第六章 親和分離技術(shù)

第六章親和分離技術(shù)北京化工大學(xué)譚天偉教授第六章親和分離技術(shù)6.1親和萃取6.2親和沉淀6.3親和膜技術(shù)6.4分子印跡分離技術(shù)6.5親和反膠團萃取技術(shù)6.1親和萃取親和萃取簡介

親和配基高聚物的合成親和分配的影響因素和親和模型親和分配的應(yīng)用6.1.1

親和萃取簡介萃取是一種常見的生化分離技術(shù)，生化分離技術(shù)的萃取技術(shù)包括雙水相萃取、反膠團萃取等。親和萃取就是將親和層析的親和配基用于萃取分離中，包括親和雙水相和親和反膠團等。分離蛋白親和配基體系白蛋白脂肪酸PEG/dextran堿性磷酸化酶ProcionredHE-3GPEG/dextran,PEG/鹽共脂肪酶（Colipase）卵磷脂LecithinPEG/dextran脫氫酶，激酶活性染料PEG/dextran,PEG/鹽α-2-巨球細(xì)胞Cu2+PEG/dextranS-23骨髓瘤蛋白二硝基酚PEG/dextran3-氧代類固醇異構(gòu)酶雌甾二醇lPEG/dextran胰蛋白酶對氨基苯咪PEG/dextran親和萃取簡介常用的親和配基、雙水相體系和它們所對應(yīng)分離的物質(zhì)6.1.2

親和配基高聚物的合成親和雙水相中親和配基可固定在上相高聚物或下相高聚物上，甚至親和配既可以以游離狀態(tài)分配在體系中。一般配基固定在上相高聚物上，即將親和配基通過化學(xué)方法結(jié)合在PEG上。主要包括以下兩種:

PEG的活化親和配基直接反應(yīng)6.1.3

親和分配的影響因素和親和模型影響親和分配的影響因素包括普通雙水相的影響因素如PEG濃度，還有:

配基濃度配基載體

染料配基pH:增加，效率降低

溫度:升高，效率降低

鹽濃度鹽的種類添加鹽時的△logK占不添加鹽時的百分?jǐn)?shù)（％）25mM63mM250mM磷酸鈉（添加）100103——甲酸鈉，pH7————88醋酸鈉，pH71059781丙酸鈉，pH7————89Na2SO4988533KCl1048021Li2SO4——77——Tris，pH7——76——KI97691NaSCN——67——臨苯二甲酸鉀——48——NaClO4——42——親和分配的影響因素和親和模型鹽對分配系數(shù)的影響親和分配的影響因素和親和模型體系中的目標(biāo)蛋白質(zhì)被配基分子飽和時親和分配的影響因素和親和模型整個過程的自由能變可以列成如下算式ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1有N個結(jié)合位點的蛋白質(zhì)而言親和分配的影響因素和親和模型推導(dǎo)得目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點不被配基－聚合物飽和時6.1.4

親和分配的應(yīng)用乳酸脫氫酶（LHD）的親和分配6.1.4

親和分配的應(yīng)用葡萄糖-6-磷酸化脫氫酶（G6PDH）的純化6.1.4

親和分配的應(yīng)用葡萄糖-6-磷酸化脫氫酶（G6PDH）的純化6.2親和沉淀分離技術(shù)

親和沉淀的原理親和沉淀聚合物和親和配基

親和沉淀可逆性聚合物親和沉淀親和配基

親和沉淀的展望6.2.1

親和沉淀的原理親和沉淀的機理：加到含有目標(biāo)分子得溶液中配體的連接特異性結(jié)合目標(biāo)分子形成親和沉淀目標(biāo)分子解離親和沉淀原理圖親和沉淀(Affinityprecipitation)是將生物專一性識別與沉淀分離相結(jié)合的純化技術(shù)。親和沉淀的優(yōu)點溶液中進行，無擴散傳質(zhì)阻力和結(jié)合時的空間位阻，親和結(jié)合速度快，結(jié)合充分；親和配基裸露在溶液中，配基利用率高；利用成熟的離心或過濾技術(shù)回收沉淀，易于規(guī)模放大

親和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目標(biāo)產(chǎn)物的純化，可在分離操作的初期進行，這對目標(biāo)分子是極其有利的：因為粗料液中通常含有對目標(biāo)產(chǎn)物有害的雜質(zhì)（如蛋白酶）?？焖?、有效地將目標(biāo)產(chǎn)物分離出來，有利于提高產(chǎn)品的質(zhì)量和收率親和沉淀機理一次作用親和沉淀

(primary-effectprecipitation)

二次作用親和沉淀

(secondary-effectprecipitation)

親和沉淀的機理分為兩種一次作用親和沉淀水溶性化合物分子偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基，即雙配基(bis-ligand)和多配基(polyligand)通過與多價蛋白質(zhì)(multivalentprotein)支聯(lián)，在適當(dāng)?shù)臈l件下，形成較大的支聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而沉淀。一次作用親和沉淀作用機理與抗原－抗體的沉淀作用相似。存在著配基與蛋白質(zhì)的結(jié)合部位的最優(yōu)化使沉淀率最高。一次作用親和沉淀雖然簡單，但僅適用于多價、特別是4價以上的蛋白質(zhì)要求配基與目標(biāo)分子的親和結(jié)合常數(shù)較高沉淀條件難于掌握，并且沉淀的目標(biāo)分子與配基的分離需要凝膠過濾等難于大規(guī)模應(yīng)用的附加工具，實用上存在較大難度。另外，在一次作用親和沉淀這常用的多配基染料有配基自交聯(lián)(ligandself-assoliation)的現(xiàn)象，成為交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)形成的競爭機制，從而阻礙了沉淀的生成。所以人們更多是采用二次作用親和沉淀。一次作用親和沉淀二次作用親和沉淀制備親和沉淀介質(zhì):利用在物理場如pH、離子強度、溫度等改變時溶解度下降、發(fā)生可逆性沉淀的水溶性聚合物為載體固定親和配基。親和介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)分子后，通過改變物理場使介質(zhì)與目標(biāo)分子共同沉淀的方法稱為二次作用親和沉淀。

