植物組織石蠟切片的制備與染色觀察

植物組織石蠟切片的制備與染色觀察一．實(shí)驗(yàn)器具與試劑1.器具小培養(yǎng)皿、錫箔紙、尖頭和平頭鑷子、剪刀、刀片、吸水紙、移液槍、1ml槍頭、移液器和移液管、量筒（50mL,100mL,250mL,500mL）、廢液瓶、水浴鍋、酒精燈、三角瓶、真空鍋、烘片箱、木筷、石蠟切片機(jī)、染色缸、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等2.試劑100%酒精、100%二甲苯、100%叔丁醇、石蠟塊、蒸餾水、多聚甲醛、中性樹膠甲苯胺藍(lán)（TB）染色劑等二.實(shí)驗(yàn)步驟溶液配制10XPBS溶液：NaCl（國藥或生工）75.95gNa2HPO4.12H2O（國藥）25.07gNaH2PO4.2H2O（國藥）4.68g充分溶解后，用NaOH（國藥）調(diào)PH7.0,定容1000mL,高壓滅菌25min,4°C保存。4%多聚甲醛固定液：1XPBS100mL1M/LNaOH0.5mL水浴加熱至60-70C，在通風(fēng)櫥中加入4g多聚甲醛，待溶解后冷卻至4C,加入100山的10%的濃硫酸調(diào)節(jié)pH為7.0。材料準(zhǔn)備⑴固定取幼嫩的植物材料,將植物組織剪成合適大小的小塊,立即放入一個(gè)裝有新配制的4%多聚甲醛固定液的小器皿中,固定液體積視材料多少而定,一般材料少時(shí)10ml材料較多時(shí)可放15ml，小器皿置于冰上。上面用錫箔紙蓋好后扎孔。抽真空使得材料浸沒其中（反復(fù)真空和非真空狀態(tài)，并保固定液不要沸騰），待材料下沉到管底。具體操作如下：放置在冰上的器皿放入真空鍋里，蓋上鍋蓋，擰開蓋上螺旋，擰緊側(cè)面螺旋，打開開關(guān)當(dāng)壓力表上顯示到0.2時(shí)可計(jì)時(shí)10分鐘。關(guān)上鍋蓋螺旋，擰松側(cè)面螺旋，外面空氣會(huì)進(jìn)入真空鍋內(nèi)，當(dāng)內(nèi)外壓力相等時(shí)計(jì)時(shí)10分鐘。再重復(fù)步驟①，換一次新的固定液，4°C過夜固定，但不要超過16h。（2）漂洗用1XPBS緩沖液（PH7.0）漂洗組織塊2次，每次4C放置30min。注意PBS容易結(jié)晶可75C水浴加熱。（3）脫水在翻轉(zhuǎn)下進(jìn)行梯度乙醇和叔丁醇脫水：30%、40%、50%、60%、70%乙醇（此步可保存可過夜）、10%叔丁醇+20%水+70%乙醇、20%叔丁醇+10%水+70%乙醇、30%叔丁醇+70%乙醇、50%叔丁醇+50乙醇、70%叔丁醇+30%乙醇、90%叔丁醇+10%乙醇、100%叔丁醇（2次），30min/次。補(bǔ)充：若沒有叔丁醇，可替換一下步驟進(jìn)行30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%乙醇，然后1/4二甲苯+3/4乙醇、1/2二甲苯+1/2乙醇、3/4二甲苯+1/4乙醇、100%二甲苯（2次），每步均30min。（4）浸蠟用刀片將石蠟塊切成碎末，逐步加入到上述最后一步的材料中大約是1/4的量，37C烘箱過夜；繼續(xù)加石蠟，同時(shí)放入到42C,待石蠟不繼續(xù)熔化時(shí)放入到60C烘箱中，等待全部融化后，將叔丁醇和石蠟的混合物換成純蠟，每天上午下午（9點(diǎn)）各換純蠟一次，持續(xù)3天。（5）包埋最后將材料包埋備用。在切片前將包埋塊4°C冰箱中保存，可保存至少一年。組織切片⑴切片將包埋的材料用切片機(jī)進(jìn)行組織學(xué)切片，切成8um厚度的連續(xù)的薄片，用刀片把蠟片切成合適的長度（能放在載玻片上即可）。⑵展片和烘片轉(zhuǎn)入42C的水中展片2-3min,用氨基載玻片將其撈出，放置于42C過夜烘片（烘過的片子可以再放干燥劑的條件下保存數(shù)周。⑶脫蠟將烘過的片子浸沒在100%的二甲苯脫蠟兩次，每次15min；⑷復(fù)水梯度乙醇復(fù)水：100%、95%、85%、70%、60%、30%、水兩次，每步3min。⑸染色0.05%TB（甲苯胺藍(lán)）染色37C,30min。染色時(shí)間不要太久，中間可以拿出來看一下。然后把片子置于一個(gè)盛水的容器中，把片子浸入再提出，不要直接用水沖，