免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本原理

通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體（單克隆或多克隆）檢測組織、細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原物質(zhì)，形成抗原—抗體復(fù)合物；此復(fù)合物上帶有事先標(biāo)記的標(biāo)記物，通過與標(biāo)記物相對應(yīng)的檢測系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，以達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。2021/4/272組織與細(xì)胞材料的制備免疫組織化學(xué)方法2021/4/273組織與細(xì)胞材料的制備組織石蠟切片制作組織冰凍切片制作細(xì)胞爬片制作細(xì)胞涂片制作2021/4/274切片的制作組織的固定組織石蠟包埋切片2021/4/275目的:（1）防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。（2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制片。（5）防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。（6）經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便

于辨認(rèn)。組織材料的固定2021/4/276固定液的選擇：(1)甲醛固定液：10％福爾馬林，10％中性福爾馬林，10％中性緩沖福爾馬林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑較適合富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重鉻酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，對核內(nèi)抗原的保存效果較好。(10)PEG液(11)0.4%對苯醌(12)碳二亞酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇類固定劑2021/4/277固定時間：固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。2021/4/278大組織：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ過夜，無水乙醇Ⅰ30～60min，無水乙醇Ⅱ30～60min，無水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可視觀察結(jié)果而定），石蠟Ⅰ30min石蠟Ⅱ1～2h，石蠟Ⅲ2～3h。小組織：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ過夜或2h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼觀察），石蠟Ⅰ30min，石蠟Ⅱ30min，石蠟Ⅲ1～2h。組織石蠟包埋2021/4/279切片載玻片的清潔：市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如需開展原位雜交，還需將玻片240℃烤2h。切片粘合劑的使用：

（1）多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。

（2）APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干凈載玻片→丙酮5min→用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml+50ml丙酮）1～3次→純丙酮洗二次→干燥玻片→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。?）鉻礬明膠液：鉻礬0.5g明膠5gH2O21000ml（4）甲醛明膠液：40％甲醛2.5ml明膠0.5gH2O2100ml2021/4/2710切片：

石蠟切片：

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片18h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)編上號

(6)切片可在4℃保存數(shù)年

冰凍切片：(1)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理

24h，冰凍切片。(2)冰凍切片后需涼干后立即固定(3)冰凍切片固定后-80℃保存?zhèn)溆?021/4/2711細(xì)胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。待細(xì)胞生長達到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。2021/4/2712細(xì)胞涂片制作離心將細(xì)胞收集出來，用預(yù)冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細(xì)胞重懸。吸取30－50ul（可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風(fēng)干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞，固定2－4小時。在細(xì)胞上加一層甘油放-20℃保存。2021/4/2713免疫組織化學(xué)方法熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫組織化學(xué)2021/4/2714熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)

直接法間接法2021/4/2715酶聯(lián)免疫組織化學(xué)ABC法S-P法2021/4/2716免疫組化二步法2021/4/2717二步法免疫組化染色步驟二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯PBS沖洗3次，每次3分鐘根據(jù)每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應(yīng)的修復(fù)0.3%過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性PBS沖洗、浸泡5分鐘，3次正常山羊血清室溫封閉10分鐘2021/4/2718甩去血清，加入適當(dāng)稀釋的一抗，37℃孵育60分鐘或4℃過夜PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分鐘PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色3－10分鐘流水沖洗蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察拍照IPP軟件分析光密度2021/4/2719抗原修復(fù)方法真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95℃，真空負(fù)壓處理10分鐘。

⑤待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進行染色。

2021/4/2720微波輻射抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進行染色。

2021/4/2721高壓抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4分鐘。

⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進行染色。

2021/4/2722隔水熱抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH0.6）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開始計時，持續(xù)40分鐘。

⑤待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。

2021/4/2723電爐加熱抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時用溫度計測量溫度，當(dāng)達92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。

⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進行染色。

2021/4/2724胃蛋白酶消化法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④PBS洗3次，1分鐘/次。

⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。

⑥PBS沖洗3次，2分鐘/次。

⑦后按選擇好的免疫組化該法進行染色。

2021/4/2725胰蛋白酶消化法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④PBS洗3次，1分鐘/次。

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。

⑥PBS洗3次，2分鐘/次。

⑦后按選好的免疫組化染色方法進行染色。

2021/4/2726注意事項一、抗體的保存

濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在4℃冰箱內(nèi)，保存時間可達1-3年。即用型抗體：理論上在4℃冰箱內(nèi)可保存半年左右。

PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個月。2021/4/2727二、出現(xiàn)假陽性的原因

組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作為判斷陽性的依據(jù)。出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過氧化物酶，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。抗體的交叉反應(yīng)。2021/4/2728三、出現(xiàn)假陰性的原因