離心或過濾回收沉淀，即可除去未沉淀的雜蛋白。沉淀清洗后加入洗脫劑即可純化目標(biāo)產(chǎn)物。二次親和沉淀分離蛋白質(zhì)示意圖6.2.2親和沉淀聚合物和親和配基典型的親和沉淀有以下步驟：①親和沉淀介質(zhì)的制備②將親和沉淀介質(zhì)加入含有目標(biāo)蛋白質(zhì)或酶的粗液中③聚合物－親和配基－目標(biāo)蛋白的沉淀:通過降低聚合物的溶解度來實現(xiàn)聚合物發(fā)生可逆性沉淀的方法：

pH、溫度、離子強度的改變金屬離子的添加水溶性有機溶劑的添加等選用何種方法取決于使用的配基載體，有時幾種方法聯(lián)合使用典型的親和沉淀有以下步驟（續(xù)）：④離心或過濾使沉淀分離，使目標(biāo)蛋白就從雜蛋白中分離出來⑤目標(biāo)分子的解離：目前所采用的洗脫方式于親和層析所使用的方法大致相同，如改變pH值或離子強度來降低目標(biāo)成為與配基的親和作用力。⑥配基的回收：如果目標(biāo)蛋白的洗脫是在介質(zhì)與目標(biāo)蛋白復(fù)合物不溶的狀態(tài)下進行，配基可重新使用；否則，需要采取凝膠過濾等方法分離親和沉淀的有機聚合物，主要是可逆性沉淀聚合物即親和載體(affinitycarrier)或可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物SIS（SolubleandInsolublePolymers）溶解和非溶解狀態(tài)可隨環(huán)境參數(shù)如pH、溫度等的變化發(fā)生可逆變化，因此可用于酶或蛋白質(zhì)的親和沉淀?？赡嫘匀芙饩酆衔锟梢灾苯雍偷鞍踪|(zhì)結(jié)合發(fā)生親和沉淀，但有時需要將親和配基結(jié)在可逆性溶解聚合物上。親和沉淀可逆性聚合物二次親和沉淀選擇可逆性聚合物的原則：

包含活性基團，以便親和配基能夠結(jié)合；不能和親和配基強烈結(jié)合，以免配基不能和目標(biāo)分子作用；

在一定條件下可以發(fā)生明顯的可逆性的沉淀和溶解；

分子量分布窄；

可形成緊密的沉淀；易回收，有一定循環(huán)操作次數(shù)；廉價易得親和沉淀可逆性聚合物

(1)

天然的可逆性溶解聚合物目前所使用的天然親和配基載體主要是脫乙酰殼聚糖(chitosan)和藻酸鹽(alginate):Chitosan在pH低于6時是可溶性的，升高pH值則會發(fā)生沉淀藻酸鹽是D－甘露糖醛酸和L－葡萄糖醛酸的線性多聚物，在二價陽離子如Cu2+的存在下或pH低于2的條件下形成沉淀

Senstad和Mattiasson將大豆胰蛋白酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor,STI)共價偶聯(lián)到親和配基載體Chitosan上，制成親和沉淀介質(zhì)結(jié)合胰蛋白酶(trypsin)用0.1M的NaOH調(diào)節(jié)溶液PH值至8.5，介質(zhì)與胰蛋白酶一起沉淀，離心用0.1M的glycine-鹽酸緩沖液清洗，胰蛋白酶與配基STI解離（此時PH約2.5），胰蛋白酶收率為86％。研究表明，為了使沉淀更完全，應(yīng)適當(dāng)延長時間，因為親和作用進行很快，但沉淀步驟相對來說要緩慢得多。

(1)

天然的可逆性溶解聚合物(應(yīng)用pH敏感性)孫彥等人研制了含有共軛二炔結(jié)構(gòu)單元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂質(zhì)體(PolymerizedLiposome,PLS)。磷脂酰乙醇胺的水懸浮液在超聲波處理下形成0.1-0.2mm的球形液泡狀磷脂雙分子膜，即脂質(zhì)體(liposome)，表面為親水性乙醇胺基團。該脂質(zhì)體溶液在紫外線照射下可發(fā)生聚合反應(yīng)，形成聚合脂質(zhì)體，即PLS。向PLS溶液加入NaCl，當(dāng)NaCl濃度超過0.17mol/L時，在滲透壓作用下PLS發(fā)生快速完全的沉淀。離心回收沉淀后向其中加入水或低濃度鹽溶液，沉淀重新溶解。(2)

