第八章細(xì)胞工程制藥技術(shù)

第八章細(xì)胞工程制藥技術(shù)第一節(jié)概述第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第三節(jié)

抗體制藥第四節(jié)植物細(xì)胞工程制藥1細(xì)胞工程的主要內(nèi)容動(dòng)植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）細(xì)胞拆合與核移植細(xì)胞器移植染色體工程胚胎工程細(xì)胞與基因治療2第一節(jié)概述細(xì)胞工程：指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)。3核移植技術(shù)動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核,移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎,這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體.4黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利1.克隆羊培育過程1997年多利56體細(xì)胞核移植技術(shù)用于治療人類疾病7核移植核移植：將一個(gè)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)移到另一去核的細(xì)胞中就是核移植，這是一項(xiàng)相當(dāng)精細(xì)的技術(shù)。細(xì)胞核移植的三個(gè)工作：（a）去掉原有的受精卵細(xì)胞核，（b）取得另一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，（c）重新植入新的細(xì)胞核。8細(xì)胞器移植即將細(xì)胞器從一個(gè)細(xì)胞中分離出來移入另一細(xì)胞中。目前已對葉綠體和線粒體進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)。人們已將葉綠體移入雞卵中，能成活27天，還有10%的光合能力。9染色體片段重組“手術(shù)”與分離是指利用物理技術(shù)對基因的載體—染色體進(jìn)行“手術(shù)”，使它斷裂與片段重組，以至對特定染色體的分離，為生物遺傳性狀的轉(zhuǎn)移與改造、植物新品種開辟了新途徑。用X射線處理，斷裂染色體，將染色體上有用的與無用的部分分開，形成片段，再通過易位、重組與選擇，獲得具有新染色體片斷的重組類型。

10細(xì)胞培養(yǎng)是把這些細(xì)胞從體內(nèi)取出，然后接種在特制的培養(yǎng)容器中，給予必要的生長條件，使它們在體外繼續(xù)生長與增殖。

細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵取決于兩個(gè)因素：一是營養(yǎng)，包括糖、氨基酸和維生素等。培養(yǎng)不同的細(xì)胞需要不同成分的培養(yǎng)基。二是生長環(huán)境，如特定的溫度、培養(yǎng)液的酸堿度和無菌條件等。

11組織培養(yǎng)是將取自動(dòng)物或植物體的小塊組織轉(zhuǎn)移到該組織能在其中繼續(xù)生存并發(fā)揮功能的人工環(huán)境中。被培養(yǎng)的組織可為單個(gè)細(xì)胞、一群細(xì)胞或器官的一部分或整個(gè)器官。培養(yǎng)中的細(xì)胞可以繁殖，可以改變大小、形態(tài)和功能，顯示特化的活動(dòng)或與其他細(xì)胞相互作用。12組織培養(yǎng)首先將外植體分離出來，然后在無菌及適當(dāng)條件下培養(yǎng)以誘導(dǎo)出愈傷組織，另外在愈傷組織隨外植體生長一段時(shí)間后還需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以避免代謝產(chǎn)物積累及水分散失等因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)和雙層濾紙植板等幾類方式。13組織培養(yǎng)技術(shù)在鑒定感染、酶缺陷、染色體異常，分類腦腫瘤和設(shè)計(jì)及測驗(yàn)藥物和疫苗方面已起了很大作用。將取自孕婦的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可判定其體內(nèi)的胎兒是否存在與唐氏綜合癥有關(guān)的染色體缺陷。

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細(xì)胞融合技術(shù)15細(xì)胞融合的發(fā)展細(xì)胞融合是60年代發(fā)展起來的一門細(xì)胞工程技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究中有重要的作用，而且在植物、微生物的改良，基因治療、疾病診治等應(yīng)用領(lǐng)域中展現(xiàn)著美好的前景。通過細(xì)胞融合得到淋巴細(xì)胞雜交瘤制備單克隆抗體被譽(yù)為免疫學(xué)上的一次技術(shù)性革命。細(xì)胞融合已成為細(xì)胞工程中的核心技術(shù)。

