酶與蛋白質(zhì)工程第9章固定化酶與固定化細胞

第九講固定化酶與固定化細胞固定化酶(ImmobilizedEnzyme）

20世紀60年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性酶。這些水溶性酶催化結(jié)束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的進一步發(fā)展

60年代后，在酶學研究領(lǐng)域內(nèi)涌現(xiàn)出固定化酶。通過物理的或化學的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚甘`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱從60年代起，固定化酶的研究發(fā)展很快，起初人們把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近來，不但固定化方法和載體開發(fā)有了長足發(fā)展，并且已轉(zhuǎn)向它在工業(yè)、醫(yī)藥、化學分析、親和層析、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面的應用研究固定化酶固定化酶與水溶性酶比較具有以下優(yōu)點：(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝(2)可以在較長時間內(nèi)反復使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化(3)酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性(5)較能適應于多酶反應(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低固定化酶

固定化酶也存在一些缺點：(1)酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大(2)比較適應水溶性底物和小分子底物(3)與完整細胞比較，不適于多酶反應，特別是需要輔因子的反應。同時，對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后才能固定化

固定化酶酶的固定化方法吸附法；共價結(jié)合法；交聯(lián)法；包埋法固定化酶吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法

物理吸附法:通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，制成固定化酶

①有機載體，纖維素、骨膠原、淀粉等

如，用纖維素作為吸附劑吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶。吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2②無機載體，氧化鉛、高嶺土、多孔硅、多孔玻璃等

如，用多孔硅為載體吸附淀粉酶，在45℃進行固定化，用高濃度底物進行連續(xù)反應。無機載體的吸附容量較低、而且酶容易脫落固定化酶(2)離子交換吸附法:將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達到固定化的一種方法酶吸附較牢，在工業(yè)上具廣泛用途常用載體：①陰離子交換劑，二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類（ECTEDLA）-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠②陽離子交換劑，羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽固定化酶通過酶蛋白化學修飾增加蛋白質(zhì)分子上電荷，能有效的克服吸附法制備的固定化酶在使用過程的解吸如，用乙烯-順丁烯二酸酐共聚物共價修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用DEAE-纖維素載體有效固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附此外，酶的吸附與解吸還與介質(zhì)中離子強度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度及酶和載體的特性相關(guān)

pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶的吸附。在等電點兩側(cè)(±1-2pH單位)吸附將明顯減少

鹽可以促進蛋白質(zhì)的吸附，即所謂鹽析吸附

對蛋白質(zhì)吸附來說，隨溫度的升高吸附下降

載體的表面積、多孔性及其預處理都影響對酶的吸附固定化酶

吸附法制備固定化酶操作簡單，可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過程可以同時純化酶，固定化酶在使用過程失活后可重新活化，同時，載體可以回收再利用但由于有些機理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系不可預見性大，同時由于吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作為穩(wěn)定性固定化酶交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶與載體間進行交聯(lián)反應，以制備固定化酶的方法最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，用戊二醛交聯(lián)制備固定化酶的反應如下：固定化酶交聯(lián)方法：(1)交聯(lián)酶法在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶如：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白濃度、2.3％戊二醛、pH5.2-7.2、0℃下交聯(lián)24h，可形成固定化酶這種方法也用于制備交聯(lián)的結(jié)晶酶。交聯(lián)結(jié)晶酶仍具有一定酶活力如：將500mg酶溶于5m10.2mol/L醋酸緩沖液中，在攪拌下滴加2m12.5％戊二醛，在室溫下放置10-30min，會有沉淀析出，1-3h內(nèi)反應結(jié)束。形成的凝膠切碎后水洗，除多余戊二醛，即為固定化酶固定化酶(2)載體交聯(lián)法

用多或雙功能試劑的一部分功能基團與載體交聯(lián)，另一部分功能基團與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法

單用戊二醛等試劑交聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果固定化酶共價結(jié)合法

酶蛋白側(cè)鏈基團和載體表面功能基團之間形成共價鍵而固定的方法其優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落，但反應條件較激烈，酶易失活，同時，制作手續(xù)亦較繁瑣酶分子和載體連接的功能基團

從理論上講，酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團有以下幾種：①

酶蛋白N-端的氨基或賴氨酸殘基氨基②

酶蛋白C-端的羧基以及Asp殘基和Glu殘基的羧基③

Cys殘基的巰基④

Ser、Tyr、Thr殘基的羥基⑤

Phe和Tyr殘基的苯環(huán)⑥

His殘基的咪唑基⑦

Trp殘基的吲哚基固定化酶在實際中偶聯(lián)最普遍的基團是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯(lián)的基團還應是酶活性的非必需基團，否則將導致酶失去活性(2)載體的選擇