合成可逆性溶解聚合物(應(yīng)用離子強度敏感性)可逆沉淀性聚合物——

聚合脂質(zhì)體（polymerizedliposome,PLS）

PLS具有在鹽的作用下發(fā)生可逆性沉淀的性質(zhì)。將大豆胰蛋白酶抑制劑（STI〕共價偶聯(lián)PLS的表面，制成親和沉淀介質(zhì)STI－PLS。加入豬胰提取液中，用0.1M的NaCl沉淀，離心，并用0.01M的NaOH洗脫胰蛋白酶。結(jié)果表明，此法親和沉淀的胰蛋白酶收率在80％以上，純化倍數(shù)達到8，比活達到13000U/mg，接近純酶的水平。PLS的優(yōu)點是，在很寬的PH值范圍內(nèi)和有機溶解中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，經(jīng)配基修飾后具有很好的蛋白質(zhì)親和沉淀特性：蛋白質(zhì)吸附容量大，無非特異性吸附。(2)

合成可逆性溶解聚合物(應(yīng)用離子強度敏感性)可逆沉淀性聚合物

—聚丙烯酰胺親和配基載體EudragitS-100，它是甲基丙烯酸(methacrylicacid)和甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)的聚合物。EudragitS-100在PH低于5時發(fā)生可逆性沉淀；在(NH4)2SO4或PEG8000存在的情況下，沉淀發(fā)生的PH值相對高一些。Eudragit與親和配基染料CibucronBlue的復(fù)合物Eudragit-CibacronBlue在Ca2+存在的條件下，溫度達到40℃，在任何PH值范圍內(nèi)都會發(fā)生可逆性沉淀。這就擴大了Eudragit的應(yīng)用范圍，尤其是對那些在酸性條件容易變性的酶類。(2)

合成可逆性溶解聚合物親和沉淀的親和配基在很多情況下，親和沉淀時將親和配基固定在可逆性溶解聚合物上，親和沉淀的親和配基和親和層析的配基沒有太大差異，包括生物專一性配基如輔酶、蛋白質(zhì)A及非專一性親和配基如染料、金屬離子等。采用雙金屬離子螯和的雙功能試劑，將金屬離子固定在一些可以固定金屬離子的二聚物如poly-VI-VCL和poly-VI-PIPAM。這些聚合物上有多個咪唑基，可以結(jié)合金屬離子Cu2+。Cu2+-poly-VI-NIPAM已成功地用來沉淀分離大豆蛋白酶抑制劑；Cu2+-poly-VI-VCL可用于分離純化乙酸脫氫酶。poly-VI-NIPAMpoly–VI-VCL親和沉淀的親和配基6.2.3

親和沉淀的展望親和沉淀是一種簡單、高效的分離純化技術(shù)，已在多種蛋白的分離純化中應(yīng)用。pH敏感性親和沉淀

熱誘導(dǎo)親和沉淀離子強度敏感性的親和沉淀親和沉淀和其他技術(shù)的集成制備規(guī)模的親和沉淀

(1)

pH敏感性親和沉淀pH敏感性聚合物本身帶有電荷，當(dāng)它的凈電荷減少時，溶解度降低而發(fā)生沉淀，通過改變pH值改變其溶解狀態(tài)，以此類聚合物作為載體結(jié)合親和配基用于親和沉淀。pH敏感性聚合物包括：天然可逆性聚合物：脫乙酰殼聚糖(chitosan)、藻酸鹽(alginate)、纖維素衍生物（cellulose）；合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-丙烯酰-p-氨基苯酸、N-丙烯酰-m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸(methacrylicacid)和甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)的聚合物，異丁烯酸-異丁烯酸甲酯共聚物等

對某些可逆溶解性聚合物，通過改變溫度可改變?nèi)芙舛?。在親和沉淀中使用的熱聚合物用于蛋白質(zhì)的分離純化時，能夠進行特異性沉淀，稱為熱誘導(dǎo)親和沉淀。其原理是利用雙官能團試劑，其中一部分功能基團與被分離的生物分子特異性結(jié)合，另一部分功能基團在介質(zhì)性質(zhì)尤其是溫度變化后能形成沉淀。(2)

熱誘導(dǎo)親和沉淀對氨基苯甲瞇結(jié)合到異丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋白酶的熱親和沉淀聚合物，將這種沉淀劑加入胰蛋白酶提取液中形成以蛋白酶-聚合物復(fù)合體。濾液中剩余的酶活僅為原酶活的7%。過濾得到沉淀復(fù)合物，加入緩沖液中加熱，使胰蛋白酶和聚合物脫離，得到分離純化的酶。熱誘導(dǎo)親和沉淀可以和親和配基如金屬離子結(jié)合起來，如Cu-IDA-PVCL是一種人誘導(dǎo)聚合物，可用于乙酸脫氫酶的分離純化。(2)

熱誘導(dǎo)親和沉淀（應(yīng)用）(3)離子強度敏感性的親和沉淀此類聚合物在很寬的pH范圍內(nèi)對有機溶劑表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，當(dāng)添加或除去鹽是發(fā)生可逆性沉淀。孫彥等人研制了含有共軛二炔結(jié)構(gòu)單元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂質(zhì)體(PolymerizedLiposome,PLS)具有這種性質(zhì)，這在前面已經(jīng)敘述過。

(4)

