到發(fā)展,但靈敏度與色譜相比仍有差距,特別是對(duì)高聚物、多糖OSCS儀器與試劑Avance500Bruker5mmBBO探頭;AL2040.1mg;HP3DCEAgilent(50μm×56cm,BeckmanMillipore:CAT.NO.1304038USPROCKVILLE.MDLOTFOH210,OSCS標(biāo)準(zhǔn)品:CAT.NO.1133580USPROCKVILLE.MDLOTFOI113FDA);D2O(99.8%DCILropionic,TSP,98%DSigma);H3PO4(廣州化學(xué)試劑廠)。NMR(CENMR1H:500.03MHz,脈沖序列(Pulprog)Zgcppr,數(shù)據(jù)點(diǎn)(TD):65536,采樣次數(shù)(NS):100,譜寬(SWH):9615.385Hz,FID(Fidres):0.146719Hz,采樣時(shí)間(AQ):3.407940s,接收增益(RG):90.5,溫度(TE):298K,馳豫時(shí)間(D1):4.00s,窗函數(shù)(LB):1.00Hz。CE36mmol/LpH3.5)200nm25℃,25kVkPa3s。(1)TSPTSP10mg50mLTSP(2)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確OSCS25mg5mm0.6mLTSP5min,靜置,待溶液澄清均勻即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(3)OSCS12.5mgOSCS6mLTSP(4)OSCS25mg5mm0.6mLOSCSOSCS25mg0.3mLOSCS0.3mLTSP2.5%(w/w)OSCS1%,0.5%,0.2%,0.10.05%(w/w)OSCS2.425mg5mm0.6mLTSPNMR素鈉精品2mg,加水制成約2g/L溶液,即可進(jìn)行CE實(shí)驗(yàn)分析。標(biāo)準(zhǔn)品NMROSCS含量測(cè)定方法的建立及氘代溶劑及內(nèi)標(biāo)物的選擇肝素鈉、OSCS為溶劑。本研究的內(nèi)標(biāo)物既作為計(jì)算樣品含量而設(shè)的標(biāo)定物,又是化學(xué)位移數(shù)值的TSPTSP(δ)0,在OSCSOSCSδ2.04N-乙酰胺基的甲基的信號(hào);OSCS在δ2.15處有獨(dú)立單峰OSCSN-乙酰胺基的甲基的信號(hào);此峰是較尖銳的單峰,可分別定義為兩者OSCS112.3處的TSP40.00OSCSδ2.15y=2.7929x-0.0317,r=0.9994。表明OSCSδ2.04/1099.96,RSD1.31%。表明OSCSOSCS0.10%～5.00%時(shí),核磁共振氫譜均能檢出肝素鈉OSCSOSCS0.05LOD0.1%。1.0%OSCS24hδ2.15δ2.040.0273,RSD0.7424h取含1.0%(w/w)OSCS的肝素鈉溶液,在同一實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)進(jìn)行6次平行NMR測(cè)試,并以δ2.04與δ2.15相對(duì)積分面積的比值考察實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性,RSD為0.35%(n=6)。實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。5%(w/w)OSCS20mg65mmOSCS0.6,0.6,0.4,0.4,0.20.2mL,再向每支核磁TSP0,0,0.2,0.2,0.40.4mL,進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),平均回收率98.1%,RSD0.95%。3.4樣品測(cè)定和分析分別取6個(gè)不同廠家的肝素鈉工業(yè)精品,按照上述實(shí)驗(yàn)條件和測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)樣品的積分值測(cè)定3次,取平均值。為便于比較,樣品同時(shí)進(jìn)行了毛細(xì)管電泳(CE)檢測(cè),檢測(cè)方法按2.2和2.4項(xiàng)進(jìn)行,結(jié)果表明,核磁共振方法和毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)結(jié)果相符。在測(cè)試樣品量充足的情況下,在OSCS含量為0.2%～0.5%時(shí),核磁共振方法仍具有較好的檢出能力?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】U.S.FoodandDrugAdministration,CenterforDrugEvaluationandResearchSiteonAdverseeventsAssociatedwithHeparin,/cder/drug/infopage/heparin/default.htm,2008WANGHao,YUGuang-Li,ZHAOXia,HAOCui,HUYan-Nan,YINXiu-Hong().ChineseJ.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2009,37(8):1147～1151McEwenI,MulloyB,HellwigE.PharmeuropaBio.,2008Dec,2008(1):314LiuHY,ZhangZQ,LinhardtRJ.NaturalProductReports,2009,26,(3):313～3215