定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方法及應用,臨床診斷學論文

定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方法及應用,臨床診斷學論文侵襲性念珠菌病(invasivecandidiasis,IC)在免疫抑制患者及ICU患者中的發(fā)病率逐年升高,盡管臨床醫(yī)師對IC的診治越來越重視,但其致死率仍可高達40%~55%,華而不實白色念珠菌還是最常見的致病菌,約占50%。血培養(yǎng)是當前IC診斷的實驗室金標準和傳統(tǒng)的檢測方式方法,由于敏感性低(約50%)、結果回報時間長,往往延誤了IC的診斷和治療,是造成IC高病死率的部分原因。尋找可靠有效的IC診斷抗原標志物,并建立定量檢測方式方法,能夠彌補血培養(yǎng)的缺乏,提高IC的實驗室診斷水平并用于療效監(jiān)測。烯醇化酶(enolase,Eno)存在于念珠菌細胞壁與細胞質內,由440個氨基酸組成,相對分子質量在45000~48000。Eno在白色念珠菌中是含量最豐富的可溶性蛋白、重要的菌絲相蛋白和免疫優(yōu)勢抗原,在念珠菌能量代謝中起重要作用,是一個潛在的IC診斷標志物。本研究建立了定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方式方法,并應用于念珠菌培養(yǎng)上清檢測,為深切進入了解Eno對IC的診斷價值奠定研究基礎。1、材料與方式方法1.1菌株及來源本研究所用白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母均為本科微生物室臨床分離菌株,經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和VITEK2-compact全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃公司)鑒定。1.2主要試劑及儀器氨基化磁性微珠(Merck公司)由南方醫(yī)科大學吳英松教授惠贈。N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、4-嗎啉乙磺酸(MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自Sigma公司。白色念珠菌Eno重組蛋白、抗Eno單克隆抗體及羊抗Eno多克隆抗體為本室制備及純化;HRP購自上海國源生物技術有限公司;RPMI1640為Gibco公司產品,小牛血清購自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司,其他試劑均為分析純。12孔磁分離架和96孔板磁分離架購自天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心。Model680型酶聯(lián)儀為美國Bio-Rad公司產品,QB-128型旋轉混勻器購于江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。75-2A微量振蕩器購于上海醫(yī)用分析儀器廠。1.3免疫磁珠制備參照文獻,取100L(100mg/mL)磁珠懸液,參加1mL結合緩沖液(0.1mol/LMES,pH5.0);渦旋混勻后將離心管置于12孔磁分離架上60s,吸去上清,重復上述操作1次。參加1mL結合緩沖液,混懸磁珠,依次參加40LEDC和25LNHS(現(xiàn)用現(xiàn)配,濃度均為10mg/mL),室溫旋轉混勻30min,置于12孔磁分離架上60s,吸去上清。參加1mL結合緩沖液稀釋的Eno單克隆抗體(500g),4℃旋轉(30r/min)混勻過夜,于12孔磁分離架上分離結合Eno單克隆抗體的免疫磁珠60s,汲取全部上清;參加1mLTBST(25mmol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.05%Tween,pH7.2)混懸、洗滌免疫磁珠1次,置于磁性分離架上60s,棄去上清后參加0.01mol/LPBST(含0.05%Tween20的PBS,pH7.2)將免疫磁珠稀釋至500g/mL,4℃保存。