親和沉淀和其他技術(shù)的集成雙水相萃取技術(shù)易于直接處理含細(xì)胞碎片的體系，可以和親和沉淀技術(shù)結(jié)合起來，提高分離效率。Kamihira等人將親和沉淀和雙水相技術(shù)結(jié)合分離純化蛋白質(zhì)A親和沉淀的可逆溶解聚合物EudragitS-100，以免疫球蛋白IgG為配基Eudragit主要分配在上相，因此和蛋白A結(jié)合的Eudragit分配在上相，分出上相后，調(diào)節(jié)pH使Eudragit沉淀，再將沉淀復(fù)合物解離便可得到蛋白A，同時上相的聚合物可以重復(fù)使用。具體過程如圖所示。制備規(guī)模的親和沉淀(1)T1中加入料液(2)調(diào)節(jié)溫度至4℃(3)加入AML和助濾劑(4)調(diào)節(jié)溫度至30℃進行沉淀(5)30℃下，在F1中進行混合物的過濾，在T2中收集濾液(6)30℃下，用硫酸銨溶液洗滌濾餅，在T2中收集濾液(7)30℃下，用洗脫液洗滌濾餅，在T3中收集含有目標(biāo)分子的洗脫液(8)洗滌并回收AML和過濾助劑，重復(fù)利用6.3親和膜分離技術(shù)

親和膜的原理及特點親和膜的制備

膜材料和（基質(zhì)）配基的選擇親和膜的制備親和膜分離的理論模型

吸附模型親和膜過程傳質(zhì)模型

親和膜分離技術(shù)的影響因素親和膜分離技術(shù)的應(yīng)用6.3.1親和膜的原理和特點

親和膜分離是將親和分離技術(shù)和膜分離技術(shù)結(jié)合，它將親和配基結(jié)合在分離膜上，利用膜作為基質(zhì)，對膜進行改性，再按照吸附、清洗、洗脫和再生的過程，對生物產(chǎn)品進行分離純化。

親和膜分離親和色譜原理利用膜固定親和配基利用層析介質(zhì)固定親和配基過程一般為低壓，可連續(xù)操作低、中、高都有，一般為間歇式操作設(shè)備板式、卷式、中空纖維式超濾或微濾膜填料一般在柱中進行速度快，擴散阻力小較慢，擴散阻力較大產(chǎn)物純度相對較低純度很高親和膜和普通的親和層析的比較具有相同傳質(zhì)效率的親和膜

與親和色譜裝置參數(shù)

中空纖維親和膜裝填100μm凝膠粒子的親和色譜裝置流體停留時間0.014min34.7min裝置體積0.773dm31070dm3平均流速1.4dm3/min1.4dm3/min配基裝填量1.9g1950g膜多孔床上的配基和液流之間的擴散路徑極短，傳質(zhì)速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快了分離時間，提高了分離效率。膜床的厚度一般較小，液流通過膜時的阻力也較小，因此壓降也較小，便于實現(xiàn)大規(guī)模的分離和連續(xù)、自動操作。親和膜的操作模式死端過濾模式Dead-endmode錯流過濾模式Cross-flowmode微孔親和過濾膜親和超濾膜親和膜的形狀板式圓盤式中空纖維式

前兩種較為簡單，成本低，容量小，中空纖維式便于實現(xiàn)連續(xù)、自動、規(guī)?；僮髂げ牧希ɑ|(zhì)）和配基的選擇親和膜對基質(zhì)材料的要求

(1)惰性；(2)具有親水性；(3)物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，同時機械穩(wěn)定性也好；(4)多孔性，內(nèi)外表面積大；(5)具有足夠多的可利用的化學(xué)基團；(6)非特異性吸附低；(7)適于成膜6.3.2

親和膜的制備

親和膜的制備常用親和膜基質(zhì)材料脂族烴類（聚乙烯，聚丙烯，聚丙烯氫）芳香族共聚物（聚碳酸酯，聚砜，聚醚砜）脂族聚酰胺（尼龍6，尼龍66）一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纖維素和纖維素的衍生物等膜材料制造商膜特性應(yīng)用NalgeneMemtekCorp.圓形,Φ2.5cm,4.7cm,孔徑0.2μ,0.5μ,交聯(lián)、結(jié)合酶及血清白蛋白的純化ActidickFMCCorp.圓形,孔徑1μ,交聯(lián)、包埋肽、蛋白質(zhì)及酶的固載化MemSep1010Millipore圓形,床體積1.4ml,孔徑1.2μ，結(jié)合蛋白A6mg單抗和多抗的分離MemSep1010Millipore床體積4.9ml,蛋白A28mg單抗和多抗的分離NugelSeparationCorp.平板式10cm×20cm,包埋、涂層、結(jié)合抗原、抗體、重組蛋白及酶的純化聚合物、硅膠BiotechnologyInst.ofCanada板式親和超濾，結(jié)合型胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的純化PolymerBiochemic板式15cm×cm,結(jié)合孔徑0.2～2μ細(xì)胞生長劑，IgG、干擾素純化（氨基苯甲醚）Fiuka卷式（0.3cm×3cm），結(jié)合孔徑0.2μRNA、DNA轉(zhuǎn)錄，中性蛋白純化Protrans大連化物所板式10cm×10cm,結(jié)合孔徑0.2～0.5cm胰蛋白酶抑制劑的分離親和膜的制備親和配基特異性配基：只與其對應(yīng)的分子特異性結(jié)合，如抗原、抗體、激素、激素受體等

