定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方法及應(yīng)用,臨床診斷學(xué)論文

定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方法及應(yīng)用,臨床診斷學(xué)論文侵襲性念珠菌病(invasivecandidiasis,IC)在免疫抑制患者及ICU患者中的發(fā)病率逐年升高,盡管臨床醫(yī)師對IC的診治越來越重視,但其致死率仍可高達(dá)40%~55%,華而不實(shí)白色念珠菌還是最常見的致病菌,約占50%。血培養(yǎng)是當(dāng)前IC診斷的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)和傳統(tǒng)的檢測方式方法,由于敏感性低(約50%)、結(jié)果回報(bào)時(shí)間長,往往延誤了IC的診斷和治療,是造成IC高病死率的部分原因。尋找可靠有效的IC診斷抗原標(biāo)志物,并建立定量檢測方式方法,能夠彌補(bǔ)血培養(yǎng)的缺乏,提高IC的實(shí)驗(yàn)室診斷水平并用于療效監(jiān)測。烯醇化酶(enolase,Eno)存在于念珠菌細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)內(nèi),由440個(gè)氨基酸組成,相對分子質(zhì)量在45000~48000。Eno在白色念珠菌中是含量最豐富的可溶性蛋白、重要的菌絲相蛋白和免疫優(yōu)勢抗原,在念珠菌能量代謝中起重要作用,是一個(gè)潛在的IC診斷標(biāo)志物。本研究建立了定量檢測白色念珠菌Eno的免疫磁珠方式方法,并應(yīng)用于念珠菌培養(yǎng)上清檢測,為深切進(jìn)入了解Eno對IC的診斷價(jià)值奠定研究基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1菌株及來源本研究所用白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母均為本科微生物室臨床分離菌株,經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和VITEK2-compact全自動細(xì)菌鑒定儀(法國梅里埃公司)鑒定。1.2主要試劑及儀器氨基化磁性微珠(Merck公司)由南方醫(yī)科大學(xué)吳英松教授惠贈。N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、4-嗎啉乙磺酸(MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購自Sigma公司。白色念珠菌Eno重組蛋白、抗Eno單克隆抗體及羊抗Eno多克隆抗體為本室制備及純化;HRP購自上海國源生物技術(shù)有限公司;RPMI1640為Gibco公司產(chǎn)品,小牛血清購自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司,BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司,其他試劑均為分析純。12孔磁分離架和96孔板磁分離架購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。Model680型酶聯(lián)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品,QB-128型旋轉(zhuǎn)混勻器購于江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。75-2A微量振蕩器購于上海醫(yī)用分析儀器廠。1.3免疫磁珠制備參照文獻(xiàn),取100L(100mg/mL)磁珠懸液,參加1mL結(jié)合緩沖液(0.1mol/LMES,pH5.0);渦旋混勻后將離心管置于12孔磁分離架上60s,吸去上清,重復(fù)上述操作1次。參加1mL結(jié)合緩沖液,混懸磁珠,依次參加40LEDC和25LNHS(現(xiàn)用現(xiàn)配,濃度均為10mg/mL),室溫旋轉(zhuǎn)混勻30min,置于12孔磁分離架上60s,吸去上清。參加1mL結(jié)合緩沖液稀釋的Eno單克隆抗體(500g),4℃旋轉(zhuǎn)(30r/min)混勻過夜,于12孔磁分離架上分離結(jié)合Eno單克隆抗體的免疫磁珠60s,汲取全部上清;參加1mLTBST(25mmol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.05%Tween,pH7.2)混懸、洗滌免疫磁珠1次,置于磁性分離架上60s,棄去上清后參加0.01mol/LPBST(含0.05%Tween20的PBS,pH7.2)將免疫磁珠稀釋至500g/mL,4℃保存。