第五章分子生物學(xué)研究法(上)1

分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)

第五章

扉頁：當(dāng)你進(jìn)入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當(dāng)你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀”，否則，你就不可能走在別人的前面?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它生命科學(xué)技術(shù)的根本特征。重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的三大里程碑：一、20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。圖1-1DNA是“轉(zhuǎn)化源”二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。GeneralizedmodelofsemiconservativereplicationofDNA.Newsynthesisisshowninblue.三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。Crick于1958年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律（即中心法則）。中心法則的演變1958年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀(jì)后修正的“中心法則”上個世紀(jì)中下葉以來，現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展源自工具酶的發(fā)現(xiàn)。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。

圖5-1幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端。WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs.圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體

PvuⅡRE切割隨機(jī)DNA分子（假定4種堿基在DNA中均勻分布）的概率由該酶所識別的堿基數(shù)目按照4n

來計算，如一個6堿基切割酶平均每4096bp核DNA有一個酶切位點（46），而一個4堿基切割酶平均每256bp核DNA就有一個酶切位點（44）。重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實驗或用來進(jìn)行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3‘末端加上多聚或單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈末端的磷酸基團(tuán)

（二）基因克隆的載體載體三要素：自我復(fù)制能力攜帶外源基因片段大小插入位點多少易于鑒定識別程度大腸桿菌質(zhì)粒載體:1、pSC101質(zhì)粒載體長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點，在HindIII、BamHI和SalI等3個位點插入外源基因，會導(dǎo)致tetr失活。大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體示意圖。是第一個基因克隆載體。缺點：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，平均每個寄主細(xì)胞僅有1~2個拷貝，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101DNA，產(chǎn)量很低。2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長也隨之停止。松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時，使每個寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到1000~3000個，占細(xì)胞總DNA的50%左右。3、pBR322質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點（ori）。AmpR優(yōu)點是具有較小的分子量(4363bp)，易于純化。即使攜帶了6-8kb的外源DNA片段，操作仍較便利。有兩種抗生素抗性基因作為轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，每個細(xì)胞可累積1000~3000個拷貝，便于制備重組體DNA。獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程將其重新導(dǎo)入到寄主細(xì)胞中，才能保證重組DNA分子的增殖（圖5-3）。

圖5-3重組DNA操作過程示意圖

4、其它常見的質(zhì)粒載體5.2DNA操作技術(shù)5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理條件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在生理條件下，DNA電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。表5-3瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1圖5-4溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠對核酸分子進(jìn)行染色，紫外光下發(fā)熒光。每條DNA帶中僅含0.05μg微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。加標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAMarker,測定分子量加標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，測定濃度圖5-4DNA脈沖電場凝膠電泳示意圖5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。外源DNA通過自身載體上的復(fù)制起始點進(jìn)行復(fù)制增殖，能在宿主細(xì)胞中長期保存下來，并能以完整的形式從細(xì)胞中被分離純化出來。細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。圖5-5細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選

為提高效率，可對受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcells）。CaCl2法將快速生長期大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到5×106~2×107個轉(zhuǎn)化子/μg超螺旋質(zhì)粒DNA。

電擊法電脈沖可以在細(xì)胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。將生長至對數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電極杯中進(jìn)行電擊。獲得最大轉(zhuǎn)化效率時場強(qiáng)一般為12.5~15kV/cm，時間跨度一般為4.5~5.5毫秒。電擊轉(zhuǎn)化與溫度有關(guān)，一般在0~4℃進(jìn)行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

5.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是快速擴(kuò)增DNA序列最常用的方法。PCR反應(yīng)的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。圖5-7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)圖5-8PCR指數(shù)擴(kuò)增時循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較1989年12月，著名的自然科學(xué)雜志“SCIENCE”將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。主編DanielKoshlandJr.寫道：第一篇有關(guān)PCR的論文發(fā)表于1985年。自那以后，PCR已經(jīng)發(fā)展成為日益強(qiáng)大的和有廣泛用途的技術(shù)?！辛薖CR，極少量遺傳物質(zhì)也能擴(kuò)增產(chǎn)生大量一般實驗室都能得到的、可用于生化分析和鑒定的材料。PCR技術(shù)的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸和實驗中提供的引物序列合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。

DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結(jié)合（退火）

DNA合成（鏈的延伸）三步。經(jīng)不斷重復(fù)循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n,實得1.8n.將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。94℃加熱，淬火降低反應(yīng)溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。TherewasatimewhentoamplifyDNA,從前你要擴(kuò)增DNA，

Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.總有培養(yǎng)大批細(xì)胞的重任要你背。

ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,這時有個家伙叫KaryMullis博士的，

Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.他鉆出來說體外合成也一樣OK！

Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,只要把你的模板混上緩沖液，再加些引物，

Nucleotidesandpolymerases,too.還有核苷和聚合酶。

Denaturing,annealing,andextending.變性，退火，和延伸。

Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.加熱~冷卻~加熱~太神奇了！

PCR,whenyouneedtodetectmutations.當(dāng)你想要檢測突變，來啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtorecombine.當(dāng)你想要基因重組，來啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.當(dāng)你想知道孩子他爹到底是誰，來啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtosolveacrime當(dāng)你想要偵破大案，來啊做PCR吧！5.2.4實時定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準(zhǔn)確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過程中的累積速率動態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產(chǎn)物豐度時變異系數(shù)較大的問題?；旌显赑CR反應(yīng)液中的熒光探針只有與大片段DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長520nm。SYBRGreenI作探針的實時定量PCR實驗過程圖示用實時定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對表達(dá)量A擴(kuò)增曲線循環(huán)數(shù)熒光強(qiáng)度Log值循環(huán)數(shù)B標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過設(shè)定閾值時，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中待檢測靶DNA的絕對含量。

為確保熒光檢測的確實是靶DNA，又設(shè)計了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針。TaqMan探針是