常見的特異性配基：

肝素、伴刀豆蛋白A、單克隆抗體、胰蛋白酶等通用型配基：與某一類物質(zhì)結(jié)合

常見的通用型配基：

①NAD+、NADP+等輔酶；②

CibacronBlueF3G-A、ProcionRedH-3B、Procion

③

BlueMX-3G等活性染料④金屬離子（Cu2+、Ni2+、Fe2+、Zn2+）親和膜的親和配基一般可分為兩類：

特異性配基和通用型配基配基應(yīng)用的膜生物特異性配基ProteinA中空纖維膜，平板膜白細(xì)胞間介素2受體中空纖維膜肝素聚合物/共聚物膜sartobind單克隆抗體中空纖維胰蛋白酶改性聚砜膜通用性配基CibraonBlue聚合物/共聚物膜sartobind，尼龍膜，殼聚糖膜IDA-Cu2+改性PE膜，聚合物/共聚物膜sartobind，改性聚砜膜苯丙氨酸改性PE膜組氨酸或糖多菌素尼龍66平板膜常見親和膜配基間隔臂在分離生物大分子時，若將親和配基直接結(jié)合到基質(zhì)上，由于欲分離生物大分子的立體構(gòu)型使它很難接近介質(zhì)上的配基產(chǎn)生親和相互作用，此即色譜分離中的“空間位阻”效應(yīng)。這種情況在配基是小分子時表現(xiàn)尤為明顯，為了克服這種障礙，往往在介質(zhì)和配基之間插入一個具有一定幾何長度的有機基團，即間隔臂，以使欲分離的物質(zhì)方便的接近親和配基上的作用位點。

對于一個理想的間隔臂，不僅要具有一定的長度（至少要含3個以上原子），而且要求其自身不帶任何電荷，疏水性也不能太強，不帶任何附加的活性中心，以避免對分離物產(chǎn)生非特異性相互作用。由于間隔臂既要與親和介質(zhì)相連，又要與配基相接，因此要求其分子上含有雙官能團反應(yīng)基。間隔臂長度一般以5-50nm較為適宜。常用的間隔臂是含2個活潑氨基的二胺類化合物，如乙二胺、丙二胺、己二胺、對苯二胺等。此外許多氨基酸和肽類化合物，由于其分子含有氨基、羧基、羥基、巰基等可反應(yīng)的基團，也可用作間隔臂。間隔臂親和膜的制備

很多膜材料不能直接應(yīng)用于親和膜的分離，必須改性后才可以使用。改性的目的側(cè)重于增加膜的親水性、生物相容性，降低非特異性吸附，同時膜應(yīng)具有良好的機械強度、孔結(jié)構(gòu)、滲透性和均勻的孔分布。改性的膜再接上親和配基制備成親和膜。親和膜的制備主要分為三步:成膜、功能化、活化按機械先后順序不同可分為以下兩種途徑：膜材料→功能化的膜材料→功能化的膜→活化的膜膜材料→包埋或結(jié)合親和配基→功能化的膜

親和膜的制備功能化，通過引用適當(dāng)?shù)幕鶊F，使膜改性；活化，引入基團使膜的活性增強、能與配基作用具體采用哪一種途徑更好，因材料而異，一般認(rèn)為活化在成膜后機械更好一些，成膜方法有溶膠－凝膠轉(zhuǎn)化法，靜電紡絲法纖維素親和膜的制備由于纖維素膜分子上有許多羥基，因此可以用碳二胺法，氧化物法等羥基活化方法進行活化,然后結(jié)合上親和配基。商振華等用3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷活化纖維素以對苯二胺作為間隔臂，然后偶合牛血清白蛋白活性染料作配基，制得一系列親和膜，并用于-干擾素、白蛋白、堿性磷酸酯酶等的分離純化，效果良好。纖維素膜的交聯(lián)和活性染料配基的固載化聚酰胺膜可以先用酸水解改性，然后結(jié)合上羥乙基纖維素以增強反應(yīng)基團的活性，而且降低蛋白質(zhì)的非特異性吸附。在親和分離中，以尼龍膜居多。水解后的尼龍66微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺做間隔臂，再用戊二醛法固載上組氨酸，制得的親和膜可成功地去除氨基酸注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等醫(yī)藥制劑中的內(nèi)毒素，去除率在90%以上。聚酰胺親和膜的制備膜親和介質(zhì)MAC-His-NL66的制備過程聚丙烯親和膜的制備聚丙烯膜多用輻射誘導(dǎo)接枝甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）的方法進行活化，接枝的GMA環(huán)氧基可用以鍵合配基，剩余環(huán)氧基要轉(zhuǎn)變?yōu)槎蓟?，或采用其他試劑封閉，降低非特異性吸附。同時GMA還起到了間隔臂的作用。

Kim等人在聚丙烯中空膜上輻射誘導(dǎo)接枝上GMA，用苯丙氨酸、色氨酸做配基，吸附-球蛋白。聚砜親和膜的制備聚砜（PS）雖是一種良好的成膜材料，但其具有的憎水性使它不能直接用作親和分離介質(zhì)，必須進行化學(xué)改性，變成具有一定親水性的膜才能使用。聚砜膜的改性方法通常有以下幾種：1）在膜表面鍵合一層親水物質(zhì)如纖維素、殼聚糖。可以利用聚砜膜的末端酚羥基與1,2-亞乙基二醇縮水甘油醚（EGDGE）反應(yīng)產(chǎn)生末端環(huán)氧基，然后鍵和羥乙基纖維素形成一層親水層，然后鍵和配基。鍵和親水性基團后，膜的非特異性吸附很小，但孔徑縮小，膜的滲透率下降2）引入親水性基團，商振華等采用?；?胺化和氯甲基化等途徑對聚砜膜進行改性，在芳環(huán)上引入末端氨基。改性后膜孔隙率大，孔徑分布均勻，有良好的通透性3）采用金屬化試劑，如(butycithim)將聚砜膜改性成聚砜鋰，用環(huán)氧化合物進行改性，可衍生出許多親和膜，如金屬親和膜親和膜合成中活化試劑的選擇：

