第五章色譜法-1

第五章高效液相色譜法

（HPLC）主要內(nèi)容第一部分：液相色譜分離原理第二部分：液相色譜條件優(yōu)化第三部分：維護及常見問題第一部分：液相色譜分離原理正相液相色譜鍵合相色譜氫鍵力流出順序影響HPLC分離的反相條件主要內(nèi)容第一部分：液相色譜分離原理第二部分：液相色譜條件優(yōu)化第三部分：維護及常見問題分子量<2000Step1Step2TheUPLC–MS/MSsystemconsistedofanAcQuityTMultraperformanceliquidchromatographandaQuattroPremierMicromass?massspectrometer(Waters/Micromass,Milford,MA).AnAcQuityUPLCTMBEHC18column(1.7um,50mm×1mmi.d.)alsofromWaterswasusedfortheanalysis.Thecolumnwasmaintainedat30?C.ThestandardsandsampleextractswerechromatographedbyUPLCwithagradientmobilephaseconsistingof0.1%formicacidinwaterassolventAandacetonitrile(ACN)assolventB.Thegradientconditionofmobilephaseis:0min85%A,1.00min70%A,and2.50–4.00min85%A.Theflowrateis0.20ml/min.殘留硅羥基殘留的重金屬總結(jié)—分離度的改善液相色譜分析開發(fā)液相色譜分析方法分辨率是色譜分析中主要考慮的因素。在開發(fā)色譜方法時，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考慮。

1.靈敏度5.成本

2.載樣量6.容易使用

3.分析速度7.色譜柱壽命

4.溶劑消耗8.效率液相色譜分析方法的建立（1）分子量：在樣品預(yù)處理或GPC分析時有用；（2）選擇合適的液相色譜方法（正相、反相或其他）；（3）選擇合適的色譜柱；（4）溶解度：選擇流動相的條件；（5）官能團：有否離子化基團？保留特性如何？（6）樣品的基質(zhì)：考慮是否要前處理，如何前處理；（7）選擇合適的K’值的條件；（8）選擇良好的峰位（a值）；（9）選擇良好的色譜柱條件（N值）；（10）檢測特性：是否有紫外吸收？熒光？（11）用實測樣品解決出現(xiàn)的特殊問題；（12）證實方法的正確性。方法樣品特點/色譜柱何時應(yīng)用該方法反相HPLC流動相：水/有機溶劑色譜柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首選為能溶于水/有機混合物的中性或非離子化合物。離子對HPLC流動相：水/有機溶劑（一種緩沖物控制pＨ和離子對試劑）色譜柱：C18（ODS），C8，氰基離子或可電離化合物，尤其是堿性或陽離子化合物的良好選擇正相HPLC流動相：有機溶劑混合液色譜柱：氰基，二醇基，氨基，硅膠當反相或離子對HPLC無效時的第二個較好選擇；首選為不溶于水/有機混合液的親脂樣品，異構(gòu)體混合物和制備HPLC硅膠最好選擇液相色譜的方法主要液相色譜方法特性方法描述/色譜柱何時應(yīng)用該方法離子交換色譜法流動相：水相，另以緩沖物控制pH色譜柱：陽離子或陰離子交換分離無機離子混合物的首選（離子色譜法）；分離蛋白質(zhì)、核酸樣品及有關(guān)化合物的良好選擇體積排阻色譜法流動相：水相（GFC）或有機相（GPC）色譜柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅膠，孔徑大小支配分子量范圍分離大分子樣品，如蛋白質(zhì)和人造聚合物的良好首選，也可用于測量分子量的分布疏水作用色譜法流動相：鹽溶液色譜柱：類似于反相填料，但疏水性小得多用于分離蛋白質(zhì)選擇液相色譜的方法次要液相色譜方法特

性峰位的重排在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的tR，不會發(fā)生峰位重排。在反相色譜中，下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：（1）流動相中換了強溶劑種類；（2）pH值的改變；（3）柱填料的改變；（4）柱溫的改變；（5）流動相組成的改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）

分析方法的開發(fā)第一步干什么？想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法；查文獻，各種手冊，如藥典、農(nóng)藥手冊以及國家標準；向儀器制造商詢問。對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理，自己開發(fā)方法。充分了解自己的樣品

分析方法的開發(fā)分析時要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高？樣品的本底是否很復(fù)雜？有多少組分要分析？對分析的精確度、準確度等有多高要求？是否因是日常檢驗而要求方法容易使用？要分離的樣品量有多大？要分離的組分在樣品中的含量很高還是微量？是否需要保持生物活性？對分離產(chǎn)物純度的要求有多高？純度和活性的鑒定如何完成？

分析方法的開發(fā)一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對較高的流速使用盡可能純度高的標準品先用高強度的洗脫液調(diào)節(jié)k值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度請記住每次改變一個參數(shù)等濃度洗脫系統(tǒng)主要內(nèi)容第一部分：液相色譜分離原理第二部分：液相色譜條件優(yōu)化第三部分：維護及常見問題。日常使用需注意作業(yè)在硅膠柱上，用甲苯為流動相