1.4培養(yǎng)上清制備參照文獻(xiàn)進(jìn)行1.5HRP標(biāo)記的羊抗Eno制備按改進(jìn)過碘酸鈉法標(biāo)記1.6免疫磁珠法檢測Eno在96孔空白酶聯(lián)反響板中每孔參加免疫磁珠和100L待檢標(biāo)本室溫振蕩混勻;將反響板置于96孔板磁分離架上30s,吸棄上清,參加100LPBST振蕩洗滌1min,磁性分離30s,吸棄上清;重復(fù)洗滌5次。參加HRP-羊抗Eno100L,室溫振蕩混勻;磁性分離、PBST洗滌5次;參加底物液TMB-H2O2100L,室溫振蕩混勻10min;參加50L0.5mol/LH2SO4終止反響,于酶聯(lián)儀上用測試波長450nm、參比波長630nm讀取吸光度(A)值。2、結(jié)果2.1磁珠耦聯(lián)率測定磁珠過夜耦聯(lián)抗原后,經(jīng)磁性分離的上清液蛋白質(zhì)定量為72.8g,耦聯(lián)率為85.44%。2.2免疫磁珠法反響條件優(yōu)化方陣滴定法選定免疫磁珠反響量為20L,與重組Eno或待檢樣品結(jié)合時(shí)間為45min,與HRP-羊抗Eno結(jié)合時(shí)間為45min,HRP-抗人IgG最適濃度為1∶3000。2.3免疫磁珠法定量檢測Eno主要性能指標(biāo)。2.3.1精致細(xì)密度將Eno重組蛋白用0.01mol/LPBS稀釋為25ng/mL(高濃度)和5ng/mL(低濃度),同一批次檢測20份,計(jì)算批內(nèi)精致細(xì)密度;連續(xù)檢測20批次,計(jì)算批間精致細(xì)密度。Eno濃度為25ng/mL和5ng/mL時(shí),批內(nèi)和批間精致細(xì)密度分別為4.54%、5.87%和5.26%、8.82%。2.3.2最低檢出下限測定培養(yǎng)基質(zhì)(含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液)A值(xs)為0.0110.004(n=20),以0.023(x+3s)為cut-off值。將重組蛋白用培養(yǎng)基質(zhì)稀釋為2.00、1.00、0.50、和0.25ng/mL,每個(gè)濃度重復(fù)檢測10次,分別計(jì)算不同濃度重組Eno蛋白A值的x和s。見表1。以重組Eno蛋白A值(x-2s)0.023(cut-off)為標(biāo)準(zhǔn),最低檢出下限為0.5ng/mL。2.3.3線性范圍將重組蛋白用培養(yǎng)基質(zhì)稀釋為50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0和0.5ng/mL,培養(yǎng)基質(zhì)作為空白對照,用A值和濃度進(jìn)行回歸分析,相關(guān)系數(shù)R2=0.9923,線性范圍為0.5~50ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。2.3.4阻斷試驗(yàn)將羊抗Eno參加50ng/mL的抗原溶液,使羊抗Eno終濃度分別為1、2、4和8g/mL,置37℃溫育1h后,檢測混合液中Eno的A值?？梢婋S抗體濃度增加,測得的EnoA值不斷下降,見圖2。當(dāng)參加的羊抗Eno濃度為8g/mL時(shí),阻斷率為95.46%。2.4培養(yǎng)上清Eno檢測結(jié)果2.4.1不同溫度下白色念珠菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結(jié)果37℃培養(yǎng)4h后,涂片可見白色念珠菌構(gòu)成假菌絲,培養(yǎng)24h,上清中Eno濃度為3.89ng/mL。由于1640完全培養(yǎng)基中含有20%小牛血清,因而25℃培養(yǎng)24h后,涂片可以看見假菌絲的構(gòu)成,但與同期的37℃培養(yǎng)物相比,假菌絲的比例較低,上清中Eno濃度為0.74ng/mL。25℃培養(yǎng)48h,上清中Eno濃度為3.05ng/mL,此時(shí)37℃培養(yǎng)上清中Eno濃度為7.77ng/mL。不同培養(yǎng)溫度下Eno濃度均隨時(shí)間延長而增加。在整個(gè)觀察期間,25℃培養(yǎng)液中白色念珠菌菌絲的生長弱于37℃培養(yǎng)液,培養(yǎng)上清中Eno含量始終低于37℃培養(yǎng)上清。見圖3。2.4.2不同真菌培養(yǎng)上清中Eno檢測結(jié)果涂片結(jié)果顯示,培養(yǎng)4h時(shí)白色念珠菌和熱帶念珠菌出現(xiàn)菌絲生長,培養(yǎng)48h近平滑念珠菌出現(xiàn)明顯的菌絲生長。