16細(xì)胞融合是指指人為地使兩種不同的生物細(xì)胞在同一培養(yǎng)器中，用無性的人工方法進(jìn)行直接接觸，產(chǎn)生能同時(shí)具有兩個(gè)親本細(xì)胞有益性狀的雜交細(xì)胞技術(shù)。人工方法使兩個(gè)不同的細(xì)胞融合，發(fā)生體細(xì)胞雜交，形成新的雜種細(xì)胞。故有人稱融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞。17細(xì)胞融合過程可分成兩個(gè)階段：①異核體階段(heterokaryon)：異核體是指在融合細(xì)胞內(nèi)含

有來自兩個(gè)親本的細(xì)胞核。異核體中細(xì)胞核尚未融合。②雜種細(xì)胞形成：當(dāng)異核體同步進(jìn)入有絲分裂后，核膜崩潰，來自兩個(gè)細(xì)胞核的染色體結(jié)合在一起。融合細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)細(xì)胞核，是由來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組組合在一起所形成的。此時(shí)的細(xì)胞就稱為雜種細(xì)胞。18發(fā)展史

1838年Muller第一個(gè)描述了脊椎動(dòng)物腫瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。

1907年，體外組織培養(yǎng)技術(shù)成功之后，人們觀察到體外培養(yǎng)的細(xì)胞也能融合而形成多核巨細(xì)胞。

1958年，日本岡田善雄(Okada)用高濃度的仙臺(tái)病毒(SendaiVirus)在體外成功地融合了

小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞后，細(xì)胞融合技術(shù)，得到迅速發(fā)展。

191960年，法國的Barski等首先發(fā)現(xiàn)不同類型的細(xì)胞在混合培養(yǎng)過程中自發(fā)融合的現(xiàn)象

1966年，Yerganian進(jìn)一步用仙臺(tái)病毒獲得了能夠增殖的雜種細(xì)胞。從此，人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法，即被廣泛地用于種內(nèi)、種間、屬間、科間、乃至動(dòng)、植物之間的雜種細(xì)胞的構(gòu)建，而迅速發(fā)展成為一項(xiàng)無論在生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，或在工、農(nóng)、醫(yī)方面的應(yīng)用，均具有廣闊前景的細(xì)胞工程技術(shù)。70年代，童第周在我國率先開展了這方面研究。20誘導(dǎo)方式物理法：電融合化學(xué)法：PEG融合生物法：滅活的病毒仙臺(tái)病毒紫外線喪失感染性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）三、細(xì)胞融合的方法（常用范圍濃度10%-60%，分子量1000-6000）21電融合電融合技術(shù)的原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在1－100MHz和100－1000V/cm的交流電場中，會(huì)沿電場方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖、即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電擊穿，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。

22化學(xué)融合化學(xué)融合劑：它們主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、二價(jià)陽離子載體等。其中則以PEG的使用最為廣泛。

PEG的作用：1、PEG可能使細(xì)胞膜（尤其是有絲分裂的骨髓瘤細(xì)胞）的脂類分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，容易被PEG作用打開細(xì)胞膜，使細(xì)胞融合。2、PEG可能會(huì)把細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子排開，使脂質(zhì)體扦入與膜結(jié)合。3、PEG可能作用于膜磷脂極性基團(tuán)和細(xì)胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面電位下降，同時(shí)使膜糖蛋白的排阻體積減少，最終使膜出現(xiàn)缺口，進(jìn)而融合。

