第八章基因工程

第八章基因工程第一節(jié)基因工程概述

遺傳工程廣義：細胞工程、蛋白質工程、基因工程、酶工程、發(fā)酵工程狹義：基因工程

→基因工程概述基因工程是20世紀70年代初隨著DNA重組技術的發(fā)展應運而生的一門新技術。

→1982年經(jīng)美國食品及藥物管理局批準，采用基因工程方法在細菌中表達生產(chǎn)的人的胰島素進入市場，成為基因工程產(chǎn)品直接造福于人類的首例?！?985年轉基因植物獲得成功。→1996年克隆羊誕生?！F(xiàn)在，人類已利用這一技術改造和創(chuàng)建新的生命形態(tài)、生產(chǎn)藥品、疫苗和食品，診斷和治療遺傳疾病。

基因工程的基本步驟：1.目的基因的分離或合成。2.將目的基因與載體DNA連接，構建重組DNA

分子-表達載體。3.將重組DNA分子導入受體細胞，并獲得具有外源基因的個體。4.轉基因生物的檢測與鑒定。5.轉基因生物的安全性評價。第二節(jié)基因的分離基因分離（克?。┌?個步驟：1.目標DNA片段（基因）的分離；2.目標基因克隆到載體上；3.載體導入宿主細胞并在其中大量復制。一、工具酶1、限制性內切核酸酶

限制酶：作用于特定（異）核苷酸序列的磷酸二脂酶。Ⅰ型酶：僅EcoB和EcoK兩種，催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能。Ⅱ型酶：基因工程中應用最廣泛。Ⅲ型酶：具有特異的識別位點，識別位點是

非對稱的。

Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特異識別和切割的序列部位；②DNA分子上兩個單鏈斷裂的部位通常不是直接相對的；③斷裂所形成的DNA片段常具有堿基互補的單鏈尾巴（粘性末端）；限制性內切酶EcoRI的酶切位點及酶切產(chǎn)物連接

回紋序列圖12-1通過用相同的限制性內切酶切割形成一個重組DNA分子

限制性內切酶SmaI的識別及酶切位點平齊末端2、DNA連接酶

DNA連接酶：重組DNA分子構建必不可少的工具酶，能催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來。3、反轉錄酶

一類以RNA為模板來指導DNA合成的DNA聚合酶，故又稱依賴于RNA的DNA聚合酶。4、聚合酶鏈式反應(PCR)

PCR是體外快速擴增DNA的方法,由美國的Mullis(1986)發(fā)明,1993年諾貝爾化學獎。PCR可對特定DNA片段進行擴增，且可用痕量DNA作模板，對DNA純度要求也不高,可在幾小時內使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝。PCR反應從啟動到結束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：1）變性：95℃，DNA

雙鏈分離成單鏈。2）退火(復性)：55℃

左右，引物與單鏈的模板DNA序列互補結合。3）延伸：72℃左右，Taq酶通過在引物的3’-OH端增加堿基的辦法使引物延伸。表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關系循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824二、載體

載體：將外源基因送入受體細胞的工具。載體類型：細菌質粒、噬菌體或病毒、細菌/酵母菌人工染色體BAC、YAC等。載體特點：①在宿主細胞中能獨立復制，即本身為復制子，有獨立的復制起始位點。②有限制酶切位點，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進行復制或擴增。③有選擇標記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細胞。④分子量小，多拷貝，易于操作。⑤載荷外源DNA的大小范圍要寬，安全。

（1）細菌質粒：廣泛應用于基因工程圖12-6質粒pUC18的結構及多克隆位點

（2）噬菌體載體1、噬菌體；

2、噬菌體DNA；

3、噬菌體DNA中間基因簇；4、將連接物體外包裝后感染細菌，制備基因庫（用于基因庫構建）（3）克隆大片段DNA的載體

黏粒載體：含有cos位點的質粒載體，兼有λ噬菌體的高效感染能力和質粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點?？寺⊥庠雌蔚拈L度在15-45kb之間。細菌人工染色體（BAC）上述的幾種載體都不能攜帶大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因長度在50kb以上。細菌人工染色體載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設計構建的基于F因子的人工載體。圖12-9細菌人工染色體載體pBAC108L及其多克隆位點?？刹迦脒_300kb左右的DNA片段。酵母人工染色體（YAC）YAC載體是基于酵母染色體結構設計的，可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成為人類基因組計劃（HGP）的一種重要工具。三、基因分離方法一個基因就是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段。包括：啟動子、終止子、內含子等。1、基于文庫的基因分離方法基因文庫(library)：是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因文庫中分離基因的流程為：（1）構建基因文庫

