第十二三章 植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化

第十二章種質(zhì)保存第一節(jié)常溫保存第二節(jié)常低溫和低溫保存第三節(jié)超低溫保存種質(zhì)（germplasm）：是指親代通過生殖細(xì)胞或體細(xì)胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)資源：具有一定種質(zhì)或基因的生物類型，稱為（基因資源、基因庫、基因銀行）。包括品種、類型、近緣種和野生種的植株、種子、無性繁殖器宮、花粉甚至單個(gè)細(xì)胞，只要具有種質(zhì)并能繁殖的生物體，都能歸入種質(zhì)資源之內(nèi)。

種質(zhì)資源的重要性種質(zhì)資源是在漫長的歷史過程中,由自然演化和人工創(chuàng)造而形成的一種重要的自然資源。積累了由于自然和人工引起的極其豐富的遺傳變異,即蘊(yùn)藏著各種性狀的遺傳基因。人類用以選育新品種和發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ),也是進(jìn)行生物學(xué)研究的重要材料,是極其寶貴的自然財(cái)富。種質(zhì)保存(germplasmconservation)

：利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，有高的活力，能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。種質(zhì)保存的兩種方式：

原地保存:通過建立自然保護(hù)區(qū)和天然公園來實(shí)現(xiàn)

異地保存:通過植物園、種質(zhì)圃、種子庫以及離體保存來實(shí)現(xiàn)。

華南植物園西雙版納國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)建立的蘭科植物種質(zhì)資源保存苗圃

野生稻頻臨滅絕離體保存：將組織和細(xì)胞培養(yǎng)中的外植體或試管苗貯存在使其抑制生長、緩慢生長或無生長的條件下，達(dá)到長期保存的方法。優(yōu)點(diǎn)：解決一些無性繁殖作物種質(zhì)資源的低溫、長期保存問題，可有效避免資源的丟失；節(jié)省土地和勞動(dòng)力，保存方法簡單，花費(fèi)少且能在保存中脫毒；在需要時(shí)，可快速繁殖，利于國際國內(nèi)種質(zhì)交換。離體保存方法:

常溫保存（25±5℃）

低溫保存（0-8℃），

超低溫保存（-80--196℃）改變培養(yǎng)基無機(jī)鹽的濃度:1/4MS培養(yǎng)菠蘿苗，一年后仍有81％保持活力；增加培養(yǎng)基滲透壓：添加甘露醇、蔗糖，抑制外植體生長。添加植物激素：多效唑PP333等培養(yǎng)基條件的改變培養(yǎng)環(huán)境條件的改變降低培養(yǎng)環(huán)境的氧含量：保存材料上覆蓋一層礦物質(zhì)如石蠟、液態(tài)石油降低環(huán)境的氧分壓。冰凍保護(hù)劑滲透型抗凍劑：二甲亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油等作用特點(diǎn)：屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加而減弱水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。非滲透型抗凍劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等，作用特點(diǎn)：可溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，可在特定的溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用第十二章種質(zhì)保存第一節(jié)常溫保存第二節(jié)常低溫和低溫保存第三節(jié)超低溫保存第十章轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物基因改良植物轉(zhuǎn)基因生物制藥轉(zhuǎn)基因安全性轉(zhuǎn)基因植物是指利用生物或物理、化學(xué)等手段將外源基因?qū)胫参锸荏w系統(tǒng)中，使之在受體中得以表達(dá)，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù)體系。基因轉(zhuǎn)化的的基本步驟1轉(zhuǎn)基因植物

1.1受體葉盤原生質(zhì)體懸浮細(xì)胞愈傷組織胚狀體活體等等1.2轉(zhuǎn)基因方法直接轉(zhuǎn)化法:基因槍法載體介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法1.2.1直接轉(zhuǎn)化法