23病毒融合最早被采用病毒融合劑有皰疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在內(nèi)的病毒類融合劑。滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合過程可以大大提高融合頻率。它在病毒類融合劑中最為有效，使用最廣。24實(shí)例1978年，德國的梅羅帕斯博士向世界宣告，他們已經(jīng)用細(xì)胞融合的方法培育出了薯番茄。所謂薯番茄就是馬鈴薯和番茄的雜交后代。25第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的來源原代細(xì)胞：直接來自動(dòng)物體，如雞胚細(xì)胞。二倍體細(xì)胞系：如WI-38，美國從人的正常胚肺中分離的成纖維細(xì)胞?？蔁o限傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：采用病毒如SV40或某些化學(xué)試劑如甲基膽蒽處理二倍體細(xì)胞；直接從動(dòng)物的腫瘤組織中分離。如Namalwa,CHO,BHK-21等。經(jīng)融合和重組的工程細(xì)胞系：融合細(xì)胞、工程細(xì)胞等。許多國家有專門細(xì)胞保存機(jī)構(gòu)26二、細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)條件器材洗清滅菌、水質(zhì)、酸堿性、滲透壓、溫度、空氣培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等。合成培養(yǎng)基：BME、MEM、DMEM、HAMF12和RPMI1640等。包含氨基酸、維生素、激素、脂肪酸、無機(jī)鹽及其它成份培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、懸浮-貼壁培養(yǎng)等27細(xì)胞培養(yǎng)過程28小型細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器29三、動(dòng)物細(xì)胞藥物細(xì)胞因子類藥物：一組不同種類的調(diào)節(jié)糖蛋白。擔(dān)任細(xì)胞間的化學(xué)傳感器，通過與細(xì)胞表面特定受體結(jié)合來產(chǎn)生作用，從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)。激素類藥物：由機(jī)體的特殊腺體合成和釋放，通過循環(huán)系統(tǒng)，作用于靶細(xì)胞的微量化學(xué)信息分子。酶類藥物：來源動(dòng)物細(xì)胞的治療用酶30細(xì)胞因子的主要類型31細(xì)胞因子產(chǎn)生途徑32干擾素33獸用與醫(yī)用性腺激素34胰島素35第三節(jié)抗體制藥36一、單克隆抗體免疫特異性免疫:細(xì)胞免疫和體液免疫非特異性免疫:宿主的屏障、吞噬細(xì)胞、抗菌物質(zhì)、炎癥反應(yīng)37抗體抗體是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受到抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。38抗體分子的結(jié)構(gòu)是由二硫鍵連接起來的約4條多肽鏈。長的一對稱為重鏈，短的一對稱為輕鏈。氨基端輕鏈的一半與重鏈的四分之一的氨基酸組成及排列順序多變，稱為可變區(qū)，羧基端輕鏈的一半和重鏈的四分之三氨基酸的組成和排列順序比較恒定，稱為恒定區(qū)。可變區(qū)中，某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性，是抗體分子和抗原分子發(fā)生特異性結(jié)合的關(guān)鍵部位，稱為互補(bǔ)決定區(qū)，決定了免疫球蛋白分子的異種抗原性。39抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)40多克隆抗體由于病原微生物是具有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，產(chǎn)生的抗體是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體，即針對多種抗原決定簇的抗體。它們在應(yīng)用過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異性交叉反應(yīng)。41單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。42全世界研制成的對病毒、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞及各種組織細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸的單克隆抗體有上萬種，在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)及醫(yī)藥工業(yè)的許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。單抗制品的銷售量也不斷增加，成為生物制品的主要來源之一。單克隆抗體的應(yīng)用431、用于臨床診斷

單克隆抗體檢測法，具有特異性高、快速、簡便、靈敏等多種優(yōu)點(diǎn)，因此首先被用來作臨床診斷試劑。在體外測定病人血、尿或分泌物中各種特殊蛋白質(zhì)的含量，以判斷機(jī)體是否有病、檢測治療效果等。最早用于商品的單抗是妊娠診斷試劑。檢測一些受細(xì)菌感染血清的診斷試劑、性病以及腫瘤表面抗原一些受細(xì)菌感染血清的診斷試劑、性病以及腫瘤表面抗原的診斷試劑，我國已研制出包括乙肝表面抗原、流行性出血熱等在內(nèi)的幾十種單抗診斷試劑。442、治療試劑