基因組文庫：使用與切割質粒相同的限制性內切酶，將供體生物體的基因組DNA切成許多片段，然后將其連接到載體上構成的一個重組DNA群體cDNA文庫：以mRNA為模板，在反轉錄酶作用下，合成cDNA，將其與適當載體連接并轉化到宿主細胞內進行擴增構建成的基因庫。（2）篩選基因庫

利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫。

圖12-10菌落雜交技術

（3）陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能得到目的基因序列測定、生物信息分析、功能預測、功能鑒定。2、T-DNA標簽克隆基因

利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲取目標基因或克隆。T-DNA載體構建轉化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體

產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側的植物DNA利用側翼DNA序列作探針從cDNA文庫中釣取基因

基因功能的驗證（遺傳互補測驗，分離的野生基因轉化突變體，回復功能）圖12-11T-DNA標簽克隆基因的基本原理

3、基于PCR的基因克隆

原理：根據(jù)待擴增基因的序列合成引物，使兩個引物序列之間的基因序列獲得大量擴增，產(chǎn)生大量的基因拷貝用于研究。

4、基因的人工合成對于已知核苷酸序列、分子量較小的基因可以通過化學合成法制備基因。一般先一段一段地合成，然后將這些小片段連接起來。人工合成基因可以由DNA自動合成儀來完成。第三節(jié)外源基因的導入一、重組DNA技術重組DNA：指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種

DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。重組DNA技術主要步驟：1)從細胞或組織獲得DNA并純化；2)用限制酶切割DNA；3)將所得限制片段連接到載體上,形成重組DNA分子；4)重組DNA導入宿主細胞，在宿主細胞內復制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子--克隆。5)克隆的DNA分子可以從宿主細胞中回收，純化；6)克隆的DNA可以轉錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)。重組DNA分子二、植物遺傳轉化方法1、農桿菌介導法（1）根癌農桿菌(Ti質粒)（2）發(fā)根農桿菌(Ri質粒)

Ti質粒及其衍生載體Ti質粒包括五個區(qū)域：LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中；質粒轉移區(qū)(PT)；3.冠癭堿代謝區(qū)；4.復制原點；5.毒性區(qū)(Vir)?！鶷-DNA區(qū)域內的所有基因與轉移無關，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內的序列轉移并整合到植物基因組。→Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉移。Ti質粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構建出Ti質粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細菌選擇標記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標記，pUC19的多克隆位點及α-互補顯色標記（2）共整合載體(integratedvectors)

圖12-15棉花轉基因植株生產(chǎn)過程F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體2、基因槍法基因槍法\生物彈法\微粒槍法\微粒轟擊法—金、鎢依賴高速的金屬微粒將外源基因導入活細胞的一種轉化技術。優(yōu)點：無宿主限制，可以對任何基因型材料進行轉化研究第四節(jié)轉基因生物的檢測與鑒定

一、分子檢測PCR：假陽性與假陰性

Southernblot：轉基因的完整性和拷貝數(shù)Northernblot：mRNAWesternblot：蛋白質二、性狀鑒定M12

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789第五節(jié)基因工程的應用及安全性評價一、基因工程的應用1、轉基因植物抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆的優(yōu)良品系或品種，很多已經(jīng)大面積種植推廣。2008年1.25億公頃：大豆、玉米、棉花、水稻、馬鈴薯、番茄等2、轉基因動物：羊、牛

3、基因工程工業(yè)

生產(chǎn)胰島素等

在細菌中產(chǎn)生胰島素的方法4、遺傳疾病診斷RFLP法（鐮刀性貧血?。?/p>

5、基因治療

利用基因工程技術，將特異基因導入并整合到具有遺傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病。基因治療的載體和重組DNA分子

6、環(huán)境保護生物修復，指利用生物吸收、降解、轉化環(huán)境中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的水平，或將有毒有害的污染物轉化