實驗1顯微鏡的使用

細胞生物學(xué)實驗幾種光學(xué)顯微鏡的使用

實驗?zāi)康?/p>

了解幾種光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通顯微鏡提高分辨力的方法。實驗原理O2O1B1A1ABA2F1F2B2

幾種光學(xué)顯微鏡1．普通光學(xué)顯微鏡：

普通光學(xué)顯微鏡也叫復(fù)式顯微鏡，是最常見，最簡單的顯微鏡。它適于觀察一般固定的，有色的透明度較高的標本。其最大分辨力一般為0.2微米，從構(gòu)造上可分光學(xué)、機械和電子三大系統(tǒng)。2．暗視野顯微鏡：

暗視野顯微鏡是以丁達爾現(xiàn)象(Tyndallphenomenon)(即光的微粒散射現(xiàn)象)為基礎(chǔ)設(shè)計的，它使用了特殊的聚光器進行斜射照明，因光源中心束不直入物鏡，所以視野黑暗，而被檢細胞器因斜射照明發(fā)生衍射和反射，所以發(fā)亮可見。暗視野顯微鏡可用增加光照方法增加物體與背景的反差，因而可觀察到0.2-0.004微米直徑的微小粒子，但它分不清被檢物的細微構(gòu)造，它常用于觀察物體的存在與運動。暗視野顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有別。確切地說，稱暗視野顯微鏡為暗視野照明更為貼切，它是照明光線僅照亮被檢樣品而不進入物鏡，使視野背景暗黑，樣品明亮的照明方法。

3．相差顯微鏡：

相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位是指在某一時間上，光的波動所達到的位置。

一般由于被檢物體(如不染色的細胞)所能產(chǎn)生的相差的差別太小，我們的眼睛是很難分辨出這種差別的，只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。

相差顯微鏡是以光的干涉現(xiàn)象為基礎(chǔ)設(shè)計的。與普通光學(xué)顯微鏡比較，它在聚光器和物鏡上作了改動。用裝有環(huán)狀光欄的聚光器造成的空心光線柱，使直射光

(背景)和衍射光

(樣品)分開。同時在物鏡的后焦面上裝有相位板，使直射光和衍射光發(fā)生干涉，從而把我們?nèi)庋鄄荒芤姷南辔徊钭優(yōu)榭梢姷恼穹?，同時相位板上裝有吸收膜，吸收部分直射

(或衍射)光以增加反差，使人們能夠看清更加細微的結(jié)構(gòu)。所以相差顯微鏡一般用于觀察活細胞的細微結(jié)構(gòu)。4．熒光顯微鏡：

熒光是指某些物質(zhì)經(jīng)波長較短的光線照射后，分子被激活吸收能量后呈激發(fā)態(tài)，其能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱作熒光。

熒光顯微鏡是以紫外線

(3650A)或藍紫光

(4200A)照射某些物質(zhì)，可激發(fā)其產(chǎn)生熒光的原理為基礎(chǔ)設(shè)計的，利用一個高發(fā)光效率的光源，經(jīng)過一個濾光系統(tǒng)得到紫外光(或藍紫外光)，直接照射標本中的自然熒光物質(zhì)，使其產(chǎn)生自發(fā)熒光，再加以鏡檢?；蛞詿晒馊玖舷葘吮具M行染色，然后使之在上述光源照射下產(chǎn)生次生熒光，再加以鏡檢。這種顯微鏡主要用于觀察熒光(或次生熒光)物質(zhì)在細胞內(nèi)分布情況，以及測定細胞器的生理活性。

如何提高分辨力顯微鏡的能力是質(zhì)量和性能的標志。能力包括分辨率、放大率、焦點深度和視場寬度等。其中最重要的是分辨率。各種能力都有一定的界限，既互相作用，又互相制約。改善和提高了某種能力，同時降低了某些能力，只能顧其主要，兼顧其他，綜合統(tǒng)籌。1．數(shù)片孔徑(numerialaperture)

數(shù)片孔徑(N.A.)也叫鏡口率，是物鏡和被檢樣品之間的介質(zhì)的折射率(n)與物鏡所接受的光錐頂角(亦稱孔徑角)的一半α(半孔徑角)正弦的乘積。其公式如下：N.A.=n·sinα