載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對載體的一般要求是:①一般親水載體在蛋白質(zhì)結(jié)合量和固定化酶活力及其穩(wěn)定性上都優(yōu)于疏水載體②載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機械強度③載體必須有在溫和條件與酶共價結(jié)合的功能基團④載體沒有或很少有非專一性吸附⑤載體來源容易，并能反復使用(3)偶聯(lián)反應

酶和載體的連接反應取決于載體上的功能基團和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團，而且是在十分溫和的pH、中等離子強度和較低溫的緩沖液中進行現(xiàn)已有多種偶聯(lián)反應能制備固定化酶。這些方法在實際運用中經(jīng)濟意義起著決定作用，必須考慮到酶的偶聯(lián)效率，固定化酶總活力，操作的簡便性以及載體與試劑的成本等因素固定化酶如，重氮法將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8-9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應，得到固定化酶固定化酶含醛基高聚物、多糖類，如淀粉、葡聚糖、纖維素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，形成含醛基(每一葡萄糖產(chǎn)生兩個醛基)高聚物，可與酶蛋白氨基反應，產(chǎn)生固定化酶固定化酶例如：用甘蔗渣纖維素衍生物固定化木瓜蛋白酶載體制備：60g甘蔗渣纖維素浸于500ml0.6％NaOH溶液中85℃處理30min，水洗至中性，抽干。懸浮于NaI04溶液中，空溫下攪拌12h，用水反復沖洗、抽干。置于IL尿素溶液中，攪拌。產(chǎn)物用水反復洗滌，抽干后，置于12％甲醛溶液中攪拌處理12h，用水洗滌，除去過量甲醛加酶固定:上述載體1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.20.1mol/L磷酸緩沖液配制)攪拌下4-8℃固定18h，用pH7.20.1mol/L磷酸緩沖液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即為固定化酶包埋法將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑(包括交聯(lián)劑)的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學反應，可以制得較高活力的固定化酶。對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都適用但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡，而對大分子底物不適宜。同時，凝膠網(wǎng)絡對物質(zhì)擴散的阻力導致固定化酶動力學行為的變化、活力降低包埋法常用凝膠包埋法和微囊化法固定化酶(1)凝膠包埋法

將酶分子包埋在凝膠格子中①聚丙烯酰胺凝膠包埋法一般的制備過程如下：將1ml溶于適當緩沖液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(單體)和40mgN，N’-甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的3ml溶液中，再加0.5ml15％的二甲氨基丙腈(加速劑)，同時，加入1％過硫酸銨(引發(fā)劑)，混合，于室溫保溫10min，便得含酶凝膠。將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒，于低溫儲存或冷凍干燥。為制得珠狀固定化酶，可以在聚合反應開始時，立即轉(zhuǎn)入到疏水相(一種乳化劑，與水相有相同密度)的有機溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠

聚丙烯酰胺包埋法的缺點：酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服固定化酶②輻射包埋法酶溶于純單體水溶液、單體加合物水溶液或純聚合物溶液中，在常溫或低溫下，用X-射線、Y-射線或電子束輻照，可得到包埋酶的親水凝膠如，用X-射線引發(fā)丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶1973年H．Maeda等用聚乙烯水溶液輻照包埋了多種酶運用弱水性或稍具疏水性的玻璃化載體，用低溫過冷態(tài)的輻照聚合，可用于一般生物物質(zhì)的固定化，這些生物物質(zhì)主要分布在載體表面層區(qū)域，固定化產(chǎn)物表面具有生物活性，長期使用后仍有較高的活性固定化酶(2)微囊化法

將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)酶存在于類似細胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性

小分子底物能通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴散而輸出微囊一般直徑約1～100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體積之比極大，物質(zhì)能很快達到平衡可用不同類型、不同濃度的酶、細胞提取物或細胞，不同組成和含量的膜包裹組建成人工細胞因此，此法在醫(yī)療上應用極為廣泛。例如，固定化天門冬酰胺酶(治療白血病)就是用這種方法制成的微膠囊固定化酶①界面沉淀法

利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成膜，從而將酶包埋的方法②界面聚合法

將疏水性和親水性單體在界面進行聚合形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中固定化酶微膠囊的制備方法③紅血球包埋法

在高滲溶液中紅細胞膨脹伸展后，細胞內(nèi)血紅蛋白漏出，同時胞外蛋白也能擴散進紅血球，再放進等滲溶液中，紅血球膜又回復至正常狀態(tài)和透性，進入的酶不會漏出④脂質(zhì)體包埋法

采用雙層脂質(zhì)體形成極細球粒包埋酶固定化酶的性質(zhì)固定化酶活力

與溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)變化；酶活性中心重要氨基酸殘基與載體相結(jié)合；載體與酶結(jié)合后，酶雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻，從而使活力下降在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定過程中有變性所致活力回收和相對活力

