RNA的提取和鑒定

RNA的提取和鑒定一．背景知識(shí)

核糖核酸(RiboNucleicAcid，簡(jiǎn)稱(chēng)RNA)是由至少幾十個(gè)核糖核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接而成的一類(lèi)核酸,因含核糖而得名,簡(jiǎn)稱(chēng)RNA。中心法則（thecentraldogma)ReversetranscriptionRNArRNAmRNAtRNA蛋白質(zhì)合成模板核糖體體組成成分轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸hnRNAsnRNAsnoRNAscRNA不均一核RNA，成熟mRNA前體核內(nèi)小RNA，參與hnRNA剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)核仁小RNA，rRNA加工核修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分RNA提取的目的：1)完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。2)臨床診斷中的應(yīng)用：病毒檢測(cè)等RNA提取的基本原理和步驟破碎細(xì)胞去除大分子雜質(zhì)去除蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA等沉淀RNA同時(shí)去除鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑進(jìn)一步純化RNARNA提取的基本原則總原則1.保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性2.盡量排除其他成分的污染及時(shí)處理樣本，或置液氮中保存試驗(yàn)器皿及配置試劑用水用0.1%DEPC處理且高壓消毒盡可能早的去除組織與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聯(lián)合使用RNase抑制劑操作過(guò)程中，戴手套口罩，避免空氣流通進(jìn)行完整性的檢測(cè)如何盡量避免RNA的降解？技術(shù)路線/基本原理：RNA的釋放RNA的分離、沉淀RNA的洗滌、純化機(jī)械剪切力或變性劑75%乙醇洗滌、親和層析柱純化鹽類(lèi)+有機(jī)溶劑RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑：1)提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)該方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。2)在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相，而達(dá)到分離RNA的目的。根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類(lèi)不一樣分為以下兩種制備方法：1）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍2）LiCl/尿素法以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。本來(lái)Trizol是一個(gè)專(zhuān)利的品牌，最早是MRC實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家發(fā)明的方法，后來(lái)把專(zhuān)利賣(mài)給了Invitrogen/Gibco，Invitrogen/Gibco將此方法推廣到世界,目前使用甚廣。Trizol（異硫氰酸胍-苯酚法）由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的單相的快速抽提試劑可在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNATrizol可以從最少100個(gè)細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。如果細(xì)胞量過(guò)少或組織來(lái)源特異，可以采用相應(yīng)試劑盒提取RNA。Trizol（異硫氰酸胍-苯酚法）異硫氰酸，β-巰基乙醇，SDS裂解細(xì)胞酸性條件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，離心，蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相，而RNA存在于水相異丙醇沉淀水相中的RNATrizol法的原理可在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性Trizol法提取RNA操作步驟1、剪碎的鼠肝中加入Trizol試劑，進(jìn)行機(jī)械勻漿，取1mlTrizol

勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5分鐘，以充分裂解細(xì)胞。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。目的：變性劑充分作用裂解細(xì)胞，釋放核酸。2、每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。3、4℃12,000rpm離心15min。4、吸取上層水相，至另一離心管中。注：不要吸取中間界面。目的：分離RNA、DNA、蛋白質(zhì)等。酚對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，為什么還要加入氯仿？酚有一定的水溶性，單獨(dú)用酚抽提會(huì)有酚溶解到水相中，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。氯仿是強(qiáng)有機(jī)溶劑，加速有機(jī)相與水相分層，去除核酸水溶液中殘余的酚

5、加入0.5ml異丙醇混勻，室溫放置5-10min。6、4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。目的：沉淀RNA異丙醇會(huì)奪取大量RNA分子間的水分子，因此RNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀7、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。（此時(shí)可放-70℃保存）

目的：洗滌RNA，去除殘余的鹽類(lèi)等雜質(zhì)。9、短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。

10、用200ul(體積可根據(jù)RNA的沉淀量具體調(diào)整)DEPC處理的H2O溶解RNA樣品，溶解后立即置于冰上。注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。8、4℃10000rpm離心5min，盡量棄上清。剪碎的鼠肝中加入Trizol試劑，進(jìn)行機(jī)械勻漿，取1mlTrizol

勻漿液于1.5ml離心管內(nèi)，室溫放置5分鐘，以充分裂解細(xì)胞。每管加入200ul氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min；12,000g離心15min。小心吸取上層水相，至另一滅菌、無(wú)RNase的離心管中；加0.5ml異丙醇混勻，室溫放置5-10min；12,000g離心10min，棄上清，可見(jiàn)RNA沉于管底；加1ml75%乙醇（DEPC處理的H2O配制），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀（此時(shí)可放-70℃保存）。8,000g離心5min，盡量棄上清。短暫離心收集管壁液體并吸棄。室溫晾干2-3min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。用200ul（體積可根據(jù)RNA的沉淀量具體調(diào)整）DEPC處理的H2O溶解RNA樣品，溶解后立即置于冰上。測(cè)定RNA的濃度、純度及質(zhì)量。安全！簡(jiǎn)易TBE電泳觀察RNA的完整度1）制膠：瓊脂糖凝膠粉（0.7%），消毒TBE緩沖液，Goldview顯色劑2）上樣：10ul樣品（含上樣緩沖液）混勻后，加入凝膠孔中；上樣緩沖液（loadingBuffer):溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、蔗糖，甘油3）電泳：電泳110V，15min。4）紫外燈下觀察OD260/OD280值：1)取2ulRNA溶液用，（H2O(DEPC)作為空白對(duì)照），紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。2)RNA濃度(ug/ml)=OD260×40

方法一、檢測(cè)RNA溶液的吸光度

260、320、230、280nm的吸光度分別代表核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質(zhì)的水平純的RNA，230：260：280＝1：2：1一般OD260/OD280=1.8~2時(shí)，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了RNA濃度=OD260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)RNA質(zhì)量及純度的分析

方法二、RNA的電泳圖譜

檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28