1983年，美國首次報(bào)導(dǎo)一例化療和放療均證明無效的淋巴瘤患者在使用單抗治療后得到痊愈，使單抗作為治療試劑受到了矚目的重視。所謂的“生物導(dǎo)彈”：以抗體或抗體分子中的抗原結(jié)合部分為載體，將毒素偶聯(lián)在這種“載體”上，這種分子只與發(fā)生癌變的組織或細(xì)胞結(jié)合，因而它所攜帶的毒素集中在癌變組織，從而達(dá)到特異性殺傷腫瘤的作用。45鼠源性單克隆抗體的改造

目前制備的單克隆抗體都是鼠源性的，大量應(yīng)用與人體時(shí)可產(chǎn)生人抗鼠抗體，使其作用和效果都受到嚴(yán)重影響，甚至有毒副作用。

改造鼠源性單克隆抗體的目的有兩個(gè)：一是降低免疫原性，二是降低相對分子量，增加組織穿透能力。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。

46人-鼠嵌合抗體

抗體同抗原結(jié)合的功能取決于抗體分子的可變區(qū)，同種性免疫原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)。人-鼠嵌合抗體：鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)基因和人免疫球蛋白的穩(wěn)定區(qū)基因連接起來，在共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就可表達(dá)出完整的人-鼠嵌合抗體。47嵌合抗體48改形抗體

用鼠源性單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)序列替換人免疫球蛋白分子中的互補(bǔ)決定區(qū)序列，可使人的免疫球蛋白分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。由于抗體分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。最大問題是抗體的親和力下降，甚至喪失活性。

49小分子抗體

基因工程的小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)，其相對分子量僅為原抗體的八十分之一到三分之一。正在研制：1、Fab片段抗體，由完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)加部分恒定區(qū)；2、FV抗體，有重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成；3、單鏈抗體，由重鏈和輕鏈的可變區(qū)通過一段連接肽連接而成的重組蛋白；4、單域抗體，由重鏈的或輕鏈的單個(gè)可變區(qū)組成；5、最小識(shí)別單位，由互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)成。50二、雜交瘤技術(shù)B淋巴細(xì)胞:分泌特異系性抗體，無法在體外進(jìn)行繁殖和傳代骨髓瘤細(xì)胞：體外具有很強(qiáng)的繁殖能力雜交瘤細(xì)胞：壽命長，單克隆抗體聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體51（一）雜交瘤技術(shù)的基本原理1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡—短命細(xì)胞52骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株—沒有抗體分泌物。53脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)細(xì)胞融合54脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長期存活不能長期存活雜交瘤細(xì)胞的篩選55HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA56H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)次黃嘌呤核苷酸尿嘧啶核苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)外源性途徑(旁路途徑)HAT培養(yǎng)基篩選57HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；骨髓瘤細(xì)胞：DNA合成的主要途徑被A阻斷，HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻。不能生長，5~7天死亡；

雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖，利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力58篩選

AA型、BB型AB型雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞（二）雜交瘤的制備591.免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物品系和骨髓瘤細(xì)胞在種系發(fā)生上距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，所以一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。常用的骨髓瘤品系來自BALB/c小鼠和Lou大鼠。

免疫方法有體內(nèi)和體外免疫法。

動(dòng)物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重60細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫方法61第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原+不加佐劑第4次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)常規(guī)免疫62體內(nèi)免疫體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多的情況下，由靜脈直接注入抗原，在B淋巴細(xì)胞受到可靠的最大限度的刺激后，迅速增殖、分裂，當(dāng)增殖率最高時(shí)收集B淋巴細(xì)胞。63體外免疫體外免疫法適用與抗原的免疫原性弱、能引起免疫抑制時(shí)采用。優(yōu)點(diǎn)。所需抗原少、免疫期短，干擾因素少，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤不夠穩(wěn)定。方法用4-8周齡的BALB/c小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)到0.5-5微克每毫升，在5%二氧化碳下，37℃培養(yǎng)4-5天，再分離脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

642.骨髓瘤細(xì)胞系不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈；HGPRT-或TK-；與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項(xiàng)：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中融合前兩周，要對骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行HAT培養(yǎng)基的敏感性篩選。65病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合電融合動(dòng)物細(xì)胞融合方法66用滅活的病毒誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面（誘導(dǎo)）細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）673.融合用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備：融合率高、自身不分泌抗體、所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定。