酶固定化一般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分數(shù)稱為活力回收固定化酶固定化酶活力測定

基本上與溶液酶相似，也以反應初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物量或形成1μmol產(chǎn)物的酶量為一個單位(μmol/mg·min)，對于酶管、酶膜、酶板等，則以單位面積（cm2）的初速度來表示固定化酶固定化酶的穩(wěn)定性大多數(shù)酶在固定化后都不同程度提高了穩(wěn)定性，延長了有效壽命

固定化增加酶構(gòu)象的牢固程度

阻擋不利因素對酶的侵襲限制了酶分子間的相互作用但如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導致酶穩(wěn)定性下降熱穩(wěn)定性

大多數(shù)酶在固定化后與溶液酶相比，有較高熱穩(wěn)定性，這種性質(zhì)對工業(yè)上的應用有益如，氨基?；?，溶液酶在75℃保溫15min，活力為0；DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80％；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60％活力。CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5-15℃其他，如固定化乳酸脫氫酶、脲酶等都比溶液酶的熱穩(wěn)定性提高固定化酶pH-酶活力關(guān)系

反應的最適pH和pH-酶活力曲線的變動依據(jù)酶蛋白和載體的電荷而定。帶負電荷的載體，往往導致固定化酶的最適pH向堿性方向移動；帶正電荷的載體則相反盡管大多數(shù)固定化酶的活力-pH關(guān)系曲線仍為鐘形曲線，但與溶液酶比較，其鐘形更陡，或更坦，向酸性或堿性方向偏移對蛋白酶的抵抗能力

溶液酶經(jīng)固定化后提高了對蛋白酶的抵抗能力如：氨基?；冈谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20％，而將其固定于DEAE-纖維素上在同樣條件下仍有80％的活力可能是因為蛋白酶分子量大，受到空間位阻，不能進入固定化酶中固定化酶對變性劑、抑制劑的抵抗能力

酶經(jīng)固定化后，提高了對蛋白質(zhì)變性劑和抑制劑的抵抗能力如，氨基?；概c固定于DEAE-Sephadex的氨基?；副容^，前者在6mol、2mol胍、1％SDS和4mmol丙酮溶液中活力分別為9％、49％、1％和55％，而后者在相應溶液中活力則分別為146％、117％、35％和138％操作穩(wěn)定性固定化酶在操作中可以長期使用，半衰期（t1/2，即酶活性達到原有酶活性一半時所需的時間）較長貯藏穩(wěn)定性

大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在4℃下，120天酶活力無變化固定化酶固定化細胞固定化細胞是在固定化酶的基礎上發(fā)展起來的優(yōu)點:(1)省去了酶的分離程序(2)細胞生長快、多、反應快(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離細胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗(4)保持酶在細胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子抵抗力增加固定化細胞缺點：(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度(2)必須防止細胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成(3)細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散微生物細胞的固定化方法

菌體細胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法等包埋法包埋法是制備固定化細胞最常用的方法將產(chǎn)酶菌株用包埋劑，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、瓊脂、海藻酸、膠原、明膠和戊二醛等包埋起來，發(fā)揮酶或酶系的作用如，1977年我國投入生產(chǎn)的固定化青霉素酰胺酶，是使用明膠、戊二醛包埋大腸桿茵而成美國、歐洲和日本等大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿的工藝多數(shù)采用固定化菌體的酶柱工藝固定化細胞固定化細胞(2)

吸附法分物理吸附法和離子交換吸附法

①物理吸附法

物理吸附法是將微生物細胞附著于固體載體上的一種固定方法。載體常用的多孔磚、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纖維等如，將酵母用聚氯乙烯或多孔磚固定化，每克載體可以固定80mg酵母；也可將固定化的釀酒酵母，裝入反應柱，以生產(chǎn)乙醇，乙醇可達120g/L。在環(huán)境保護中用木片、石礫等固定微生物細胞作為污水處理的過濾器物理吸附法載體與微生物細胞間不起反應，吸附量大，但細胞極容易脫落而流失固定化細胞②離子交換吸附法

利用離子交換吸附細胞常用的載體是離子交換樹脂例如，利用陰離子交換樹脂吸附放線菌含葡萄糖異構(gòu)酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用離子交換纖維素吸附無色桿菌(含頭孢霉素酰化酶菌株)；用離子交換纖維素吸附米曲霉含轉(zhuǎn)化酶菌株等獲得成功這種方法制備的固定化細胞，細胞易脫落，需不斷補充新細胞固定化細胞動植物細胞固定化植物細胞固定化植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。80年代開始研究，目前一般采用包埋法和吸附法固定化細胞包埋法