1.4培養(yǎng)上清制備參照文獻進行1.5HRP標記的羊抗Eno制備按改進過碘酸鈉法標記1.6免疫磁珠法檢測Eno在96孔空白酶聯(lián)反響板中每孔參加免疫磁珠和100L待檢標本室溫振蕩混勻;將反響板置于96孔板磁分離架上30s,吸棄上清,參加100LPBST振蕩洗滌1min,磁性分離30s,吸棄上清;重復洗滌5次。參加HRP-羊抗Eno100L,室溫振蕩混勻;磁性分離、PBST洗滌5次;參加底物液TMB-H2O2100L,室溫振蕩混勻10min;參加50L0.5mol/LH2SO4終止反響,于酶聯(lián)儀上用測試波長450nm、參比波長630nm讀取吸光度(A)值。2、結果2.1磁珠耦聯(lián)率測定磁珠過夜耦聯(lián)抗原后,經(jīng)磁性分離的上清液蛋白質定量為72.8g,耦聯(lián)率為85.44%。2.2免疫磁珠法反響條件優(yōu)化方陣滴定法選定免疫磁珠反響量為20L,與重組Eno或待檢樣品結合時間為45min,與HRP-羊抗Eno結合時間為45min,HRP-抗人IgG最適濃度為1∶3000。2.3免疫磁珠法定量檢測Eno主要性能指標。2.3.1精致細密度將Eno重組蛋白用0.01mol/LPBS稀釋為25ng/mL(高濃度)和5ng/mL(低濃度),同一批次檢測20份,計算批內精致細密度;連續(xù)檢測20批次,計算批間精致細密度。Eno濃度為25ng/mL和5ng/mL時,批內和批間精致細密度分別為4.54%、5.87%和5.26%、8.82%。2.3.2最低檢出下限測定培養(yǎng)基質(含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)A值(xs)為0.0110.004(n=20),以0.023(x+3s)為cut-off值。將重組蛋白用培養(yǎng)基質稀釋為2.00、1.00、0.50、和0.25ng/mL,每個濃度重復檢測10次,分別計算不同濃度重組Eno蛋白A值的x和s。見表1。以重組Eno蛋白A值(x-2s)0.023(cut-off)為標準,最低檢出下限為0.5ng/mL。2.3.3線性范圍將重組蛋白用培養(yǎng)基質稀釋為50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0和0.5ng/mL,培養(yǎng)基質作為空白對照,用A值和濃度進行回歸分析,相關系數(shù)R2=0.9923,線性范圍為0.5~50ng/mL,標準曲線見圖1。2.3.4阻斷試驗將羊抗Eno參加50ng/mL的抗原溶液,使羊抗Eno終濃度分別為1、2、4和8g/mL,置37℃溫育1h后,檢測混合液中Eno的A值?？梢婋S抗體濃度增加,測得的EnoA值不斷下降,見圖2。當參加的羊抗Eno濃度為8g/mL時,阻斷率為95.46%。2.4培養(yǎng)上清Eno檢測結果2.4.1不同溫度下白色念珠菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結果37℃培養(yǎng)4h后,涂片可見白色念珠菌構成假菌絲,培養(yǎng)24h,上清中Eno濃度為3.89ng/mL。由于1640完全培養(yǎng)基中含有20%小牛血清,因而25℃培養(yǎng)24h后,涂片可以看見假菌絲的構成,但與同期的37℃培養(yǎng)物相比,假菌絲的比例較低,上清中Eno濃度為0.74ng/mL。25℃培養(yǎng)48h,上清中Eno濃度為3.05ng/mL,此時37℃培養(yǎng)上清中Eno濃度為7.77ng/mL。不同培養(yǎng)溫度下Eno濃度均隨時間延長而增加。在整個觀察期間,25℃培養(yǎng)液中白色念珠菌菌絲的生長弱于37℃培養(yǎng)液,培養(yǎng)上清中Eno含量始終低于37℃培養(yǎng)上清。見圖3。2.4.2不同真菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結果涂片結果顯示,培養(yǎng)4h時白色念珠菌和熱帶念珠菌出現(xiàn)菌絲生長,培養(yǎng)48h近平滑念珠菌出現(xiàn)明顯的菌絲生長。