基因槍法**最早的基因槍（火藥式）由美國康乃爾大學(xué)Sanford等1987年設(shè)計(jì)制造?；驹?/p>

將外源DNA通過亞精胺和氯化鈣的沉積作用包被在金屬顆粒（金粉、鎢粉等）表面，此為微彈，將這種微彈懸液涂于載膜（尼龍、塑料等）上，以不同的驅(qū)動(dòng)力高速驅(qū)動(dòng)微彈載體，使攜帶DNA的微彈穿透植物細(xì)胞壁，直接進(jìn)入受體靶細(xì)胞。幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會(huì)形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由該菌細(xì)胞內(nèi)的野生型質(zhì)粒Ti（Tumor-inducing）介導(dǎo)的。1.2.2載體介導(dǎo)法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)

Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

T-DNA的染色體整合機(jī)制葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗分化出苗生根壯苗植物受體抗生素篩選其它方法植物病毒感染法花粉管通道法電穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法顯微注射法超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法多聚物介導(dǎo)法浸漬法電泳法碳化硅纖維介導(dǎo)法真空滲透法圓球體法等等1.3轉(zhuǎn)基因植物的鑒定遺傳表型特征篩選依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選核酸分子雜交分析免疫化學(xué)分析檢測PCR篩選法

抗生素抗性基因

顯色或發(fā)光報(bào)告基因

抗除草劑抗性基因3.1遺傳表型特征篩選

常用的報(bào)告基因β-葡萄糖酸苷酶基因（gus）

能催化特殊反應(yīng)，通過熒光、分光光度和組織化學(xué)方法對(duì)這些特殊反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

葉特異性表達(dá)葉肉特異性表達(dá)維管束特異表達(dá)莖特異表達(dá)GFP基因GFP綠色熒光蛋白是從一種生活在北太平洋寒冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選Southernblot篩選結(jié)果核酸分子雜交分析第十章轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物

基因改良植物轉(zhuǎn)基因生物制藥轉(zhuǎn)基因安全性2.基因改良植物生物體凍害干旱鹽害澇害熱害生物脅迫非生物脅迫雜草病害蟲害其他性狀品質(zhì)除草劑

轉(zhuǎn)基因在作物品種改良中的應(yīng)用

抗蟲抗病毒抗病抗非生物脅迫抗除草劑改良作物品種改變花的顏色和形狀轉(zhuǎn)基因植株作為生物反應(yīng)器（A）萎黃?。^所指）感染（B）外源基因抵抗TMV對(duì)煙草的感染。接種后11天癥狀（箭頭）抗病煙草抗病大豆野生型轉(zhuǎn)基因野生型轉(zhuǎn)基因具有除草劑抗性的大豆用0.1%草苷膦處理大豆葉片野生型轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因野生型野生型轉(zhuǎn)基因

抗除草劑占總轉(zhuǎn)基因植物種植面積的77％，其中主要為抗除草劑大豆。野生型和轉(zhuǎn)基因（AtNHX1）番茄用200mMNaCl處理11周未處理前處理后

抗逆-鹽害野生型轉(zhuǎn)基因野生型轉(zhuǎn)基因野生型油菜和轉(zhuǎn)基因（AtNHX1）油菜經(jīng)200mMNaCl處理10周

抗逆-鹽害野生型和轉(zhuǎn)AtP5CS基因的煙草經(jīng)過-2℃24h

處理野生型轉(zhuǎn)基因

抗逆-凍害凍害前凍害后凍害前凍害后

抗蟲抗蟲水稻美國最早研制得到抗蟲棉花，我國科學(xué)家將自己發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入棉花獲得抗棉鈴蟲的棉花株。激素合成相關(guān)基因增加轉(zhuǎn)基因楊樹的高度（十二周時(shí)期的苗）

品質(zhì)改良-林木轉(zhuǎn)基因楊樹細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化纖維長度細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞長度木質(zhì)部纖維數(shù)量野生型轉(zhuǎn)基因野生型轉(zhuǎn)基因表皮木髄部C4植物高光效基因提高水稻產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因?qū)φ?/p>