基質(zhì)與所鍵合物質(zhì)上可反應(yīng)基團的種類、耐受pH范圍及形成鍵的穩(wěn)定性，這直接決定了親和介質(zhì)的使用壽命所用試劑的毒性及價格，各種活化試劑各有利弊，有的活化時間短，有的毒性低，有的形成的鍵穩(wěn)定，因此須根據(jù)實驗室實際情況及實驗?zāi)康倪M行選擇

親和膜的活化常用的活化方法：（a）環(huán)氧氯丙烷（b）1,1-羰基雙咪唑（CDI）（c）過碘酸鈉（d）三氯三嗪（e）戊二醛（f）雙環(huán)氧試劑吸附模型

一般情況下，配基與底物的結(jié)合可近似用langmuir吸附方程表示，由于親和膜分離過程的復(fù)雜性，這種處理是很粗略的：

式中：qm－最大吸附量Kd－吸附平衡常數(shù)

C－進料濃度q－膜吸附量6.3.3親和膜分離的理論模型

對多克隆抗體，langmuir吸附方程式明顯不能解釋配基與目標(biāo)產(chǎn)物之間的規(guī)律，因此有人提出三參數(shù)模型：式中：0≤a≤1，其余字母意義同上參數(shù)a值越接近1，說明物系的親和力均勻性越好，這一模型的適用性為親和吸附動力學(xué)及分離過程的研究提供了依據(jù)。親和膜分離的理論模型關(guān)于配基－底物結(jié)合的一般關(guān)系式目前還沒有發(fā)現(xiàn)，langmuir模型目前只適用于少數(shù)物系，如親和力均勻的單克隆抗體相同三參數(shù)模型只能一定程度上擬合多克隆抗體物系，原因在于多克隆抗體物系結(jié)合親和力不均勻，其主要原因是由于抗體對某一特定抗原決定簇的異質(zhì)性所致。親和膜分離的理論模型親和膜過程傳質(zhì)模型由于親和膜分離過程非常復(fù)雜，目前對親和分離的處理部分仍是經(jīng)驗式的，真正基于物理－化學(xué)－生物特異性相互作用的理論和關(guān)系式還沒有。最初提出的親和模型是基于配基－蛋白間相互作用的吸附－解離平衡過程。最近Suen提出用對流、擴散和langmuir吸附理論對親和膜分離過程作了數(shù)學(xué)分析，推導(dǎo)出了蛋白質(zhì)和配基之間形成的絡(luò)合物濃度與蛋白濃度及配基濃度之間的關(guān)系式，并指出通過親和膜的流速不僅受壓降的限制，而且受固載化配基和蛋白質(zhì)之間解離動力學(xué)的限制，對于較厚的膜包，可使用較高的流速，并有較大的樣品流量。此時流出峰的形狀也較尖銳，Suen假設(shè)樣品溶液是以層流方式沿軸向通過已固載化是配基的多孔膜層，蛋白質(zhì)在膜是的吸附是等溫吸附過程，料液濃度為Co，膜上配基濃度為Cl，蛋白與配基之間形成的絡(luò)合物濃度為Cz(z,t)，假設(shè)：(1)溶質(zhì)在徑向的濃度梯度忽略不計(2)邊界層上質(zhì)量傳遞時間(BLMT)dp/kc遠(yuǎn)小于軸向?qū)α鲿r間L/V，BLMT系數(shù)kc由Athalye等的關(guān)系式確定：式中：Dp－膜孔徑ε－膜孔隙度

kc－邊界層質(zhì)量傳遞系數(shù)親和膜過程傳質(zhì)模型ReSc為Reyndds-Smidt數(shù)ReSc=Dpευ/D由上述方程：dp/kc<(dp)2/4D

對親和膜：(dp)2/4D<<L/V式中：ps表示蛋白－配基所形成的絡(luò)合物，假設(shè)為單價吸附(3)蛋白與配基之間的結(jié)合式如下式所示親和膜過程傳質(zhì)模型(2)式表示是langmuir等溫吸附中的可逆速率表達式，Suen和Etgd對膜截面是的質(zhì)量平衡采用如下的連續(xù)方程表示：根據(jù)方程(2)，其二次速率表達式可寫為親和膜過程傳質(zhì)模型

Suen根據(jù)邊界條件和初始條件分別推導(dǎo)了包括軸向擴散在內(nèi)的蛋白質(zhì)吸附等溫線方程和忽略軸向擴散的可逆吸附等溫線方程，并對分離結(jié)果作了解釋，指出對于親和分離過程較合適的kc值范圍為1.0*105－2.6*105/(MS)之間，典型的kd值范圍在1.6*10-7－3.9*10-7M，這些數(shù)據(jù)反映出在可溶性蛋白和固載化配基之間固有的解離速率，它們不受質(zhì)量傳遞的限制，膜越薄，軸向擴散的影響越顯著，允許使用的流速越低，用薄膜堆積成厚膜可降低軸向擴散的影響，有利于提高操作流速，增加樣品負(fù)荷，縮短分析時間。親和膜過程傳質(zhì)模型