將植物細胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中Brodelius等(1979)首次用海藻酸鈣包埋制備了固定化長春花細胞、毛地黃細胞、海巴戟細胞在Ca2+離子等多價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和陽離子之間形成離子鍵。因海藻酸鈣不溶于水，在細胞表面形成凝膠如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能使膠體溶解釋放出細胞當海藻酸鈣微囊用多聚賴氨酸處理后，使凝膠微球表面成膜，不會再被螯合劑溶解。再用檸檬酸去除鈣離子，球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài)，細胞懸浮在微囊內(nèi)海藻酸鹽—多聚賴氨酸微囊化固定化細胞植物細胞微囊化示意圖固定化細胞吸附法

將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi),或吸附于中空纖維外壁上如,將植物細胞定置在中空纖維的外壁與容器內(nèi)壁之間，培養(yǎng)液及O2在中空維管內(nèi)流動，透過中空纖維管壁(具半透膜性)，傳遞給附著于外壁的細胞，細胞代謝產(chǎn)物亦透過外壁隨管內(nèi)培養(yǎng)液流出。利用此法固定的豌豆細胞和胡蘿卜細胞進行生產(chǎn)多酚化合物的研究，可連續(xù)使用1個多月如,將洗凈、滅茵后的泡沫塑料放進辣椒細胞培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一段時間，細胞吸附于塑料孔洞內(nèi)，并能生長繁殖固定化細胞動物細胞固定化

動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。目前，動物細胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多吸附法

由于大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，在培養(yǎng)過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細胞主要載體及固定方法有：(1)轉(zhuǎn)瓶法

轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成。其表面經(jīng)一定處理而帶有電荷，如用高錳酸鉀等氧化劑，強酸、強堿或紫外輻射等表而處理，可使動物細胞附著于表面，轉(zhuǎn)瓶以一定旋轉(zhuǎn)速度進行培養(yǎng).若在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)增大表面積，可提高生產(chǎn)能力固定化細胞(2)微載體法微載體是指直徑為100-200um，相對密度接近于1.0的顆粒固定化載體。由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微載體具有較大的表面，對細胞生長和物質(zhì)傳遞特別有利，但強度不夠．易破碎，使用時間較短，已用于固定多種細胞。如用于生產(chǎn)干擾素、人纖溶酶原活化劑白細胞介素及各種疫苗的細胞固定化固定化細胞(3)中空纖維法中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。將細胞胞置于管外壁扣容器外殼之間，則細胞附著于外壁上，培養(yǎng)液從管內(nèi)流動，能透過管壁進行質(zhì)熱傳遞，中空纖維起著體內(nèi)微血管的作用，有利細胞生長及其新陳代謝。已有多種中空纖維固定化細胞用于生產(chǎn)各種單克降抗體和疫苗微載體培養(yǎng)

1967年，維爾茨（vanWezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng)將傳統(tǒng)的一維平面貼附擴展為三維立體貼附，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）的限制微載體使利用生物反應器進行動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足動物細胞的貼壁要求，又能充分利用生物反應器內(nèi)部空間固定化細胞微載體制作方法制作方法包括：高溫燒結(jié)法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、銳孔噴液冷凍凝固法固定化細胞1)選擇合適的微載體類型對細胞在不同微載體上的貼附性能進行評價，計算細胞貼壁率和細胞數(shù),并繪制成曲線,比較細胞容納量、微載體用量、攪拌速度,由此選出適當?shù)奈⑤d體2)浸泡水化及消毒在玻璃容器內(nèi)加入適量的微載體,加入無Ca2+、Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)浸泡3h以上,輕輕攪動。然后加入1/2的新鮮PBS再洗1次。高壓蒸汽滅菌3)接種根據(jù)細胞類型決定接種濃度。微載體的濃度一般按2-3g/L配制,攪拌速度控制在50-70r/min微載體培養(yǎng)基本流程固定化細胞4)培養(yǎng)觀察與細胞計數(shù)在顯微鏡下直接觀察微載體上細胞的生長情況，將微載體上的細胞消化后計數(shù)并計算其濃度5)傳代培養(yǎng)微載體上分離后的細胞可進一步做微載體傳代培養(yǎng)。如果放大培養(yǎng),可在細胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增加培養(yǎng)體積，也可在微載體長滿細胞后直接加入新的微載體進行球傳球接種6)細胞消化與收獲

通常采用酶消化法收獲細胞。對于回收率要求不高的細胞種類分組沉降簡單易行,而若要求高回收率,則可用過濾方法,采用100μm孔徑的尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、多孔玻璃濾器等將細胞與微載體分離開固定化細胞中空纖維生物反應器培養(yǎng)中空纖維生物反應器（hollowfiberbioreactor）是理查德·克瑞克（RichardKncazek）等在1972年發(fā)明的最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細胞也能在上面貼附生長固定化細胞柱狀中空纖