融合方法：最佳范圍濃度40%-50%，分子量4000。為提高融合率可加入二甲基亞砜，以提高細(xì)胞接觸的緊密性。但由于二者都對細(xì)胞有毒性，要嚴(yán)格控制作用時(shí)間和用量。

SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入（2min）,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個(gè)。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液68融合結(jié)果產(chǎn)生了脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合細(xì)胞。為獲得目的細(xì)胞將融合后的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基中，常用HAT培養(yǎng)基。氨基喋呤能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細(xì)胞和瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后也會(huì)死亡，而雜交瘤細(xì)胞則可以存活。69培養(yǎng)方法將融合的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，加入到96孔板內(nèi)，根據(jù)情況2-3天換液一次，每次吸去二分之一到三分之二培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。7-14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。因?yàn)殡s交瘤數(shù)量很少，多半不易存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖70飼養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖常用腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中MQ還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化71要求：簡便、快速、敏感;

在短時(shí)間內(nèi)能檢測大量樣品常用方法酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)4.雜交瘤培養(yǎng)物的鑒定72篩選出來的陽性克隆可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞，剛?cè)诤系募?xì)胞不穩(wěn)定，因此應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化?？寺『蟮募?xì)胞群生物學(xué)特性完全相同。融合后的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過三次克隆化才能達(dá)到100%的陽性克隆常用方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。735.單克隆抗體的純化

先明確單克隆抗體的免疫球蛋白的類和亞類，并根據(jù)用途綜合選定純化方法。用于體外診斷試劑，IgG采用沉淀處理結(jié)合親和層析。體內(nèi)診斷試劑或治療用藥，應(yīng)去除內(nèi)毒素、核酸、病毒等微量的污染，必須經(jīng)親和層析和陰離子交換層析。

74體內(nèi)誘生的單克隆抗體的純化1、澄清和沉淀處理：先低速離心5min，去除沉淀；再高速離心30min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；再用0.2微米的微孔濾膜過濾，除去污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)，用飽和硫酸銨沉淀抗體。2、分離：凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析。

756.出現(xiàn)的問題1）.細(xì)菌污染常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液

pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效762）真菌污染真菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，抗真菌制劑對預(yù)防和排除真菌污染有效。773）支原體污染：培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長。支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。用卡那霉素預(yù)防支原體污染有效。4）雜交細(xì)胞停止分泌抗體5）克隆化困難78三、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)及單克隆抗體的生產(chǎn)常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：1.體外培養(yǎng)法：懸浮培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)、滾瓶培養(yǎng)和微囊化培養(yǎng)。單抗含量不高。

2.體內(nèi)培養(yǎng)法：

采用BALB/c小鼠，在接種前1-2周，先給小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液體石蠟），然后接種1*106雜交瘤細(xì)胞，待生成腹水后再抽取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。每毫升腹水單抗含量有1-25mg79第四節(jié)植物細(xì)胞工程制藥植物細(xì)胞的全能性：發(fā)育全能性、物質(zhì)代謝全能性細(xì)胞與組織及其培養(yǎng)固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖藥用植物試管苗利用離體細(xì)胞大量生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)反應(yīng)器發(fā)酵技術(shù)一、植物組織培養(yǎng)

二、植物體細(xì)胞雜交（植物體細(xì)胞融合）80定義：在無菌條件下，利用人工培養(yǎng)基對植物組織、細(xì)胞所進(jìn)行的培養(yǎng)，包括原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官等的培養(yǎng)。一、植物組織培養(yǎng)81

組織培養(yǎng)流程組培設(shè)施的準(zhǔn)備培養(yǎng)基的選擇及配置滅菌接種及培養(yǎng)

試管苗馴化移栽82組培設(shè)備83培養(yǎng)基無機(jī)營養(yǎng)成分

就是人們平常所說的礦物質(zhì)、無機(jī)鹽或無機(jī)元素。它包括大量元素（N、P、K、Mg、S、Ca）及微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等