37℃培養(yǎng)24h后,白色念珠菌培養(yǎng)上清中可檢出Eno,濃度為3.89ng/mL,隨培養(yǎng)時(shí)間延長上清中Eno逐步增加,培養(yǎng)至120h,Eno濃度達(dá)37.89ng/mL。近平滑念珠菌37℃培養(yǎng)48h,上清可檢測出少量Eno(1.26ng/mL),但隨后一直保持低水平,培養(yǎng)至120h,Eno濃度為2.98ng/mL。在整個(gè)培養(yǎng)經(jīng)過中,熱帶念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母培養(yǎng)上清內(nèi)未檢測出Eno。見圖4。3、討論基于抗原診斷的非培養(yǎng)方式方法如1,3--D葡聚糖(1,3--glucan,BG)、甘露聚糖的檢測可為IC診斷提供直接根據(jù),固然敏感性適中,但彌補(bǔ)了血培養(yǎng)的缺乏,近年來在臨床得到了廣泛的應(yīng)用。歐洲癌癥-侵襲性真菌感染治療研究協(xié)作組和美國國立變態(tài)反響和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)將BG納入侵襲性真菌感染臨床診斷(probable)和擬診(possible)的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。在BG檢測中有些容易造成假陽性的因素,如透析、輸注白蛋白注射液、靜脈導(dǎo)管置入、抗腫瘤藥物中的類似成分、手術(shù)紗布污染、某些細(xì)菌感染等,限制了BG在侵襲性念珠菌感染中的診斷作用,研究者致力于尋找新的用于IC診斷抗原標(biāo)志物。Walsh等和Mitsutake等報(bào)道在IC患者外周血中會出現(xiàn)Eno抗原血癥,Eno檢測IC的敏感性和特異性為71.8%~75%和96%~100%。他們以為Eno抗原檢測是對血培養(yǎng)方式方法的有益補(bǔ)充,假如和甘露聚糖、BG聯(lián)合檢測能夠提高IC檢測的準(zhǔn)確性。Mitsutake等用于檢測的多克隆抗體是采用白色念珠菌菌體純化Eno蛋白免疫家兔后獲得,不能區(qū)分不同念珠菌所致感染,檢測靈敏度為5ng/mL。Walsh等使用的檢測形式和本研究類似,也采用了單抗和多抗的檢測組合,Eno的檢出下限為0.5~1ng/mL,但未對不同念珠菌感染的特異性進(jìn)行評價(jià)。我們前期已成功建立雙抗體夾心ELISA定性檢測Eno,證實(shí)所采用的單抗和多抗組合能夠特異性辨別白色念珠菌增殖經(jīng)過中產(chǎn)生的天然抗原,除與近平滑念珠菌有微弱穿插反響外,與其他念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母無穿插反響。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Eno水平與白色念珠菌菌絲生長呈正相關(guān),檢測Eno水平能夠反映白色念珠菌侵襲性生長的發(fā)生,我們以為實(shí)現(xiàn)Eno的定量檢測有助于評估IC的發(fā)生和監(jiān)測治療效果。念珠菌抗原檢測遭到在血清中去除快,循環(huán)血中含量低的局限,新免疫技術(shù)和平臺的出現(xiàn),將為提高IC患者實(shí)驗(yàn)室診斷水平創(chuàng)造條件。免疫磁珠分離技術(shù)是將免疫學(xué)反響的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新興免疫學(xué)技術(shù),具有分離快速、簡單和靈敏的優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞分離、病原微生物學(xué)和免疫學(xué)檢測。本研究將白色念珠菌Eno單克隆抗體耦聯(lián)至磁性微球上,制備免疫磁珠,建立定量檢測Eno方式方法,其方式方法學(xué)性能指標(biāo)如精致細(xì)密度、特異性、線性范圍符合臨床實(shí)驗(yàn)要求,最低檢測下限與文獻(xiàn)報(bào)道一致。免疫磁珠法對常見真菌培養(yǎng)上清中Eno含量和白色念珠菌不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)上清中Eno含量的定量檢測結(jié)果,支持了我們前期研究的定性結(jié)果。免疫磁珠法檢測的特異性與ELISA法一致,均可特異辨別白色念珠菌Eno蛋白,與近平滑念珠菌有弱穿插反響性,提示該法有望用于特異診斷白色念珠菌引發(fā)的侵襲性念珠菌感染,為臨床正確選擇抗真菌藥物提供根據(jù)。免疫磁珠具有較大的比外表積,其結(jié)合效率類似于液相-液相反響,高于ELISA的固相-液相反響。利用免疫磁珠的磁響應(yīng)性,抗原抗