物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的能力愈強，數(shù)值孔徑與分辨率成正比，與焦點深度成反比。物鏡的數(shù)值孔徑的N.A.值刻在物鏡殼上，如40／0.65表示40倍的物鏡，數(shù)值孔徑為0.65。物鏡的數(shù)值孔徑隨前透鏡直徑的減少而增大。顯微鏡物鏡的前透鏡口徑愈小，數(shù)值孔徑愈大，放大倍數(shù)愈高，價格愈高。

2．分辨率(resolvingpower)

物鏡分辨率是指分辨被檢樣品細微結(jié)構(gòu)的能力。通常以能清晰地分辨兩個物體點的最短距離來表示。其公式如下：R=0.61×λ/N.A．R：分辨率；

λ：照射光線波長；

N.A．：物鏡數(shù)值孔徑

分辨率以分辨兩個點的最短距離表示，R值愈小，分辨能力愈大。物鏡的分辨率與照明光線的波長成反比，與物鏡的數(shù)值孔徑成正比。

照明光線波長愈短，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的分辨率亦愈大。

物鏡的分辨力即顯微鏡的分辨率，目鏡與顯徽鏡的分辨率無關(guān)，它只把物像第二次放大，使眼睛便于觀察。目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辨的影像進行放大，無法觀察到未被物鏡分辨的細節(jié)。在光學(xué)成像過程中，目鏡不起初始造像作用，僅作放大而已。

3．放大率(magnification)

顯微鏡最后形成的物體放大影像，對被檢物體的大小比例稱為放大率，即像高比物高。放大倍數(shù)以長度計算，而不是以面積或體積計算。

顯微鏡的總放大率(Mt)應(yīng)為：Mt=Mob×Me×MphMt：總放大率；Mob：物鏡放大率；

Me：目鏡放大率；Mph：攝影透鏡放大率

一般鏡檢觀察時，攝影附加透鏡的放大倍率不計算在內(nèi)，因它未參于造像，顯微鏡辨別細微結(jié)構(gòu)的能力，不取決于總放大率，而歸于物鏡的分辨率。顯微鏡的總放大率絕非愈高愈好，有其適量范圍：最低和最高界限。適宜的總放大率是所用物鏡數(shù)值孔徑的500～1000倍。在此范圍稱作有效放大率。例如：使用40／0.65物鏡時，應(yīng)選配適宜的目鏡倍數(shù)范圍。

首先計算出有效放大倍率：

0.65×500～0.65×1000=325-650

再用物鏡放大倍率除以有效放大率：325÷40～650÷40=8-16

求得的數(shù)值是應(yīng)選配的目鏡放大倍率的范圍，即要選用8×-16×的目鏡。

總之，總放大率超過物鏡數(shù)值孔徑的1000倍時，細微結(jié)構(gòu)分辨不清，為空的放大，低于500倍時由于放大率過低，肉眼難以分辨。

4．焦點深度(depthoffocus)

當顯微鏡對被檢樣品的某一點或平面準焦時，影像的清晰范圍，不局限于這一點或面，在某上下的一定距離或深度內(nèi)也是清晰的。這段清晰的距離或深度，就叫做焦點深度，簡稱焦深，焦深長表示清晰的上下范圍或深度大，焦深短，清晰的上下界限短。

顯微鏡的焦深可變，它與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率相關(guān)。焦深與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率成反比，收縮孔徑。影像的焦深加大，提高物鏡的數(shù)值孔徑，清晰深度變小，總放大率提高，焦深度小，總放大率降低，焦深加大。使用同一物鏡，配用倍率的目鏡，其焦深隨目鏡倍率加大而減少。

實驗用品：

(一)材料：草履蟲，洋蔥內(nèi)表皮，紫鴨趾草等花粉，菠菜葉。(二)用品：普通光學(xué)顯微鏡，暗視野顯微鏡，相差顯微鏡，熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，吸管，鑷子，剪刀等。實驗方法：

l．觀察草履蟲的外形、運動、纖毛、食物泡等。

取少許棉花纖維或擦鏡紙纖維，放于載玻片上，在其上滴一滴草履蟲懸液，然后加蓋玻片觀察。2．洋蔥表皮細胞和菠菜葉的細胞核、葉綠體的觀察在載玻片上滴一滴水，撕洋蔥鱗莖內(nèi)表皮或菠菜下表皮一小塊放于其中，使其展開，然后加蓋玻片觀察。3．紫鴨趾草花粉外形、表面突起的觀察

在載玻片上滴一滴水，取紫鴨趾草雄蕊在其