品質(zhì)改良-農(nóng)作物1994年能比普通西紅柿保鮮時(shí)間更長的轉(zhuǎn)基因西紅柿投放市場，1998年我國獲得轉(zhuǎn)基因耐儲(chǔ)藏番茄，延長為60天轉(zhuǎn)基因番木瓜

品質(zhì)改良-水果轉(zhuǎn)基因香蕉

品質(zhì)改良-花卉雙色茶花各色煙草花白色夏堇第十章轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物基因改良植物轉(zhuǎn)基因生物制藥轉(zhuǎn)基因安全性3轉(zhuǎn)基因植物生物制藥世界衛(wèi)生組織公布的危害人群健康最嚴(yán)重的48種疾病中，傳染病和寄生蟲病占40種，發(fā)病人數(shù)占病人總數(shù)的85％。全世界每年有1700萬人死于傳染病，其中大量是患可預(yù)防的傳染病的兒童。這些兒童大多數(shù)在發(fā)展中國家，患病的主要原因除了經(jīng)濟(jì)落后、環(huán)境惡劣和衛(wèi)生條件差外，另一個(gè)原因是對(duì)疫苗的制作和保存缺乏良好的條件。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗---可食（飼）性攜帶白喉抗原的蘿卜抗乙肝、霍亂和細(xì)菌性痢疾等傳染病的香蕉預(yù)防霍亂的苜蓿苗抗乙肝病的西紅柿預(yù)防其他一些疾病的馬鈴薯、甘藍(lán)、西紅柿

轉(zhuǎn)基因土豆防乙肝產(chǎn)生抗乙肝病毒抗體的轉(zhuǎn)基因西紅柿轉(zhuǎn)基因香蕉防乙肝轉(zhuǎn)基因植物抗體：動(dòng)物抗體基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的免疫性產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因煙草能夠產(chǎn)生狂犬病抗體植物易于生長，農(nóng)田管理成本相對(duì)低廉，操作技術(shù)要求也不高。植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗可以直接儲(chǔ)存在植物種子和果實(shí)中，無需冷藏系統(tǒng)進(jìn)行儲(chǔ)藏運(yùn)輸，易于長距離運(yùn)輸及推廣。植物具有完整的真核表達(dá)修飾系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的重組蛋白。藥物和疫苗在分子結(jié)構(gòu)和生物活性上與人體來源的蛋白質(zhì)相似。轉(zhuǎn)基因植物生物制藥的優(yōu)勢如下：全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的產(chǎn)業(yè)化1983年首例轉(zhuǎn)基因植物（煙草）問世1996年到2009年，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積達(dá)到6.9億公頃，10多年間增長67倍(大豆70%、玉米25%）；各國批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因植物:在1995有9種，1998已達(dá)90種。目前全球基因作物種植面積的前四名分別是美國、阿根廷、加拿大和中國。這四個(gè)國家種植了全世界99%的轉(zhuǎn)基因作物。目前，我國共批準(zhǔn)發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因作物安全證書，分別是耐儲(chǔ)存番茄、抗蟲棉花、改變花色矮牽牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米和抗蟲水稻。大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的只有抗蟲棉和抗病毒木瓜。進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、棉花、油菜和甜菜5種，其中轉(zhuǎn)基因大豆數(shù)量最多。2012年，我國進(jìn)口大豆數(shù)量達(dá)到5838萬噸，大多為轉(zhuǎn)基因大豆，作為食用油的加工原料。第十章轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物基因改良植物轉(zhuǎn)基因生物制藥轉(zhuǎn)基因安全性4轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題

轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全性轉(zhuǎn)基因食品安全性4.1轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全性---基因污染*基因漂流風(fēng)險(xiǎn)；*轉(zhuǎn)基因植物抗性基因漂移;*天敵受害;*種群失調(diào);4.2轉(zhuǎn)基因食品安全性國際上目前廣泛采用“實(shí)質(zhì)等同”原則:即以轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因食品比較的相對(duì)安全性，作為評(píng)價(jià)依據(jù)，只要轉(zhuǎn)基因食品與傳