37℃培養(yǎng)24h后,白色念珠菌培養(yǎng)上清中可檢出Eno,濃度為3.89ng/mL,隨培養(yǎng)時間延長上清中Eno逐步增加,培養(yǎng)至120h,Eno濃度達37.89ng/mL。近平滑念珠菌37℃培養(yǎng)48h,上清可檢測出少量Eno(1.26ng/mL),但隨后一直保持低水平,培養(yǎng)至120h,Eno濃度為2.98ng/mL。在整個培養(yǎng)經(jīng)過中,熱帶念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母培養(yǎng)上清內未檢測出Eno。見圖4。3、討論基于抗原診斷的非培養(yǎng)方式方法如1,3--D葡聚糖(1,3--glucan,BG)、甘露聚糖的檢測可為IC診斷提供直接根據(jù),固然敏感性適中,但彌補了血培養(yǎng)的缺乏,近年來在臨床得到了廣泛的應用。歐洲癌癥-侵襲性真菌感染治療研究協(xié)作組和美國國立變態(tài)反響和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)將BG納入侵襲性真菌感染臨床診斷(probable)和擬診(possible)的微生物學標準。在BG檢測中有些容易造成假陽性的因素,如透析、輸注白蛋白注射液、靜脈導管置入、抗腫瘤藥物中的類似成分、手術紗布污染、某些細菌感染等,限制了BG在侵襲性念珠菌感染中的診斷作用,研究者致力于尋找新的用于IC診斷抗原標志物。Walsh等和Mitsutake等報道在IC患者外周血中會出現(xiàn)Eno抗原血癥,Eno檢測IC的敏感性和特異性為71.8%~75%和96%~100%。他們以為Eno抗原檢測是對血培養(yǎng)方式方法的有益補充,假如和甘露聚糖、BG聯(lián)合檢測能夠提高IC檢測的準確性。Mitsutake等用于檢測的多克隆抗體是采用白色念珠菌菌體純化Eno蛋白免疫家兔后獲得,不能區(qū)分不同念珠菌所致感染,檢測靈敏度為5ng/mL。Walsh等使用的檢測形式和本研究類似,也采用了單抗和多抗的檢測組合,Eno的檢出下限為0.5~1ng/mL,但未對不同念珠菌感染的特異性進行評價。我們前期已成功建立雙抗體夾心ELISA定性檢測Eno,證實所采用的單抗和多抗組合能夠特異性辨別白色念珠菌增殖經(jīng)過中產生的天然抗原,除與近平滑念珠菌有微弱穿插反響外,與其他念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母無穿插反響。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Eno水平與白色念珠菌菌絲生長呈正相關,檢測Eno水平能夠反映白色念珠菌侵襲性生長的發(fā)生,我們以為實現(xiàn)Eno的定量檢測有助于評估IC的發(fā)生和監(jiān)測治療效果。念珠菌抗原檢測遭到在血清中去除快,循環(huán)血中含量低的局限,新免疫技術和平臺的出現(xiàn),將為提高IC患者實驗室診斷水平創(chuàng)造條件。免疫磁珠分離技術是將免疫學反響的高度特異性與磁珠特有的磁響應性相結合的一種新興免疫學技術,具有分離快速、簡單和靈敏的優(yōu)勢,已廣泛應用于免疫細胞分離、病原微生物學和免疫學檢測。本研究將白色念珠菌Eno單克隆抗體耦聯(lián)至磁性微球上,制備免疫磁珠,建立定量檢測Eno方式方法,其方式方法學性能指標如精致細密度、特異性、線性范圍符合臨床實驗要求,最低檢測下限與文獻報道一致。免疫磁珠法對常見真菌培養(yǎng)上清中Eno含量和白色念珠菌不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)上清中Eno含量的定量檢測結果,支持了我們前期研究的定性結果。免疫磁珠法檢測的特異性與ELISA法一致,均可特異辨別白色念珠菌Eno蛋白,與近平滑念珠菌有弱穿插反響性,提示該法有望用于特異診斷白色念珠菌引發(fā)的侵襲性念珠菌感染,為臨床正確選擇抗真菌藥物提供根據(jù)。免疫磁珠具有較大的比外表積,其結合效率類似于液相-液相反響,高于ELISA的固相-液相反響。利用免疫磁珠的磁響應性,抗原抗