6.3.4

親和膜分離技術(shù)的影響因素親和分離過程受制約的因素很多，操作條件的選擇對分離結(jié)果有直接的影響：

1)吸附容量：主要取決于親和介質(zhì)上所結(jié)合的配位體濃度實際有效容量低于理論值

2)樣品蛋白濃度：對有親和力的系統(tǒng)，樣品濃度的影響不明顯，一般為了防止樣品流失，都在很低的流速下上樣

3)溫度的影響：一般來說親和作用隨溫度升高而降低，因此都在低溫（4℃）下上樣，再適當(dāng)升高溫度，在溫和條件下洗脫，以便獲得高的活力回收4)洗脫液的選擇：洗脫液的組成、pH值、離子強度等對分離結(jié)果和活力回收有大的影響，一般都選擇對樣品的構(gòu)型與活力沒有影響的緩沖液系統(tǒng)，必要時可加入適量有機改性劑，如乙二醇、甘氨酸、甲酰胺等，盡量避免使用強酸、強堿和蛋白變性劑如：鹽酸胍、脲等。5)進料緩沖液離子強度：實驗以氯化鈉鹽濃度調(diào)節(jié)離子強度，加入氯化鈉有利于γ－免疫球蛋白的吸附，γ－免疫球蛋白是生物活性大分子，其同A蛋白的結(jié)合依賴于溶液環(huán)境，離子強度是進料緩沖液物理性質(zhì)的重要因素，改變離子強度則影響免疫球蛋白分子周圍對水化層及其電荷分布，從而影響γ－免疫球蛋白和A蛋白配基的結(jié)合。

親和膜分離技術(shù)的影響因素6)進料緩沖液溶液pH值：進料緩沖液溶液pH值直接影響免疫球蛋白分子的電荷狀態(tài)，因此影響免疫球蛋白分子與A蛋白配基的結(jié)合。7)進料速率：進料速率增加，γ－免疫球蛋白回收率降低。但變化不大，γ－免疫球蛋白與A蛋白分子間特異性結(jié)合的速度較快。

8)操作壓降：指膜入口與出口處兩點間壓強差，進料速率增大，膜操作壓降升高，但與膜的最大耐壓相比變化幅度不大親和膜分離技術(shù)的影響因素基質(zhì)膜材料功能化試劑（方法）活化試劑配基分離物質(zhì)聚砜表面覆蓋親水性纖維素層FMPA蛋白人血清中的γ－免疫球蛋白聚砜正叔丁基鋰縮水甘油基氧代己醚亞氨基－乙酸Cu2+組氨酸溶液聚乙烯輻射接枝縮水甘油基異丁烯酸鹽L－苯丙氨酸牛γ－球蛋白BGG聚砜氯甲基化－氨化重氮鹽胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑尼龍膜親水性表面環(huán)氧氯丙烷CibacronBlueF3-GA牛血清蛋白大孔纖維素膜環(huán)氧氯丙烷ActiveRedK2BP堿性磷酸酯酶聚醚氨基甲酸脂

1，6－己二異氰酸酯FMP或CDIA蛋白γ-免疫球蛋白

6.3.5

親和膜分離技術(shù)的應(yīng)用1.血流，2.分離膜，3.聚氯乙烯膜，4.血液流出，5.血液入口，6.排氣孔，7.殼體，8.密封，9.進樣蓋，

10.孔，11血液通道，12出樣蓋，13血液出口

切流膜結(jié)構(gòu)示意圖賈凌云等人制備了proteinA切流膜色譜柱，并把該裝置用于免疫吸附治療，親和膜做成徑向形式，結(jié)構(gòu)如圖。當(dāng)流速為130ml/min，人血漿通過TFAMC蛋白A的親和膜，它對IgG的吸附容量可達400mg。Millipore公司已研制成功含A蛋白的纖維素膜分離器，可用作單克隆抗體等的純化。結(jié)果表明，在一個膜體積為0.5ml的分離器上，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液在低流速下負(fù)荷，15分鐘可獲得80mg提純的單克隆抗體。以此推算，用一個14ml的親和膜包，一天大約就可生產(chǎn)出8g純的單抗，比同樣體積的瓊脂糖親和色譜柱生產(chǎn)能力要高100倍以上。Amerace公司研制了一種以聚乙烯（PVA）和硅膠為基質(zhì)的共混親和膜，在直徑為47mm的碟式膜上可結(jié)合20mg牛血清白蛋白（BSA）。把它制成25mm厚的膜分離器則可結(jié)合上670mgBSA。親和膜分離技術(shù)的應(yīng)用6.4分子印跡分離技術(shù)分子印跡的原理和方法分子印跡技術(shù)是將要分離的目標(biāo)分子與交聯(lián)劑在聚合物單體溶液中進行共聚制備得到顆粒介質(zhì)，然后洗脫出去包埋在介質(zhì)中的目標(biāo)分子，便得到分子印跡聚合物（MIP）介質(zhì)，此時的介質(zhì)可以將目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)保持“印跡imprinting”或留下“記憶memory”。分子印跡聚合物的制備過程早在19世紀(jì)40年代，諾貝爾獎獲得者Pauling提出：抗體在形成時其三維結(jié)構(gòu)會盡可能的同抗原形成多重作用點，抗原作為一種模板就會“鑄造”在抗體的結(jié)合部位。1972年Wulff等人利用酶和抗體具有分子形狀、空間結(jié)構(gòu)選擇性的特點，發(fā)展了用于色譜手性拆分的分子印跡聚合物（molecularlyimprintingpolymer,MIP）,又稱模板聚合物或特制聚合物。1983年Mosbach進一步發(fā)展了這一技術(shù)，分子印跡技術(shù)通過模板分子（目標(biāo)分子或印跡分子）的應(yīng)用，使目標(biāo)分子在聚合物中的特異識別位點或催化位點得以形成，但主要用于小分子物質(zhì)如多肽或輔酶（如NAD）的分離純化。1995年MariaKempe又將該技術(shù)用于蛋白質(zhì)的分離純化。分子識別分子印跡技術(shù)的制備方法

共價印跡（covalentmolecularimprinting）非共價印跡（non-covalentmolecularimprinting）優(yōu)點空間位置固定準(zhǔn)確，因而能夠移走大量的模板分子，這一點對于金屬配基結(jié)合也一樣分子印跡系統(tǒng)多種多樣；印跡分子可以用很簡單的方法除去，且作用溫和缺點攜帶適當(dāng)結(jié)合基團的化合物選擇性低；經(jīng)歷共價鍵的形成和斷裂，所需能量較高，并且，在水解過程中需要加入催化劑操作條件苛刻，因此可逆共價結(jié)合法的應(yīng)用受到限制專一性不如共價結(jié)合作用強常用單體和交聯(lián)劑種類(Type)化合物(compound)共價型單體Covalentmonomer含乙烯基官能團的硼酸合二醇(Vinyl-functionalboronicacidanddiols)、鍵合有含硼酸官能團的硅烷混合物的硅膠顆粒(silanemixturesincludingboronatesilaneonsilicaparticale)、鍵合有氨基的硅烷凝膠顆粒(amino-functionalsilianesonsilicaparticles)非共價型單體Non-covalentmonomer丙烯酸(acrylicacid)、甲基丙烯酸(methacrylicacid)、甲基丙烯酸甲酯(Methylmethacrylate)、對乙烯苯甲酸(ρ-vinylbenzoicacid)、對乙基苯乙烯(ethylstyrene)、亞甲基丁二酸(ltaconicacid)、二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸(2-acrylamido-2-methyl-1-propane-sulphonicacid)、1-乙烯基咪唑(1-vinylimidazole)、4-乙烯基吡啶(4-vinylpydine)、2-乙烯基吡啶(2-vinylpydine).

交聯(lián)劑crosslinkerN,N’-亞甲基二丙烯酰胺(N,N’-methylenediacrylamide)、N,N’-1,4-亞苯基二丙烯酰胺(N,N’-phenylenediacrylamide)，3，5-二（丙烯酰胺）苯甲酸(3,5—bis(acryolamide)benzoicacid)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate)，二乙烯基苯(divinylbenzene)、N,O-二丙烯酰-L-苯丙氨醇(N,O-Bisacryoyl-L_phenylalaninol)、三丙烯酸季戊四醇酯(pentacrythritoltriacrylate)，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropanetrimethacrylate)，季戊四醇四甲基丙烯酸酯(pentacrythritoltetraacrylate)分子印跡技術(shù)的應(yīng)用用作特制的色譜分離介質(zhì)

手性分離介質(zhì)，親和分離技術(shù)固相萃取用作抗體或受體摸擬物

人工抗體，免疫分析用作生物傳感器的傳感元件在合成和催化中的應(yīng)用

產(chǎn)物分離和反應(yīng)耦合，人工酶臨床藥物分析組合化學(xué)高通量篩選活性化合物分離純化中的應(yīng)用被分離物Analytes1Ac-DL-Phe8Boc-DL-Phe-OH153-(3,4-dihydroxylphenyl)alanine22H-DL-Phe-NHEt2Ac-DL-The-L-Trp-Ome9Boc-DL-Pro-Osu16DL-Ala,DL-Ile,DL-Leu,DL-Phe23H-DL-Phe-NHPhe3Ac-DL-Trp10Boc-Phe,Boc-Trp,Boc-Tyr17DL-PheNHPh24H-DL-Pro-NHPhe4Ac-DL-Trp-Oet11Boc-Tyr-Ome18DL-Trp,DL-Tyr,DL-Val25H-DL-Trp-Pet5Ac-DL-Tyr12Cbz-DL-Ala-Ala-Ome19H-DL-Me2Phe-NHPhe26(±)α-methylhydrocinnamicacid6Boc-DL-Tyr-Ome13Dansyl-DL-Phe-OH20H-DL-ρ-NH2Phe-Oet27(±)α-methyphenylethylamine7Boc-DL-Phe-Gly-Oet14D-glycosidesofgalactose21H-DL-Phe-Gly-NHPhe28N-Ac_DL-The-L-Trp-Ome分子印跡酶催化脂肪酶催化對映體拆分脂肪酶底物或產(chǎn)物類似物分子印跡初速度對映選擇性E天然酶715.5天然酶分子印跡93022先分子印跡再包衣110077MIPs應(yīng)用于臨床藥物分析

分析對象

Analytes分析對象

Analytes撲熱息痛Acetaminophen腎上腺素類藥物Adrenergicdrug 雄-5-烯-3β,17β二醇Androst-5-ene-3β,17β-diol雄烯酮類Androstenone2-氨基吡啶2-amin